Summary
我们描述了一种研究高植物的光合反应的新方法,包括使用PAM和光谱辐射计同时测量叶绿素荧光和叶反射率,以检测来自在阿拉伯的叶子面积相同。
Abstract
叶绿素荧光分析被广泛用于测量完整植物的光合行为,并产生了许多能有效测量光合作用的参数。叶反射率分析提供了生态和农业中的几个植被指数,包括光化学反射率指数(PRI),该指数可用作光合作用期间热能量耗散的指标,因为它与非光化学淬火(NPQ)。但是,由于 NPQ 是复合参数,因此需要验证 NPQ 以了解 PRI 参数的性质。为了获得评价PRI参数的生理证据,我们同时测量了桑索菲尔循环缺陷突变体(npq1)和野生型阿拉伯霉菌植物的叶绿素荧光和叶反射率。此外,qZ参数,可能反映xanthophyll周期,是从叶绿素荧光分析的结果中提取的,通过监测NPQ的松弛动力学关闭后。这些同步测量使用脉冲振幅调制(PAM)叶绿素荧光计和光谱辐射计进行。两个仪器的光纤探头彼此靠近,以检测来自同一叶片位置的信号。利用外部光源激活光合作用,从PAM仪器提供测量灯和饱和光。该实验系统使我们能够监测完整植物中光依赖性PRI,并发现PRI的轻依赖性变化在野生型和npq1突变体之间存在显著差异。此外,PRI 与 qZ 密切相关,这意味着 qZ 反映了 xanthophyll 周期。这些测量表明,同时测量叶片反射率和叶绿素荧光是参数评估的有效方法。
Introduction
叶反射率用于远程感应植被指数,反映植物1、2中的光合作用或特征。基于红外反射信号的标准化差植被指数(NDVI)是探测叶绿素相关特性的最广为人知的植被指数之一,在生态学和农业科学中作为树木或作物的环境反应指标3。在实地研究中,虽然许多参数(如叶绿素指数、水指数等)已经得到开发和使用,但很少详细核实这些参数是否直接(或间接)检测过使用突变体。
叶绿素荧光的脉冲振幅调制(PAM)分析是测量光合反应和光系统II(PSII)4中涉及的过程的有效方法。叶绿素荧光可以通过相机检测,并用于筛选光合作用突变体5。然而,对叶绿素荧光的相机检测需要复杂的方案,如暗处理或光饱和脉冲,这在实地研究中很难实现。
叶吸收的太阳能主要消耗光合反应。相比之下,吸收多余的光能会产生活性氧,从而对光合分子造成损害。多余的光能必须通过非光化学淬火(NPQ)机制6作为热量消散。光化学反射指数(PRI)反映叶片反射参数的光线相关变化,来自531和570nm(参考波长)7、8的窄带反射率。据报道,在叶绿素荧光分析9中,它与NPQ相关。但是,由于 NPQ 是一个复合参数,包括 xanthophyll 周期、状态传统和光抑制,因此需要详细验证以了解 PRI 参数的度量。我们专注于黄体素循环,一种热耗散系统,涉及黄藻素颜料的脱氧抗氧化(葡萄松素对安他拉桑辛和玉米黄素),以及NPQ的主要成分,因为PRI和这些的转换之间的相关性颜料在以前的研究中已经报道8。
许多光合作用相关的突变体在阿拉伯经体中被分离和鉴定。npq1突变体不积累玉米黄素,因为它携带一个突变在葡萄松素脱环酶(VDE),催化葡萄松素转化为玉米黄素10。为了确定PRI是否只检测桑索植物色素的变化,我们同时测量了NPq1和野生型同一叶区的PRI和叶绿素荧光,然后在暗松弛的不同时间尺度上解剖NPQ,以提取与xanthophyll相关的组分11。这些同步测量为植被指数的分配提供了宝贵的技术。此外,由于 PRI 与总初级生产率 (GPP) 相关,因此将 PRI 精确分配给一个组件的能力在生态学12中具有重要的应用价值。
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Protocol
1. 种植阿拉伯植物
- 浸泡阿拉伯突子沙利亚纳种子在微管中灭菌的去离子水中,在黑暗中4°C孵育2天。
- 使用微移液器将大约四个浸渍的冷处理种子放在土壤表面。分别在22°C和20°C下,用16小时光(120μmol光子m+2s+1)和8小时暗期在生长室中孵育种植的盆栽。
- 发芽后,通过稀释其他幼苗,每盆种植一株。准备至少五个罐子。在生长室中孵育植物4周。实验用三种植物。
- 使用最年轻的、完全打开的成熟叶进行光合作用测量。
2. 设置样品阶段、光合仪器和光源
注:对于此协议,使用自定义的示例阶段来固定叶子和检测探针(图1)。
- 将直径为 1 厘米的 1 厘米直径的钢板连接到定制样品台。此板的孔大小可以更改,以适应不同的叶子样品或植物物种。该舞台具有用于固定检测探头的剪辑和用于调整探头和叶样本之间的距离的调节器。
