Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Medicine

אולטרה סאונד-מוגבר למבוגרים בידוד פיברוהפיצוץ

doi: 10.3791/59858 Published: July 29, 2019

Summary

אנו מציגים פרוטוקול כדי לבודד את הפיברוטים הראשוניים העיקריים באופן קל, מהיר ואמין, performable על ידי למתחילים (למשל, סטודנטים). הליך זה משלב את העיכול ברקמה אנזימטית ועצבנות מכנית עם גלי אולטרה סאונד כדי להשיג פיברוהטיות ראשונית. ניתן להתאים את הפרוטוקול בקלות לדרישות נסיוניות ספציפיות (לדוגמה, רקמת אדם).

Abstract

הראשי פיברותקיעות למבוגרים הפכו כלי חשוב ללמוד פיברוזיס, פיברוהפיצוץ אינטראקציות ודלקת בכל רקמות הגוף. כיוון שהפיברופיצוצים העיקריים אינם יכולים להפריד ללא הגבלת הזמן בשל בידול או הזדקנות ביולוגית, יש להקים תרבויות חדשות באופן סדיר. עם זאת, ישנם מספר מכשולים כדי להתגבר במהלך התהליכים של פיתוח פרוטוקול בידוד אמין ובידוד העיקרי פיברוהפיצוץ עצמו: דרגת הקושי של השיטה (במיוחד למתחילים), הסיכון לזיהום חיידקי, ה זמן נדרש עד הפיברותקיעות הראשונית ניתן להשתמש עבור ניסויים, ואת איכות התא הבאים הכדאיות. במחקר זה, פרוטוקול מהיר, אמין וקל ללמידה כדי לבודד ולהתרבות למבוגרים בלבד ותרבות מתוך לב העכבר, ריאות, כבד וכליות המשלב עיכול אנזימטי ועצבנות אולטרה סאונד מסופק.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

פיברותקיעות הם שטוחים, תאים בצורת ציר עם תהליכים stellate מרובים ומעין הרשתית הרחב מחוספס רשתית פלזמית1,2. ממוצע פיברוהפיצוץ אמצעים 30-100 יקרומטר ויש לו תוחלת חיים של 57 ± 3 ימים1,3. משך המחזור הממוצע של התאים של האדם נע בין 16-48 h בהתאם לתנאי התרבות4. יש עדויות לכך שהיכולת המאובדית והאיכות הפונקציונלית של הגידולים הראשוניים העיקריים מתפקדים לרעה עם גיל התורם, ומציעה שתורמים צעירים יותר (בעלי חיים או חולים) צריכים להיות מועדפים אם אפשרי5,6 .

פיברותקיעות מהווים סוג תא דומיננטי של רוב ממחטות הגוף. למרות הנוכחות שלהם בכל מקום, הזיהוי המולקולרי של הפיברופיצוצים הוא עדיין אתגר7. פיברותקיעות להגר לפתח רקמות ואיברים ממקורות שונים במהלך פיתוח עובריים8. מסיבה זו, יש שפע של מסמן חלבונים שניתן למצוא בתוך פיברובפיצוצים בעוד החלבונים סמן ייחודי, אשר נמצאים בכל אוכלוסיית הפיברומה ובלעדית לפיברותקיעות, עדיין חסרים. לפיכך, דפוסי ביטוי של מספר סמנים מזוהים משמשים בדרך כלל כדי לזהות פיברומופיצוצים. בין הסמנים המוכרים ביותר הם vimentin, חלבון הקרקע האדם פיברוההדף (hfsp), discoidin התחום קולטן 2 (DDR2) ו אלפא שריר חלק שרירים אקטין (αSMA).

פיברותקיעות הם מטריצת החילוץ העיקרית (ECM)-הפקת סוג תא. ובכך, הפיברובטות שומרות על ארכיטקטורת רקמה מסודרת ומספקות תמיכה מכנית לתאים שכנים1. האיזון בין סינתזה של ECM לבין השפלה הוא תהליך מוסדר היטב. משמרות לכיוון הסינתזה לסמן את תחילתה של התצהיר ECM מוגזמת אשר, אם לא הסתיים, מוביל פיברוזיס. פיברוזיס מתווכת על ידי מיופיברופיצוצים, אשר מקורם פיברופיצוצים המופעלות שעברו מולקולרית שינויים פנופי. אחד סימן ההיכר של מיופיברופיצוצים הוא הפרשה משופרת של ECM ו ציטוקינים ואת הביטוי של מסודר מסודרים αSMA מיקרופילטרים9.

