Vi presenterer en protokoll for å isolere primær voksen fibroblaster på en enkel, rask og pålitelig måte, performable av nybegynnere (f. eks, studenter). Prosedyren kombinerer enzymatisk vev fordøyelse og mekanisk agitasjon med ultralydbølger for å få primær fibroblaster. Protokollen kan enkelt tilpasses spesifikke eksperimentelle krav (f.eks. menneskelig vev).
Primær voksen fibroblaster har blitt et viktig verktøy for å studere fibrose, Fibroblast interaksjoner og betennelser i alle kroppens vev. Siden primære fibroblaster ikke kan dele på ubestemt tid på grunn av myofibroblast differensiering eller senescence induksjon, nye kulturer må etableres regelmessig. Det er imidlertid flere hindringer å overvinne under prosessene med å utvikle en pålitelig isolasjons protokoll og primær Fibroblast isolasjon seg selv: metoden vanskelighetsgrad (spesielt for nybegynnere), risikoen for bakteriell forurensning, nødvendig tid før primære fibroblaster kan brukes til eksperimenter, og påfølgende celle kvalitet og levedyktighet. I denne studien, en rask, pålitelig og lett å lære protokollen for å isolere og kultur primære voksen fibroblaster fra mus hjerte, lunge, lever og nyre kombinere enzymatisk fordøyelse og ultralyd omrøring er gitt.
Fibroblaster er flate, spindel-formede celler med flere Stel prosesser og en omfattende grov endoplasmatiske retikulum1,2. En gjennomsnittlig Fibroblast måler 30-100 μm og har en levetid på 57 ± 3 dager1,3. Den gjennomsnittlige celle syklus varigheten av menneskelig fibroblaster varierer fra 16-48 h avhengig av kulturen forhold4. Det er dokumentert at replicative kapasitet og funksjonell kvalitet på kulturperler primære fibroblaster negativt samsvarer med donor alder, noe som tyder på at yngre donorer (dyr eller pasienter) bør foretrekkes hvis mulig5,6 .
Fibroblaster utgjør en dominerende celle type mest pattedyr kroppens vev. Til tross for deres allestedsnærværende tilstedeværelse, den molekylære identifisering av fibroblaster er fortsatt en utfordring7. Fibroblaster migrere til å utvikle vev og organer fra ulike kilder under embryonale utviklingen8. Av denne grunn er det en overflod av markør proteiner som finnes i fibroblaster mens unike markør proteiner, som er til stede i hver Fibroblast befolkning og eksklusivt for fibroblaster, er fortsatt mangler. Uttrykks mønstre for flere gjenkjente markører brukes derfor vanligvis til å identifisere fibroblaster. Blant de mest anerkjente markører er vimentin, humant Fibroblast overflate protein (hFSP), discoidin domene reseptor 2 (DDR2) og Alpha glatt muskel utgangen (αSMA).
Fibroblaster er de viktigste ekstracellulære matrise (ECM)-produserende celle type. Derved, fibroblaster opprettholde en ryddig vev arkitektur og gi mekanisk støtte for nærliggende celler1. Balansen mellom ECM-syntese og-degradering er en godt regulert prosess. Skifter mot syntese markere begynnelsen av overdreven ECM deponering som, hvis ikke avsluttet, fører til fibrose. Fibrose er formidlet av myofibroblasts, som stammer fra aktivert fibroblaster gjennomgår molekylær og phenotypical endringer. Et kjennetegn på myofibroblasts er forbedret sekresjon av ECM og cytokiner og uttrykk for ryddig arrangert αSMA microfilaments9.
Primære fibroblaster har vært i søkelyset av nyere forskning med fokus på fibrose, vevs betennelse og Fibroblast-kreft-celle interaksjoner10,11. Men for å effektivt studere Fibroblast egenskaper i helse og sykdom, er det nødvendig å isolere levedyktig primær voksen fibroblaster på jevnlig basis. Det finnes flere metoder for å isolere fibroblaster12,13,14. De tre store metoder for Fibroblast isolasjon er utvekst fra vev biter12, enzymatisk vev fordøyelse15, og enzymatisk av hul organer9,13,16. Fordelen med utvekst er en skånsom isolasjons prosess uten enzymatisk celle degradering. På den annen side, utvekst kulturer krever vanligvis forlenget kultur perioder inntil cellene kan brukes til eksperimenter. Vanlig enzymatisk fordøyelsen er rask, men bærer en risiko for forurensning med andre celletyper (f. eks, endothelial celler) eller bakterier i agitasjon prosessen, som er nødvendig for å mekanisk oppløse vevet. Videre disse metodene er ofte forseggjort og krever tid og dyktighet til å lære.