- 准备用于测量叶绿素荧光和叶反射率的薄纤维探针。这些细光纤探头将紧密定位,以便测量来自同一叶位置的信号。
注:PAM叶绿素荧光计和光谱辐射计分别用于对叶绿素荧光和叶反射的信号检测。两种仪器均使用直径分别为 1 mm 和 2 mm 的细纤维探头。 - 将这两个探头紧紧地安装起来,用塑料胶带包裹。
- 使用同轴透镜支架将贴片探头夹在样品台上(参见图 1),并将其垂直放置在叶片表面。
注:光谱辐射计中光纤电缆的视野为 ±± 25°。在此方法中,光纤探头尖端与叶面之间的距离小于1厘米。因此,测量叶面积几乎与纤维的面积相同。 - 将由玻璃纤维制成的双叉光导连接到卤素光源,并从两个方向以大约 45° 的角度照射样品级。
注:卤素灯接近自然阳光的波长分布,用作诱导光合作用的活性光。卤素光源采用内置冷过滤器进行改造,可去除近红外的长波长,防止叶片表面温度升高(= = 400 至 800 nm)。 - 调整光源,使光线均匀地照亮样品级,而不会投射阴影。
3. 同时测量叶反射率和叶绿素荧光
注: 所有步骤都在暗室中执行,以避免检测到活动光以外的光线。在实际测量之前,应关闭弱绿色光(例如,绿色玻璃灯)。
- 测量叶片样品与样品级探头之间的距离。
- 在黑暗中,在样品阶段的叶架上放置一个测试叶。将叶子压在舞台上的钢板上(图1中为黑色正方形)。
- 打开 PAM,用测量灯照射叶子样品。使用 PAM 控制软件确认叶绿素荧强度的值(参见材料表)。
- 移动调节器,使荧光强度测量约 100。测量探头和叶之间的距离。固定调节器,并记录调节器上的距离值。
- 关闭测量灯。取出测试叶。
-
测量活动光的辐照强度
注:为了观察光相关光合物行为,使用不同强度的射焦光照射叶样品。- 在放置样品叶的位置设置光量子计。
- 从卤素光源照射光并测量强度。
- 确定光源表盘的哪些位置会产生 30、60、120、240 和 480 μmol 光子 m+2 s±1的强度。
注:阿拉伯植物生长在120μmol光子m+2s+1以下;因此,选择活动光的辐照强度来提供一系列小强度和大强度。 - 在表盘上标记每个辐照强度。
- 测量反射标准。
注: 需要反射标准来计算每个辐照强度的叶片反射率。- 将白色板作为反射标准放置在叶片样品的位置。
- 打开光谱辐射计。反射信号由光谱辐射计控制软件显示。此时,由于没有辐照光,因此没有光谱数据。
- 打开卤素灯,用 480 μmol 光子 m+2 s+1照射,这是本次测试中最高的辐照强度。
- 调整辐射计的检测强度以避免饱和。
- 在 30、60、120、240 和 480 μmol 光子 m+2 s±1的照明下,以 1 nm 的间隔记录 450–850 nm 之间的光谱反射率。
注:每次光谱测量时都会校正和减去基线电信号(暗电流)。
4. 同时测量叶反射率和叶绿素荧光,并计算光合参数
- 在叶片样品位置设置植物。
- 将阿拉伯植物从生长室转移到与生长室相同的温度和湿度的受控暗室。
- 在22°C的黑暗中孵育植物1小时,以消散PSII反应中心的电子,并放松非光化学淬火。
- 将暗变的整个工厂放在样品级下的实验室插孔上(图1)。
- 将样品叶固定到叶架上,使叶表面与检测探头垂直。
- PSII最大量子收率的测量。
- 打开 PAM 并开始记录曲线。此值称为0。
- 打开测量灯,等待大约 30 s 的曲线响应。此值称为F0。
- 从 PAM 中给出 4000 μmol 光子 m=2 s±1的饱和脉冲,为 0.8 s。
- 在荧光强度增加时获得曲线中尖峰的最高值。此值称为FM。
- 使用以下方程计算在黑暗中PSII的最大量子收率(FV/FM)。
FV/FM = (FM = F0) / FM
- 在稳定状态下测量光合行为。
- 在录制FM后,打开卤素灯作为外部光源,并打开测量灯(请参见 4.2.4)。首先,用最弱的光(30 μmol光子m+2s+1)照射叶片样品。
- 同时打开光谱辐射计以监测叶片反射率。
- 等待20分钟或更长时间,使光合反应在光照条件下达到稳定状态。稳态的荧光强度称为Fs。
- 在照明期间,使用活动灯以 1 分钟为间隔提供饱和脉冲。在脉冲光下实现的最大荧光值称为FM+。
- 打开活动灯后 20 分钟记录FM+ 的数据。
- 通过优化集成时间平均 10 次扫描,采用暗电流减法,获取叶反射率数据。
- 在稳定状态下计算光合参数。
- 计算PSII光化学(*PSII)的量子产量,可以使用以下方程,在活动光下用饱和脉冲进行辐照来估计。