פיברותקיעות הראשי כבר בזרקור של מחקר האחרונות התמקדות פיברוזיס, דלקת רקמות ופיברוהפיצוץ-תאים לסרטן-cell10,11. עם זאת, כדי ללמוד ביעילות תכונות פיברובלסט בריאות ומחלות, יש צורך לבודד פיברוהפיצוצים הראשוניים למבוגרים על בסיס קבוע. ישנן מספר שיטות זמין כדי לבודד פיברופיצוצים12,13,14. שלוש השיטות המרכזיות של בידוד פיברובלסט הן התרחבות מנתחי רקמות12, עיכול הרקמה האנזימטית15, ופרזיה אנזימטית של איברים חלולים9,13,16. היתרון של הצמיחה החוצה הוא תהליך בידוד עדין ללא השפלה תא אנזימטי. מצד שני, תרבויות מחוץ לצמיחה דורשים בדרך כלל תקופות התרבות ממושך עד התאים יכולים לשמש ניסויים. מהירות העיכול הנפוצה היא מהירה אך נושאת סיכון לזיהום עם סוגי תאים אחרים (למשל, תאי האנדותל) או חיידקים בתהליך העצבנות, הנחוץ לפזר מכנית את הרקמה. יתרה מזאת, שיטות אלה מורכבות לעתים קרובות ודורשות זמן ומיומנות ללמוד.

בנוגע לחשיבות הגידולים הראשוניים במחקר, עדיין יש צורך למטב את הגישות הקיימות של בידוד התא במונחים של זריזות, פשטות ואמינות. כאן, שיטת בידוד אנזימטית מבוססת על-קולי ומספקת תאים באיכות גבוהה מסופק.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

הפרוטוקול הבא עוקב אחר ההנחיות לטיפול בבעלי חיים מוסדיים של Technische אוניברסיטת דרזדן, גרמניה (מספר קובץ: T 2014/4), כמו גם הנחיות לטיפול בעלי חיים מקובלים (FELASA)17. איור 1 מדמיין את תהליך הבידוד של התא.

1. הכנת הכיוונון, החומר והמדיה

  1. להכין את התרבות התא בינונית, פתרון PBS, קולגן המניה מניות פתרון (מהווים 50 mg של הקולגן ליאופאז משתלב 12 מ ל של מים באולטרטהורים סטרילי), ו 0.25% טריפסין פתרון.
  2. לחמם את המדיום, הPBS ואת הטריפסין הפתרון ל 37 ° c.
  3. מחממים את אמבטיית המים האולטרה-סאונד עד 37 ° c.
  4. חיטוי מלקחיים, מרית פלדת אל-חלד, אזמל (2x אזמל לכל איבר) ו 2 כוסות זכוכית עם 70% אתנול ומניחים חומרים אלה תחת המכסה של תרבות התא.
  5. מלא גביע אחד עם 70% אתנול והשני עם מים סטריליים או פתרון PBS. כוסות אלה נדרשים לחיטוי ולשטוף את המכשיר לאחר כל תהלוכה עוגב.
  6. הניחו צינורות פלסטיק מעוקרים של 15 מ"ל המכילים PBS קר על קרח רטוב. מספר הצינורות תלוי במספר האברים שבהם ברצונך לבודד את הפיברופיצוצים.

