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Medicine

超音波増強原発性成人線維芽細胞分離

doi: 10.3791/59858 Published: July 29, 2019

Summary

我々は、初心者(例えば、学生)が実行可能な、簡単で迅速かつ信頼性の高い方法で原発性成人線維芽細胞を分離するためのプロトコルを提示する。この手順は、酵素組織の消化と機械的撹拌を超音波と組み合わせて、一次線維芽細胞を得ます。プロトコルは、特定の実験要件(例えば、ヒト組織)に容易に適合させることができる。

Abstract

原発性成人線維芽細胞は、すべての体組織における線維症、線維芽細胞相互作用および炎症を研究するための重要なツールとなっている。一次線維芽細胞は筋線維芽細胞分化または老化誘導のために無期限に分裂することができないため、新しい培養物を定期的に確立する必要があります。しかし、信頼性の高い分離プロトコルと一次線維芽細胞分離自体を開発する過程で克服すべきいくつかの障害があります:方法の難易度(特に初心者向け)、細菌汚染のリスク、一次線維芽細胞が実験に使用されるまでに必要な時間、およびその後の細胞品質と生存率。本研究では、酵素消化と超音波攪拌を組み合わせた、マウス心臓、肺、肝臓および腎臓から原発性成人線維芽細胞を分離および培養するための、迅速で信頼性が高く、学習しやすいプロトコルが提供される。

Introduction

線維芽細胞は、複数のステラプロセスと広範な大まかな小平性網膜1、2を持つ平らな、紡錘形の細胞である。平均線維芽細胞は30 - 100 μmを測定し、57 ±3日1、3の寿命を有する。ヒト線維芽細胞の平均細胞周期持続時間は、培養条件4に応じて16〜48時間の範囲である。培養された原発性線維芽細胞の複製能力と機能的品質がドナー年齢と否定的に相関するという証拠があり、可能であれば若いドナー(動物または患者)が好ましいことを示唆している5、6.

線維芽細胞は、ほとんどの哺乳類の体組織の主要な細胞型を構成する。彼らのユビキタスな存在にもかかわらず、線維芽細胞の分子同定はまだ挑戦7である。線維芽細胞は、胚発生時に異なるソースから組織や臓器を開発するために移行します 8.このため、線維芽細胞に見られるマーカータンパク質は多数存在しますが、すべての線維芽細胞集団に存在し、線維芽細胞に排他的なユニークなマーカータンパク質がまだ欠落しています。したがって、いくつかの認識されたマーカーの発現パターンは、通常、線維芽細胞を同定するために使用される。最も認識されたマーカーの中には、ビメンチン、ヒト線維芽細胞表面タンパク質(hFSP)、ディスコイジンドメイン受容体2(DDR2)およびα平滑筋アクチン(αSMA)がある。

線維芽細胞は、主要な細胞外マトリックス(ECM)産生細胞型である。それにより、線維芽細胞は整然とした組織構造を維持し、隣接する細胞1に機械的支持を提供する。ECM合成と分解のバランスは、よく規制されたプロセスです。合成に向かうシフトは、過度のECM沈着の始まりをマークし、終了しない場合は線維化を引き起します。線維症は、分子および異型的な変化を受けている活性化線維芽細胞に由来する筋線維芽細胞によって媒介される。筋線維芽細胞の1つの特徴は、ECMおよびサイトカインの分泌を増強し、整然と配置されたαSMAマイクロフィラメント9の発現である。

一次線維芽細胞は、線維症、組織炎症および線維芽細胞癌細胞相互作用10、11に焦点を当てた最近の研究のスポットライトを浴びている。しかしながら、健康および疾患における線維芽細胞特性を効果的に研究するためには、生存可能な原発性成人線維芽細胞を定期的に単離する必要がある。線維芽細胞12、13、14を分離するために利用可能ないくつかの方法があります。線維芽細胞単離の3つの主要な方法は、組織チャンク12、酵素組織消化15、および中空器官9、13、16の酵素灌流からの成長である。成長の利点は、酵素細胞の分解のない穏やかな単離プロセスである。一方、成長培養は通常、細胞が実験に使用されるまで長期間培養期間を必要とします。一般的な酵素消化は速いが、組織を機械的に溶解するために必要な攪拌過程における他の細胞タイプ(例えば、内皮細胞)または細菌との汚染のリスクを負う。さらに、これらの方法は、多くの場合、精巧であり、学ぶために時間とスキルを必要とします。