Når det gjelder viktigheten av primære fibroblaster i forskning, er det fortsatt behov for å optimalisere eksisterende celle isolasjon tilnærminger i form av hurtighet, enkelhet og pålitelighet. Her, en roman ultralyd-basert enzymatisk Fibroblast isolasjon metode levere høy kvalitet celler er gitt.
Sammenlignet med udødeliggjort Fibroblast cellelinjer, har primære fibroblaster flere fordeler. De kan isoleres kostnadseffektivt i høy kvalitet og kvantitet. Videre primære kulturer tilbyr muligheten til å studere celler fra flere individer, noe som øker påliteligheten av oppnådde resultater og reduserer sannsynligheten for bare å studere cellekultur gjenstander. Kontinuerlig generering av nye primære kulturer forhindrer genetiske forandringer som ofte oppstår etter gjentatt passaging21</sup…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker MS Romy Kempe og fru Annett Opitz for ekspert teknisk støtte. Vi takker også Mr. Bjoern Binnewerg for IT-støtte. Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra a) den Förderkreis Dresdner Herz-kreislauf-tage e.V., b) “Habilitationsförderprogramm für frauen”, det medisinske fakultet Carl Gustav Carus Dresden og c) else Kröner-Forschungskolleg (EKFK) det medisinske fakultet Carl Gustav Carus Dresden. Vi er takknemlige for finansiering og støtte.
0.25% Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | T4049-100ML | |
Antibiotics | Gibco-Life Technologies, Carlsbad, USA | Gibco LS15140148 | Penicillin/ Streptomycin (10000 U/ml) |
Cell culture hood | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA | 51023608 | HeraSafe KSP15 |
Cell culture incubator | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA | 50049176 | BBD 6220 |
Cell culture plates | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA | depends on vessel | 6-, 12-, 24-wells Nunclon surface |
Cell culture suction | VACUUBRAND GMBH + CO KG, Wertheim, Germany | 20727400 | BVC professional suction |
Cell strainer (mesh) | Corning, Tewksbury, USA | 431750 | 40 µm Nylon |
Centrifuge | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA | 75007213 | Megafuge 8R |
Cordless pipetting controller | Hirschmann, Eberstadt, Germany | 9907200 | Pipetus |
Disposable pipette tips | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | depends on volume | SafeSeal tips for pipettes (10 µl, 20 µl, 100 µl, 200 µl, 1000 µl) |
Disposable plastic pipettes | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | depends on volume | 5 ml, 10 ml, 25 ml, 50 ml |
Disposable sterile scalpel | Myco Medical, Cary, USA | n.a. | Techno cut |
Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA | 41965-062 | High glucose |
Eppendorf tubes | Eppendorf, Hamburg, Germany | depends on volume | 50 µl, 500 µl, 1.500µl, 2.000 µl |
Fetal calf serum (FCS) | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | F2442-50ML | |
Collagenase blend | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | 5401020001 | Liberase TL Research Grade |
Petri dish 6 cm | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | P5481-500EA | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | D8537-500ML | 500 ml |
Senescence detection kit | Abcam, Cambridge, UK | ab65351 | |
Shaker/ Vortex | IKA, Staufen im Breisgau, Germany | n.a. | MS2 Minishaker (subsequent model: Ident-Nr.: 0020016017) |
Sterile plastic tubes | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA | Falcon 352095 | BD Falcon tubes (15 ml, 50 ml) |
Ultrasonic water bath | BANDELIN electronic GmbH & Co. KG, Berlin, Germany | 312 | Sonorex RK100H |
Surgical scissors (atraumatic) | Aesculap AG, Tuttlingen, Germany | NR 82 | |
Surgical scissors | Aesculap AG, Tuttlingen, Germany | eq 1060.09 | |
Surgical forceps | Aesculap AG, Tuttlingen, Germany | BD577 |