2. להסרת העכבר והסרת איברים

  1. לבש שני זוגות של כפפות אחד מעל השני, כך הזוג הראשון ניתן להסיר ברגע החיה כבר גזור.
    הערה: הליך זה מונע מחיידקים מפרוות החיה ומעורם להתפשט על האברים.
  2. המתת החסד של העכבר (למשל, פריקה צוואר הרחם) ו להצמיד את הגווייה עם מחטים לכל איבר בקערה.
  3. לחטא את גופת העכבר באמצעות 70% תרסיס אתנול. ודא שהפרווה ספוגה באתנול כך שהשיער לא יערבולת.
  4. השתמשו במלקחיים כירורגיים. ובמספריים מספריים חותכים את העור לצד הקו האמצעי מנקודת החתך הראשוני לצוואר (3-4 ס מ) ומוסיפים קיצוץ הקלה בגפיים.
    זהירות: לא לנקב את שכבת השרירים בשלב זה כדי למנוע זיהום חיידקי!
  5. הצמד את העור למשטח קצף פוליסטירן כדי לקבל גישה אופטימלית לשרירים המכסים את חלל הבטן.
  6. לחטא את שרירי הבטן פעמיים באמצעות 70% אתנול. תן לאתנול להתייבש לפני שימשיך לשלב הבא.
  7. . הסר את זוג הכפפות הראשון השתמש בערכה חדשה וסטרילית. של מלקחיים ומספריים
  8. פתח את חלל הבטן ואת החזה על ידי הסרת שכבת השרירים עם מספריים כירורגיים כדי להסיר בעדינות את אברי הבחירה. לכן, להחזיק את האיבר בעדינות עם מלקחיים כירורגית (לא לנקב את האיבר, להשתמש בלחץ מינימלי) ולחתוך את כלי הדם לספק ליד נקודת הכניסה באיבר עם מספריים.
  9. הכניסו את האיברים לצינורות. הסטריליים המכילים את הקור סגרו את הצינורות בחוזקה. הניחו את החצוצרות על הקרח הרטוב עד שתמשיכו בשלב 3.1.

3. מיצוי רקמות, העיכול והפקת התאים

  1. להעביר את הצינורות תחת המכסה של תרבות התא סטרילי.
    התראה: ללבוש זוג טרי של כפפות לחטא את הצינורות עם 70% אתנול לפני העברתו מתחת למכסה המנוע!
  2. להוציא את האיבר מתוך 15 מ"ל שפופרת באמצעות מלקחיים סטרילי. מניחים את האיבר על חצי אחד של צלחת פטרי 6 ס"מ ולשטוף את האיבר בקצרה עם PBS להסיר דם עודף. העבר את האיבר למחצית השנייה של צלחת פטרי, והסר את העודף PBS.
  3. מטפחת את הרקמה באמצעות שני מנתחים סטריליים. שברי הרקמה הנותרים לא צריך להיות גדול מ 1-2 מ"מ.
  4. העבירו את הרקמה הקצוצה לתוך צינור חדש של 15 מ ל סטרילי באמצעות המרית הסטרילית והוסיפו 2 מ ל 0.25% טריפסין פתרון. הציבו את הצינור בחממה לתרבות התא ב-37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
  5. מערבולת הצינור בעדינות (בסביבות 1400/דקות) עבור 10 s.
  6. עצור את תגובת טריפסין תחת המכסה של תרבות התא על ידי הוספת 4 מ"ל FCS המכילים תרבות התא בינונית (מדיום הנשר המתוקן של החברה (DMEM), למשל.
  7. הוסף 250 μL של מיזוג קולגן הפתרון לכל צינור המכיל לב או רקמת ריאות 100 μL עבור כליה או כבד, בהתאמה.
  8. מניחים את הצינורות לתוך אמבט מים אולטרה סאונד (37 ° c) ולהפעיל את sonicator אולטראסוניות עבור 10 דקות.
    הערה: אמבט מים אולטרה סאונד המשמש בפרוטוקול זה יש תדר הפעלה של 35 kHz כוח מקסימאלי של 320 W.
  9. מערבולת את החצוצרות בעדינות (בסביבות 1400/דקות) עבור 10 s.
  10. מניחים את הצינורות שוב לתוך אמבט מים אולטרה סאונד עבור 10 דקות.
  11. מערבולת בעדינות (בסביבות 1400/דקות) עבור 10 s.
  12. לחטא את הצינורות עם 70% אתנול ולהעביר אותם תחת מכסה התרבות התא סטרילי.
  13. סנן את הפתרון עם רשת מ40 יקרומטר לתוך צינור חדש מעוקר 15 mL.
  14. צנטריפוגה את הצינור ב 500 x g עבור 5 דקות.
  15. הסירו את הסופרנטאנט והשהה מחדש. את הגלולה בגודל 1 מ ל של בינוני טרי
  16. העבר את התאים לתוך כלי מתאים של תרבות התא (למשל, 6-באר צלחת) ולמקם את הכלי לתוך חממה תרבות התא לילה ב 37 ° צ' ו 5% CO2.
  17. למחרת, להסיר את המדיום, לשטוף 3 פעמים עם PBS, ולאחר מכן להוסיף בינוני טרי (הכרך הוסיף תלוי בכלי התרבות התא של הבחירה, 2 מ ל לכל טוב של 6-היטב צלחת וכו ').
  18. . לשנות את המדיום כל יום
    הערה: ניתן לפצל את הפיברופיצוצים לאחר שהגיעו למפגש אופטי של 90% (בדרך כלל לאחר 5-7 ימים).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