研究における一次線維芽細胞の重要性に関しては、迅速性、簡易性、信頼性の面で既存の細胞分離アプローチを最適化する必要があります。ここでは、高品質の細胞を提供する新規な超音波系酵素線維芽細胞分離法が提供される。

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Protocol

以下のプロトコルは、ドイツのテクニッシュ大学ドレスデン(ファイル番号:T 2014/4)および国際的に受け入れられている動物ケアガイドライン(FELASA)17の制度的な動物ケアガイドラインに従っています。図 1は、セルの分離プロセスを視覚化します。

1. セットアップ、マテリアル、メディアの準備

  1. 細胞培養培地、PBS溶液、コラゲナーゼブレンドストック溶液(無菌超純水の12mLで凍結乾燥コラゲナーゼブレンドの50mgを再構成)、および0.25%トリプシン溶液を調出す。
  2. 培地、PBS及びトリプシン溶液を37°Cに温める。
  3. 超音波水浴を37°Cに予熱します。
  4. 鉗子、ステンレス鋼のへら、メス(器官あたり2xメス)および70%のエタノールが付いている2つのガラスビーカーを消毒し、細胞培養フードの下にこれらの材料を置く。
  5. 1つのビーカーに70%のエタノールを入れ、もう一方を滅菌水またはPBS溶液で満たします。これらのビーカーは、各臓器の行列の後に器具を消毒し、洗浄するために必要とされます。
  6. 湿った氷の上に冷たいPBSを含む無菌の15 mLプラスチック管を置く。チューブの数は、線維芽細胞を分離したい器官の数によって異なります。

2. マウスの解剖と臓器の除去

  1. 2組の手袋をもう一方の上に着用し、動物が解剖されるとすぐに最初のペアを取り除くことができます。
    注:この手順は、動物の毛皮や皮膚からの細菌が器官の上に広がるのを防ぎます。
  2. マウスを安楽死させ(例えば、頚部脱臼)、ポリスチレンパッドにすべての手足に針で死体をピン留めます。
  3. 70%エタノールスプレーを使用してマウスの死骸を消毒します。毛が渦巻かないように、毛皮がエタノールに浸されていることを確認してください。
  4. 外科鉗子と外傷性はさみを使用して泌尿生殖器管の真上に毛皮を切る。最初の切開の点から首(3-4センチメートル)に中間線と一緒に皮膚をカットし、手足にレリーフカットを追加します。
    注意:細菌汚染を避けるために、このステップで筋肉層を穿当しないでください!
  5. 腹腔を覆う筋肉に最適なアクセスを持つために、ポリスチレンフォームパッドに皮膚をピン留めします。
  6. 70%エタノールを使用して腹部筋を2回消毒する。次のステップに進む前にエタノールを乾燥させてください。
  7. 最初の手袋を取り外します。鉗子とはさみの新しい、生殖不能のセットを使用してください。
  8. 外科的はさみで筋肉層を切開して腹腔と胸郭を開き、選択した器官を穏やかに取り除きます。したがって、外科鉗子でオルガンを穏やかに保持し(臓器を貫通せず、最小限の圧力を使用する)、はさみで器官のエントリポイント付近の供給血管を切断します。
  9. 冷たいPBSを含む無菌管に器官を入れる。チューブをしっかりと閉じます。ステップ3.1に進むまで、濡れ氷の上にチューブを置きます。