•PSI = (FM+- FS) / FM| - 从PSII反应中心估计线性电子通量(LEF),如下所示。
LEF = 活动光的辐照强度 = •PSII = 0.5 = 0.84 - 使用以下等式计算可表示散热的 NPQ。
NPQ = (FM - FM+) / FM|
注:光能主要消耗光合作用反应。然而,当植物吸收的光能多于光合作用所消耗的能量时,热耗散的机制被诱导以避免多余的能量。 - 使用在相同光照条件下用辐射计采集的光谱数据,计算叶片反射率如下。
反射比 = R叶/ R标准 - 从 531 nm 和 570 nm 计算 PRI,如下所示。这两个波长是从反射率中提取的。
PRI = (R531+R570) / (R531+R570)
注: R 是反射。
- 计算PSII光化学(*PSII)的量子产量,可以使用以下方程,在活动光下用饱和脉冲进行辐照来估计。
- 非光化学淬火松弛动力学的测量。
- 获取F 和叶反射后关闭活动灯。
- 关闭灯后,通过 PAM 监测叶绿素荧光 10 分钟。
- 在黑暗放松期间,每隔 1 分钟提供饱和脉冲。暗下饱和脉冲产生的最大荧光值称为F M+。 在一次测试中获得十个FM+。
- 关闭活动灯后 2 分钟和 10 分钟保存FM+的数据。
- 将活动光设置为下一个辐照度强度,60 μ 摩尔光子 m+2 s±1。
- 以1分钟的间隔对脉冲饱和光重复20分钟的光线自适应和10分钟的暗松。在 120、240 和 480 μ 摩尔光子 m+2 s±1下使用辐照重复所有步骤和测量。
- 从松弛动力学中计算非光化学淬火的参数。
注:通过关闭光源13,NPQ的感光感应被放宽。通过调整松弛时间刻度,可以对每个 NPQ 函数进行分馏。- 在 2 分钟暗度自适应后,使用 F M+估计 qE(能量依赖性淬火)分数。
qE = (FM2m= = FM+) / FM|
注:qE分数在1⁄2分钟内迅速反转。此部分主要包括 PsbS 原生和部分黄体素转换,这依赖于光诱导的 -pH 跨胸腺膜13。两者都在梯度分解时是可逆的。 - 在 10 分钟暗度自适应后,使用FM+ 计算 qZ(依从玉米质的淬火)分数。
qZ = (FM10m= =FM+) / FM|
注:在活动光关闭后约10分钟的NPQ松弛动力学反映了一个xanthophyll周期14。大多数的黄土素转换在大约 10 分钟 (qZ) 的较长时间尺度下反转,因为转换需要 VDE(葡萄松素去环氧酶)酶反应。通过胸腺膜上的μpH分解,分数也得到缓解。 - 计算 qI(光抑制状态),如下所示。
qI = (FM=FM10m*) / FM|
注: NPQ馏分中恢复最慢被认为是PSII的光损伤(表示D1周转)。光抑制状态(qI)的这一部分,在10分钟内不恢复。
- 在 2 分钟暗度自适应后,使用 F M+估计 qE(能量依赖性淬火)分数。
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Representative Results
图1显示了用于同时测量叶绿素荧光和叶反射率的实验设置的示意图。PAM 和光谱辐射计的光纤探头垂直地设置在定制样品台上叶架的叶面上,使用卤素灯从左右两个方向进行活动光照射,无需铸造任何阴影。使用独立系统的软件检测到 PAM 和叶片反射信号。该实验系统用于比较阿拉伯兰多普西野生型(科尔)和npq1突变体(缺乏玉米黄素)植物(图2)。从叶片反射率计算的μPRI是根据PAM估计的PSII的与光相关的线性电子流绘制的(图2A)。据报道,PRI不仅受到黄体素的影响,而且还受到类胡萝卜素16的影响。PRI 通过在每个光强下减去 PRI 以最低光强度 (+PRI) 进行校正,以仅观察与光相关的 PRI 变化11。结果表明,在野生型植物中,μPRI与LEF呈负相关,但在npq1中则不相关。我们还从NPQ的暗松弛动力学中剖析了qZ,它代表xhophyll循环,并在图2B中将其绘制为_PRI。结果表明,qZ与μPRI(r2 = -0.87,p值<0.001)密切相关,这意味着PRI反映了xanthophyll周期。
图1:同时测量叶绿素荧光和叶反射率的实验系统的原理图。详细信息在"协议"部分中介绍。植物盆由实验室千斤顶(实心双头箭头)定位。卤素灯用于照射各种光强度以激活光合作用(薄实箭)。使用脉冲振幅调制系统(PAM)检测到荧光信号;红线表示来自 PAM 叶绿素荧光计的光纤探针。在光照下,光谱辐射计探测到叶片反射;蓝线表示来自光谱辐射计的光纤探头。测量灯(虚线箭头)和短饱和光(厚实箭头)也由PAM叶绿素荧光计提供。饱和灯在光线适应20分钟时以1分钟间隔脉冲,暗松10分钟。请点击此处查看这个数字的较大版本。