את היכולת של פרוטוקול זה כדי לבודד פיברוהפיצוצים מבוגרים מרקמת murine מוצק הוכח. ניתן להשיג את הפיברופיצוצים קיימא שניתן להשתמש בהם עבור ניסויים שלאחר מכן כגון immunofluorescence כתמים או הפצת ניסויים (איור 2D-F, איור 5א).

בוגרים פיברותקיעות הם תאים שטוחים בצורת ציר עם תהליכים סלולריים מרובים בדרך כלל לצמוח monolayers12,18. התוצאות המתקבלות משקפות את הסימנים הללו מורפולוגיים ומצביעים על הבדלים מורפולוגיים ברורים באוכלוסיות מאיברים שונים (איור 2). פיברוהליות הכליות היו קטנות במיוחד וגדלו בצפיפויות גבוהות יותר מאשר הלב, הריאות או הכבד פיברותקיעות (איור 2).

הפאנל העליון של איור 3 מתאר את התהליך של התבגרות והתפשטות התא באמצעות הדוגמה של הפיברוסטיות לב לאחר הבידוד. התאים הציגו שיעורי התפשטות גבוהים המגיעים למפגש אופטי של > 90% לאחר 6 ± 1 ימים. ברמה זו של המפגש בפיברוהפיצוצים להפסיק להתרבות18 והתאים ניתן לפצל, באמצעות 0.25% טריפסין, והועברו לצלוחיות תרבות התא גדול יותר עבור התרבות או הניסויים הבאים.

תחת תנאי תרבות התא הבזליים, תרבויות פיברובלסט מורכבות מפיברותקיעות ושיעור קטן יותר של מיופיברופיצוצים19,20. ישנם מספר סמנים מקובלים לזיהוי פיברופיצוצים. הביטוי DDR2 ו-vimentin הם סמנים נפוצים פיברובסט והביטוי של מיקרופילαSMA מאורגן מציין בידול מיופיברוסט7,9. דמות מייצגת של מיופיברוסט הבדיל עם מיקרופילαSMA ייחודי ותמונות סקירה הנציגה עבור שפע αSMA פילמנט בלב, כליות, כבד וריאות מוצגים באיור 4. בעוד כ 20-30% של תאים מבודדים ומתורבתים מאוחר יותר הביע מסודר מסודר αSMA מיקרופילדים (המציין בידול מיופיברופיצוץ), כל התאים (≈ 99%) היו חיוביים עבור vimentin ו-DDR2 (איור 3, הפאנל התחתון).