3. 組織ミンチ、消化、細胞抽出

  1. 無菌細胞培養フードの下にチューブを移します。
    注意:手袋の新鮮なペアを着用し、フードの下にそれらを転送する前に、70%エタノールでチューブを消毒!
  2. 滅菌鉗子を使用して15 mLチューブから器官を取り出します。滅菌6cmペトリ皿の半分に器官を置き、余分な血液を除去するためにPBSで短時間臓器を洗浄します。ペトリ皿の後半にオルガンを転送し、余分なPBSを削除します。
  3. 2つの滅菌メスを使用して組織をミンチします。残りの組織断片は、1 - 2ミリメートルより大きくすべきではありません。
  4. 無菌へらを使用して新しい無菌15 mLチューブにミンチティッシュを移し、0.25%トリプシン溶液の2 mLを追加します。チューブを37°Cの細胞培養インキュベーターに5分間入れます。
  5. チューブを10sで穏やかに渦(約1400/分)。
  6. 4 mL FCS含有細胞培地(ダルベッコの修飾イーグル培地(DMEM)など)を添加して細胞培養フード下でのトリプシン反応を停止する。
  7. 心臓または肺組織を含む各チューブに250 μLのコラゲナーゼブレンド溶液を加え、腎臓または肝臓にそれぞれ100μLを加える。
  8. チューブを超音波水浴(37°C)に入れ、超音波超音波装置を10分間活性化します。
    注:このプロトコルで使用される超音波水浴は、35 kHzの動作周波数と320 Wの最大電力を持っています。
  9. チューブを10sで穏やかに渦(約1400/分)。
  10. チューブを再び超音波水浴に10分間入れます。
  11. 渦は10sのために穏やかに(約1400/分)。
  12. 70%のエタノールでチューブを消毒し、滅菌細胞培養フードの下でそれらを転送します。
  13. 40 μm メッシュで溶液を新しい無菌 15 mL チューブにフィルター処理します。
  14. チューブを500 x gで5分間遠心分離します。
  15. 上清を取り出し、新鮮な培地の1 mLでペレットを再中断します。
  16. 細胞を適切な細胞培養容器(例えば、6ウェルプレート)に移し、37°Cおよび5%CO2で一晩細胞培養インキュベーターに容器を入れます。
  17. 翌日、培地を取り出し、PBSで3回洗浄し、次に新鮮な培地を加える(添加した容積は、選択した細胞培養容器に依存し、6ウェルプレートのウェル当たり2mLなど)。
  18. 1 日おきにメディアを変更します。
    注:線維芽細胞は、90%の光学合流に達した後(通常5〜7日後)に分割することができます。

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Representative Results

固体マウス組織から成体線維芽細胞を分離するこのプロトコルの能力が実証された。免疫蛍光染色や増殖実験などの後続の実験に用いることができる生細胞芽細胞が得られた(図2D-F、図5A)。

成体線維芽細胞は、通常単層12、18で成長する複数の細胞プロセスを持つ平らな紡錘形細胞である。得られた結果は、これらの形態学的特徴を反映し、異なる器官からの線維芽細胞集団における明確な形態学的差を示す(図2)。腎線維芽細胞は特に小さく、心臓、肺または肝線維芽細胞よりも高密度で成長した(図2)。

図3の上部パネルは、単離後の心臓線維芽細胞の例を用いた細胞の成熟および増殖の過程を示す。細胞は、6±1日後に>90%の光合流に達する高い増殖率を示した。このレベルの合流線維芽細胞は18を増殖させ、細胞を0.25%トリプシンを使用して分割し、その後の培養または実験のためにより大きな細胞培養フラスコに移すことができる。

基底細胞培養条件下では、線維芽細胞培養物は線維芽細胞と筋線維芽細胞19、20のより小さい割合からなる。線維芽細胞を識別するためにいくつかの受け入れられたマーカーがあります。DDR2およびビメンチン発現は、一般的な線維芽細胞マーカーであり、組織化されたαSMAマイクロフィラメントの発現は、筋線維芽細胞分化7、9を示す。特徴的なαSMAマイクロフィラメントを用いて分化した筋線維芽細胞の代表的な画像と、心臓、腎臓、肝臓および肺におけるαSMAフィラメントの豊富さに関する代表的な概観画像を図4に示す。単離された後に培養された細胞の約20~30%だけが、整然と整合したαSMAマイクロフィラメント(筋線維芽細胞分化を示す)を発現するが、すべての細胞(≥99%)。ビメンチンおよびDDR2に対して陽性であった(図3、下パネル)。