图2:野生哥伦比亚(黑色方块)和npq1突变(红方块)阿拉伯植物的光合参数变化。*PRI(每个辐照强度下PRI减去PRI,最低强度为30μmol光子m-2 s-1)与线性电子通量(LEF)的速率(A)和(B)在暗松10分钟后的qZ。活动光的辐照强度为30、60、120、240和480μmol光子m-2 s-1。数据点和误差条表示 n =3的 SD 表示表示 = SD。B 中的线是适用于所有数据点的回归曲线。请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
在这项研究中,我们获得了额外的证据,表明PRI通过同时测量叶绿素荧光和叶反射率来代表桑索菲尔颜料。
具有类似阳光波长的卤素光被改编为活动光源,以激活光合作用。我们最初使用白色 LED 光源来避免叶表面的热损伤,但这会产生缓慢的暗松弛动力学和异常高的 qI(光抑制淬火),可能通过光损伤 PSII。因此,我们使用内置冷过滤器对卤素灯进行了改造,以减少热量产生。此光源在暗恢复或 qI 中未引起任何异常。
该方法中最重要的变量是叶、光源和检测探头之间的位置关系。我们测试了从不同对角角的角度测量叶绿素荧光和叶反射率,从正上方到叶子的光线照射。但是,检测信号的强度因角度而异。为了避免这种变异性,探头垂直固定在叶样本上方(图1)。光源使用分叉纤维提供,从左右两侧照射叶面,产生均匀的辐照光(图1)。
叶反射学研究主要用于生态学,以确定野外环境中的各种植物植被指数,例如植物物种、营养条件或季节变化之间的差异。然而,很少有研究在阿拉伯植物和烟草等植物模型植物中测试和验证这些植被指数,它们的突变体可能拥有丰富的遗传信息和组学分析数据。验证和开发这些植物的植被指数可以确定创新植被指数中代表的新型光合参数,这将有助于生态学学科。
本研究以NPQ的暗松动动力学为研究重点,以验证其xanthophyll循环行为。目前正在开发叶绿素荧光分析的新光合作用相关参数(例如,对环氧体池(qL)的氧化还原状态的估计或PSI17、18周围循环电子流的活性).在相关阿拉伯植物突变体中同时测量叶绿素荧光和叶反射,将推动光合作用分子机制的研究,并有助于在野外研究中利用这一知识。最近的一项研究报告说,植物中的叶绿素荧光可以从叶光谱反射中远程感应。该参数称为太阳诱导叶绿素荧光(SIF),使用弗劳恩霍夫线测量,在太阳光12、19下,由氧气吸收的暗线。如果利用这些技术重新分配目前开发的植被指数,则无需使用饱和脉冲或暗适应等特殊处理方法,就可以远程评估植物的光合反应。
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Disclosures
提交人没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们感谢东北大学(Koki Hikosaka博士)鼓励讨论、协助工作空间和实验工具。这项工作部分得到了KAKENHI[赠款编号18K05592,18J40098]和奈藤基金会的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Halogen light source | OptoSigma | SHLA-150 | |
| Light quantum meter | LI-COR | LI-1000 | |
| PAM chlorophyll fluorometer | Walz | JUNIOR-PAM | |
| PAM controliing software | Walz | WinControl-3.27 | |
| Reflectance standard | Labsphere, Inc. | SRT-99-050 | |
| Spectral radiometer | ADS Inc. | Field Spec3 | |
| Spectral radiometer controlling software | ADS Inc. | RS3 |
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