Figure 1
איור 1 . מבט כולל על הליך הבידוד של הפיברובלסט. לאחר אברי העניין הוסרו מן העכבר, הם מתחת למכסה של תרבות התא באמצעות מנתחים סטריליים. לאחר מכן, את הרקמה הקצוצה מועבר 0.25% טריפסין פתרון עבור 5 דקות. לאחר העיכול הראשון, התמיסה מיזוג הקולגן מתווסף והצינורות מועברים לאמבטיה אולטרה סאונד עבור 20 דקות ב 37 ° c. לאחר סינון וצנטריפוגה, את הגלולה התא ניתן להעביר לתוך צלחת תרבות התא מתאים. לאחר 8 שעות לפחות כדי לצרף, התרבויות נשטפו שלוש פעמים עם PBS כדי להסיר אריתרופוציטים ופסולת. לבסוף, בינוני טרי (DMEM, 15% FCS, 1% פניצילין/סטרפטומיצין) מתווסף והתאים יכולים להיות מתורבתים. תמונות האמנות הרפואית החכמה Servier שימשו כדי ליצור את הדמות (https://creativecommons.org/licenses/by/3.0/). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2 . לאחר 7 ימים. של תרבות ראשית A) פיברוהטרותקיעות. ב) פיברוהכדורים בריאות. ג) פיברוהליות. ד) פיברוהכדורים בכבד. התאים היו מתורבתים ב-DMEM (15% FCS, 1% פניצילין/סטרפטומיצין (PS)) ב 37 ° צ' ו 5% CO2. הגדלה של 10x ו-5.6 x זום אופטי שימשו להשגת תמונות אלה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3 . זיהוי של פיברופיצוצים בתרבות. A-C) החזקה והצמיחה של פיברוסותקיעות לב במשך 4 ימים. לאחר כביסה ושינוי בינוני, הפיברופיצוצים המצורפים מפתחים את צורתם הייחודית ומתרבים. התאים היו מתורבתים ב-DMEM (15% FCS, 1% PS). D-F) Immunofluorescence מכתים תמונות של הפיברוכדורים העיקריים לאחר 7 ימים של תרבות עבור סמנים αSMA הפיצוץ (D), DDR2 (E) ו Vimentin (נ). הגרעינים היו מוכתמים ב-DAPI (כחול). הנוגדנים הראשוניים (סיגמא-אולדריץ ') היו מדולל 1:200 בתמיסת BSA (αSMA: A5228; DDR2: HPA070112; Vimentin: V5255). אלקסה-Fluor 488. שימש כנוגדן משני פסי הסרגל שווים לאורכים שצוינו לעיל. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4 . מייצגים את התמונות האימונוציטוכימיקלים לשפע αSMA מיקרופילמנט. A) מוצג מיופיברוסט טיפוסי (הגדלה: 20x). B – E) נציג αSMA סקירה תמונות עבור הלב (ב), כליה (C), כבד (ד) וריאה (E) (הגדלה: 10x). העיגולים הלבנים מצביעים על תאים מייצגים שנחשבו ליופיברופיצוצים. הגרעינים היו מוכתמים ב-DAPI (כחול). הנוגדן העיקרי היה מדולל 1:200 בתמיסה 1% BSA (αSMA: A5228). אלקסה-Fluor 488. שימש כנוגדן משני פסי הסרגל שווים לאורכים שצוינו לעיל. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5 . שיעורי התפשטות של מורטין. והתפתחות ביולוגית A) שיעור התפשטות של מורסופיצוצים שנקבעו לאחר 7 ו -14 ימי תרבות. תאים נקצרו ונספרו עם תא Buerker בנקודות זמן בהתאמה. התוצאות מייצגות את ספירת התאים ב-1 mL של מדיום. ב) הזדקנות נקבעת על ידי נוכחות של β-גלטוסידאז (ירוק ויטראז). תאי הסנקו מסומנים בעיגולים לבנים. סרגל קנה המידה שווה 50 μm. התוצאות מוצגות כממוצע ± SEM. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

בהשוואה לקווי התאים המושווים פיברוהפיצוץ, הפיברופיצוצים העיקריים מציעים מספר יתרונות. הם יכולים להיות מבודדים עלות בצורה יעילה באיכות גבוהה וכמות. יתר על כן, תרבויות העיקרי להציע את האפשרות ללמוד תאים מאנשים מרובים, אשר מגביר את האמינות של התוצאות המתקבלות ומקטין את הסבירות של רק לימוד חפצי תרבות התא. הדור המתמשך של התרבויות הראשיות החדשות מונע שינויים גנטיים אשר מתרחשים בדרך כלל לאחר passaging21. בנוסף, הזדקנות הסלולר22,23 או גדל בידול מיופיברופיצוץ להתרחש לעתים קרובות יותר בתרבויות במעברים גבוהים20. במעברים נמוכים (2-3), ספירת הפיצוץ הבסיס מיופיברוזה הייתה כ 20-30% (הנתונים לא הוצגו) ורק 2.89% מהתאים נחשבו לסנאויום בהתבסס על ביטוי β-גלטוסידאז (איור 5ב). מסיבה זו, מומלץ לעבור את התרבויות למצב המקסימלי 5 פעמים ולהחליף אותן להלן. הדבר מבטיח תוצאות אמינות ושכפול לאורך כל הניסויים. צמיחה והפצה אופטימלית בפיברוהגל הושגו עם מדיום תרבות התאים המכיל 15% FCS במקום 10%. זה מבטיח תשואה חזקה הפיצוץ ויכולת התאים הטובה לאחר המעבר הראשון.