Figure 1
図 1.線維芽細胞分離手順の概要。目的の器官がマウスから取り除かれた後、彼らは無菌のメスを使用して細胞培養フードの下にミンチされます。続いて、ミンチ組織を0.25%トリプシン溶液に5分間移す。最初の消化後、コラゲナーゼブレンド溶液を添加し、チューブを37°Cで20分間超音波浴槽に移す。濾過および遠心分離の後、細胞ペレットは、適切な細胞培養皿に移すことができる。少なくとも8時間を付着させた後、培養物をPBSで3回洗浄し、赤血球および破片を除去する。最後に、新鮮な培地(DMEM、15%FCS、1%ペニシリン/ストレプトマイシン)を添加し、細胞を培養することができる。サービエスマート医療技術の画像は、フィギュアを作成するために使用されています(https://creativecommons.org/licenses/by/3.0/)。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 2
図 2.一次培養の7日後に固形器から単離された一次マウス線維芽細胞。A)心臓線維芽細胞。B)肺線維芽細胞。C)腎線維芽細胞。D)肝線維芽細胞。細胞を37°Cおよび5%CO2でDMEM(15%FCS、1%ペニシリン/ストレプトマイシン(PS))で培養した。10倍の倍率と5.6倍の光学カメラズームを使用して画像を取得しました。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 3
図 3.培養中の線維芽細胞の同定A - C)心臓線維芽細胞の付着および成長を4日間。洗浄および中程度の変化の後、付属の線維芽細胞は、その独特の形状を開発し、増殖する。細胞をDMEM(15%FCS、1%PS)で培養した。D - F)線維芽細胞マーカーαSMA(D)、DDR2(E)およびビメンチン(F)に対する培養7日後の一次線維芽細胞の免疫蛍光染色画像。核をDAPI(青色)で染色した。一次抗体(シグマ・アルドリッヒ)を1%BSA溶液中で1:200希釈した(αSMA:A5228;DDR2: HPA070112;ビメンチン:V5255)。アレクサフルオール488は二次抗体として用いた。スケール バーは、上記の長さと等しくなります。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 4
図 4.αSMAマイクロフィラメントの豊富な代表的な免疫細胞化学画像。A)典型的な筋線維芽細胞が表示される(倍率:20倍)。B – E)心臓(B)、腎臓(C)、肝臓(D)および肺(E)(倍率:10倍)の代表的なαSMA概要画像。白い円は、筋線維芽細胞と考えられていた代表的な細胞を示す。核をDAPI(青色)で染色した。一次抗体を1%BSA溶液中で1:200希釈した(αSMA:A5228)。アレクサフルオール488は二次抗体として用いた。スケール バーは、上記の長さと等しくなります。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 5
図 5.マウス線維芽細胞およびインビトロ老化発達の増殖率。A)培養7日目及び14日後に決定されたマウス線維芽細胞の増殖速度。細胞を収穫し、それぞれの時点でバーカー室で数えた。結果は、培地の1mLにおける細胞数を表す。B)老化はβガラクトーシダーゼ(染色緑)の存在によって決定される。老化細胞は白い円で示される。スケールバーは50 μmに等しくなります。

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Discussion

不死線維芽細胞株と比較して、一次線維芽細胞はいくつかの利点を提供する。それらは高品質および量で費用を効果的に隔離することができる。さらに、一次培養は、複数の個体から細胞を研究する可能性を提供し、得られた結果の信頼性を高め、単に細胞培養アーティファクトを研究する可能性を減少させる。新しい一次培養の連続的な生成は、一般的に繰り返し通過後に発生する遺伝的変化を防ぎます21.さらに、細胞老化22、23または増加した筋線維芽細胞分化は、高い通路20における培養においてより頻繁に起こる。低い通過路(2-3)では、基底筋線維芽細胞数は約20〜30%(図示せず)であり、β-ガラクトーシダーゼ発現に基づいて老化と考えられていたのはわずか2.89%であった(図5B)。このため、最大5回まで培養物を通過し、以下に置き換えることをお勧めします。これにより、実験全体を通じて信頼性が高く再現可能な結果が保証されます。最適な線維芽細胞増殖および増殖は、10%の代わりに15%FCSを含む細胞培養培地で得られた。これにより、最初の通過後に堅牢な線維芽細胞収率と良好な細胞生存率が確保された。

このプロトコルは、速度と難易度の面で既存の技術を補完します。成長技術は、種および組織に応じて、10〜21日の間に必要とし、十分な量の線維芽細胞を収穫することができるまで12、24。一方、ランゲンドルフ灌流は速い(<5 h)が、より多くの手動スキルとトレーニングを必要とします。ランゲンドルフ灌流16の上清からの成長方法12、24または線維芽細胞分離と比較して、このプロトコルは、特に初心者に非常に短い後に一次細胞で作業する機会を提供します高い機械的な技術や技術的な努力の要件なしでトレーニング期間(2 - 3分離)。非線維芽細胞(例えば、内皮細胞)による汚染は、培養線維芽細胞が高い増殖率25に起因する培養中の他の細胞型を急速に過剰に増殖させるため無視可能であった。さらに、このプロトコルは、一次マウス細胞で働く1つの主要な問題である細菌汚染を避けるのに役立つ明確な指示を与えます。ここでは、汚染を避けるために2つの重要なステップを特定した。1つ目は臓器摘出です。げっ歯類の毛皮細菌は、毛皮や皮膚を取り除く後に手袋や手術器具を変更しない場合、容易に臓器に移すことができます。2 番目の重要な手順は、分離プロセス自体です。細胞は、組織ニッチから機械的に除去する必要があります。ランゲンドルフ灌流の文脈では、これは液体の連続電流によって実現されます。他の技術は、磁気攪拌棒や振盪方法を使用しています。特に、超音波による磁気撹拌バーの置換は、攪拌機と組織リサートとの物理的な接触を避けることによって細菌汚染のリスクを低減する。超音波水浴の付加的な利点は、それによって酵素のための最適な働く温度を提供する管への暖かさの均等な配分である。