פרוטוקול זה משלים טכניקות קיימות במונחים של מהירות ומידת קושי. טכניקות outgrowth דורשים בין 10-21 ימים, בהתאם מינים ורקמות, עד מספיק כמויות של פיברותקיעות ניתן לקצור12,24. לנגדורף-perfusion מצד שני הוא מהיר (< 5 h) אבל דורש יותר מיומנות והדרכה ידניות. בהשוואה לשיטות הגידול החיצוני12,24 או בידוד פיברוהפיצוץ מן הסופרנטנט של לאנגדורף-perfusion16, פרוטוקול זה מציע במיוחד למתחילים את ההזדמנות לעבוד עם תאים ראשוניים לאחר קצר מאוד תקופת הכשרה (2-3) ללא דרישת מיומנות מכנית גבוהה או מאמץ טכני. זיהום עם תאים שאינם פיברוהפיצוץ (למשל, תאי האנדותל) היה זניח משום שפיברותקיעות תרבותית במהירות לגדול יתר סוגי תאים בתרבויות בשל שיעורי ההתפשטות הגבוהה שלהם25. בנוסף, פרוטוקול זה מעניק הוראות ברורות המסייעות להימנע מזיהום חיידקי, שהיא בעיה אחת גדולה לעבוד עם תאים murine הראשי. כאן, שני צעדים קריטיים כדי למנוע זיהום זוהו. . הראשון הוא הסרת איברים חיידקים פרווה מכרסם ניתן להעביר בקלות לאיברים אם הכפפות כלים כירורגי לא שונו לאחר הסרת הפרווה והעור. הצעד הקריטי השני הוא תהליך הבידוד עצמו. את התאים יש להסיר מכנית מנישה הרקמה שלהם. בהקשר של לאנגדורף-פרזיה זה מתגשם על ידי זרם רציף של נוזל. טכניקות אחרות משתמשות בפסי ערבוב מגנטיים או בשיטות טלטול. במיוחד, החלפת ברים מגנטיים ערבוב על ידי גלי אולטראסוניות מפחית את הסיכון של זיהום חיידקי על ידי הימנעות מגע פיזי בין מערבב את הרקמה ליפוסט. יתרון נוסף של אמבט מים אולטרה סאונד הוא התפלגות החום אפילו של הצינורות, ובכך לספק טמפרטורות עבודה אופטימלית עבור אנזימים.

לסיכום, פרוטוקול זה מספק שיטה מהירה, אמינה ושכפול כדי לבודד את הפיברופיצוצים העיקריים כי הוא אידיאלי הן מתקדמות והן חוקרים בשלב מוקדם. שיטה זו היא תוספת שימושית לספקטרום הקיים של טכניקות שיכולות לתרום להבנה טובה יותר של התפקוד הפיברוביסט בבריאות ובמחלות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

אין קונפליקטים של עניין להכריז.

Acknowledgments

אנו מודים לגב רומי קמפה וגב ' נט אופץ ' לתמיכה טכנית מקצועית. אנו מודים גם למר ביוארן בינניורג. על כך שהוא תומך עבודה זו נתמכת על ידי מענקים מ-a) Förderkreis Dresdner Herz-קראסלאוף-e.V., ב) "הבליטבליםתוכניות לעלמה", הפקולטה לרפואה קרל גוסטב קאר דרזדן ו-c) אחרים Kröner-פורשיסקולאג (EKFK) הפקולטה לרפואה קרל גוסטב . כרמלה דרסדן . אנו אסירי תודה על המימון והתמיכה

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% Trypsin-EDTA Sigma-Aldrich, St. Louis, USA T4049-100ML
Antibiotics Gibco-Life Technologies, Carlsbad, USA Gibco LS15140148  Penicillin/ Streptomycin (10,000 U/mL)
Cell culture hood Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA 51023608 HeraSafe KSP15
Cell culture incubator Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA 50049176 BBD 6220
Cell culture plates Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA depends on vessel 6-, 12-, 24-wells Nunclon surface
Cell culture suction VACUUBRAND GMBH + CO KG, Wertheim, Germany 20727400 BVC professional suction
Cell strainer (mesh) Corning, Tewksbury, USA 431750 40 µm Nylon
Centrifuge Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA 75007213 Megafuge 8R
Cordless pipetting controller Hirschmann, Eberstadt, Germany 9907200 Pipetus
Disposable pipette tips Sigma-Aldrich, St. Louis, USA depends on volume SafeSeal tips for pipettes (10 µL, 20 µL, 100 µL, 200 µL, 1000 µL)
Disposable plastic pipettes Sigma-Aldrich, St. Louis, USA depends on volume 5 mL, 10 mL, 25 mL, 50 mL
Disposable sterile scalpel Myco Medical, Cary, USA n.a. Techno cut
Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA 41965-062 High glucose
Eppendorf tubes Eppendorf, Hamburg, Germany  depends on volume 50 µL, 500 µL, 1.500µL, 2.000 µL
Fetal calf serum (FCS) Sigma-Aldrich, St. Louis, USA F2442-50ML
Collagenase blend Sigma-Aldrich, St. Louis, USA 5401020001 Liberase TL Research Grade
Petri dish 6 cm Sigma-Aldrich, St. Louis, USA P5481-500EA
Phosphate Buffered Saline (PBS) Sigma-Aldrich, St. Louis, USA D8537-500ML 500 mL
Senescence detection kit Abcam, Cambridge, UK ab65351
Shaker/ Vortex IKA, Staufen im Breisgau, Germany n.a. MS2 Minishaker (subsequent model: Ident-Nr.: 0020016017)
Sterile plastic tubes Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA Falcon 352095 BD Falcon tubes (15 mL, 50 mL)
Ultrasonic water bath BANDELIN electronic GmbH & Co. KG, Berlin, Germany 312 Sonorex RK100H
Surgical scissors (atraumatic) Aesculap AG, Tuttlingen, Germany NR 82
Surgical scissors  Aesculap AG, Tuttlingen, Germany eq 1060.09
Surgical forceps Aesculap AG, Tuttlingen, Germany BD577