結論として、このプロトコルは、高度な研究者と初期段階の研究者の両方に最適な一次線維芽細胞を分離するための迅速で信頼性の高い複製可能な方法を提供します。この方法は、健康および疾患における線維芽細胞機能のより良い理解に貢献できる技術の既存のスペクトルに有用な追加である。

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Disclosures

宣言する利益相反はありません。

Acknowledgments

ロミー・ケンペさんとアネット・オピッツ夫人の技術サポートに感謝します。また、ビョルン・ビンニューエルグ氏のITサポートにも感謝します。この研究は、フェルダークライス・ドレスラー・ヘルツ=クライスラウフ・テージe.V.、b)「ハビリテス・フェルダー・プログラム・フュール・フラウエン」、カール・グスタフ・カルス・ドレスデン医学部、その他クレーナー・フォルシュングスコレッグ(EKFK)の助成金によって支えられました。カス・ドレスデン私たちは、資金と支援に感謝しています。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% Trypsin-EDTA Sigma-Aldrich, St. Louis, USA T4049-100ML
Antibiotics Gibco-Life Technologies, Carlsbad, USA Gibco LS15140148  Penicillin/ Streptomycin (10,000 U/mL)
Cell culture hood Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA 51023608 HeraSafe KSP15
Cell culture incubator Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA 50049176 BBD 6220
Cell culture plates Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA depends on vessel 6-, 12-, 24-wells Nunclon surface
Cell culture suction VACUUBRAND GMBH + CO KG, Wertheim, Germany 20727400 BVC professional suction
Cell strainer (mesh) Corning, Tewksbury, USA 431750 40 µm Nylon
Centrifuge Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA 75007213 Megafuge 8R
Cordless pipetting controller Hirschmann, Eberstadt, Germany 9907200 Pipetus
Disposable pipette tips Sigma-Aldrich, St. Louis, USA depends on volume SafeSeal tips for pipettes (10 µL, 20 µL, 100 µL, 200 µL, 1000 µL)
Disposable plastic pipettes Sigma-Aldrich, St. Louis, USA depends on volume 5 mL, 10 mL, 25 mL, 50 mL
Disposable sterile scalpel Myco Medical, Cary, USA n.a. Techno cut
Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA 41965-062 High glucose
Eppendorf tubes Eppendorf, Hamburg, Germany  depends on volume 50 µL, 500 µL, 1.500µL, 2.000 µL
Fetal calf serum (FCS) Sigma-Aldrich, St. Louis, USA F2442-50ML
Collagenase blend Sigma-Aldrich, St. Louis, USA 5401020001 Liberase TL Research Grade
Petri dish 6 cm Sigma-Aldrich, St. Louis, USA P5481-500EA
Phosphate Buffered Saline (PBS) Sigma-Aldrich, St. Louis, USA D8537-500ML 500 mL
Senescence detection kit Abcam, Cambridge, UK ab65351
Shaker/ Vortex IKA, Staufen im Breisgau, Germany n.a. MS2 Minishaker (subsequent model: Ident-Nr.: 0020016017)
Sterile plastic tubes Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA Falcon 352095 BD Falcon tubes (15 mL, 50 mL)
Ultrasonic water bath BANDELIN electronic GmbH & Co. KG, Berlin, Germany 312 Sonorex RK100H
Surgical scissors (atraumatic) Aesculap AG, Tuttlingen, Germany NR 82
Surgical scissors  Aesculap AG, Tuttlingen, Germany eq 1060.09
Surgical forceps Aesculap AG, Tuttlingen, Germany BD577

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Künzel, S. R., Schaeffer, C., Sekeres, K., Mehnert, C. S., Schacht Wall, S. M., Newe, M., Kämmerer, S., El-Armouche, A. Ultrasonic-augmented Primary Adult Fibroblast Isolation. J. Vis. Exp. (149), e59858, doi:10.3791/59858 (2019).More

Künzel, S. R., Schaeffer, C., Sekeres, K., Mehnert, C. S., Schacht Wall, S. M., Newe, M., Kämmerer, S., El-Armouche, A. Ultrasonic-augmented Primary Adult Fibroblast Isolation. J. Vis. Exp. (149), e59858, doi:10.3791/59858 (2019).

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