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Baum, J., Duffy, H. S. Fibroblasts and myofibroblasts: what are we talking about. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 57, (4), 376-379 (2011).
  2. Tallquist, M. D., Molkentin, J. D. Redefining the identity of cardiac fibroblasts. Nature Reviews. Cardiology. 14, (8), 484-491 (2017).
  3. Weissman-Shomer, P., Fry, M. Chick embryo fibroblasts senscence in vitro: pattern of cell division and life span as a function of cell density. Mechanisms of Ageing and Development. 4, (2), 159-166 (1975).
  4. Angello, J. C. Replicative potential and the duration of the cell cycle in human fibroblasts: coordinate stimulation by epidermal growth factor. Mechanisms of Ageing and Development. 62, (1), 1-12 (1992).
  5. Serra, V., von Zglinicki, T. Human fibroblasts in vitro senesce with a donor-specific telomere length. FEBS Letters. 516, (1), 71-74 (2002).
  6. Mateu, R., et al. Functional differences between neonatal and adult fibroblasts and keratinocytes: Donor age affects epithelial-mesenchymal crosstalk in vitro. International Journal of Molecular Medicine. 38, (4), 1063-1074 (2016).
  7. Ivey, M. J., Tallquist, M. D. Defining the Cardiac Fibroblast. Circulation Journal: Official Journal of the Japanese Circulation Society. 80, (11), 2269-2276 (2016).
  8. Kanisicak, O., et al. Genetic lineage tracing defines myofibroblast origin and function in the injured heart. Nature Communications. 7, 12260 (2016).
  9. Kuenzel, S. R., et al. Hypoxia-induced epigenetic silencing of polo-like kinase 2 promotes fibrosis in atrial fibrillation. bioRxiv. 445098 (2018).
  10. Van Linthout, S., Miteva, K., Tschöpe, C. Crosstalk between fibroblasts and inflammatory cells. Cardiovascular Research. 102, (2), 258-269 (2014).
  11. Kalluri, R. The biology and function of fibroblasts in cancer. Nature Reviews Cancer. 16, (9), 582-598 (2016).
  12. Poulet, C., Künzel, S., Büttner, E., Lindner, D., Westermann, D., Ravens, U. Altered physiological functions and ion currents in atrial fibroblasts from patients with chronic atrial fibrillation. Physiological Reports. 4, (2), (2016).
  13. Gündüz, D., Hamm, C. W., Aslam, M. Simultaneous Isolation of High Quality Cardiomyocytes, Endothelial Cells, and Fibroblasts from an Adult Rat Heart. Journal of Visualized Experiments. (123), e55601 (2017).
  14. Weldrick, J. J., Abdul-Ghani, M., Megeney, L. A., Burgon, P. G. A rapid and efficient method for the isolation of postnatal murine cardiac myocyte and fibroblast cells. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 96, (5), 535-539 (2018).
  15. Wang, H., Van Blitterswijk, C. A., Bertrand-De Haas, M., Schuurman, A. H., Lamme, E. N. Improved enzymatic isolation of fibroblasts for the creation of autologous skin substitutes. In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 40, (8-9), 268-277 (2004).
  16. El-Armouche, A., et al. Phosphatase inhibitor-1-deficient mice are protected from catecholamine-induced arrhythmias and myocardial hypertrophy. Cardiovascular Research. 80, (3), 396-406 (2008).
  17. Guillen, J. FELASA Guidelines and Recommendations. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 51, (3), 311-321 (2012).
  18. Seluanov, A., Vaidya, A., Gorbunova, V. Establishing primary adult fibroblast cultures from rodents. Journal of Visualized Experiments. (44), 2033 (2010).
  19. Masur, S. K., Dewal, H. S., Dinh, T. T., Erenburg, I., Petridou, S. Myofibroblasts differentiate from fibroblasts when plated at low density. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93, (9), 4219-4223 (1996).
  20. Rohr, S. Cardiac fibroblasts in cell culture systems: myofibroblasts all along. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 57, (4), 389-399 (2011).
  21. Cell lines: Valuable tools or useless artifacts. PubMed - NCBI. Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22553484 (2019).
  22. Coppé, J. P., et al. Senescence-associated secretory phenotypes reveal cell-nonautonomous functions of oncogenic RAS and the p53 tumor suppressor. PLoS biology. 6, (12), 2853-2868 (2008).
  23. Childs, B. G., Durik, M., Baker, D. J., van Deursen, J. M. Cellular senescence in aging and age-related disease: from mechanisms to therapy. Nature Medicine. 21, (12), 1424-1435 (2015).
  24. Singh, M., Sharma, A. K. Outgrowth of fibroblast cells from goat skin explants in three different culture media and the establishment of cell lines. In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 47, (2), 83-88 (2011).
  25. Linge, C., Green, M. R., Brooks, R. F. A method for removal of fibroblasts from human tissue culture systems. Experimental Cell Research. 185, (2), 519-528 (1989).
אולטרה סאונד-מוגבר למבוגרים בידוד פיברוהפיצוץ
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Künzel, S. R., Schaeffer, C., Sekeres, K., Mehnert, C. S., Schacht Wall, S. M., Newe, M., Kämmerer, S., El-Armouche, A. Ultrasonic-augmented Primary Adult Fibroblast Isolation. J. Vis. Exp. (149), e59858, doi:10.3791/59858 (2019).More

Künzel, S. R., Schaeffer, C., Sekeres, K., Mehnert, C. S., Schacht Wall, S. M., Newe, M., Kämmerer, S., El-Armouche, A. Ultrasonic-augmented Primary Adult Fibroblast Isolation. J. Vis. Exp. (149), e59858, doi:10.3791/59858 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter