Denne protokollen fokuserer på identifisering av proteiner som binder til Inositol fosfater eller phosphoinositides. Den bruker affinitet kromatografi med biotinylated Inositol fosfater eller phosphoinositides som er immobilisert via streptavidin til agarose eller magnetiske perler. Inositol fosfat eller fosfoinositid bindende proteiner identifiseres av vestlig blotting eller masse massespektrometri.
Inositol fosfater og phosphoinositides regulerer flere cellulære prosesser i Landplantenes, inkludert genuttrykk, vesicle smugling, signal Transduction, metabolisme og utvikling. Disse metabolitter utføre denne regulatoriske aktiviteten ved binding til proteiner, og dermed endre protein konformasjon, katalysator og/eller interaksjoner. Metoden beskrevet her bruker affinitet kromatografi koplet til masse massespektrometri eller vestlige blotting å identifisere proteiner som samhandler med Inositol fosfater eller phosphoinositides. Inositol fosfater eller phosphoinositides er kjemisk merket med biotin, som deretter fanges via streptavidin bøyd til agarose eller magnetiske perler. Proteiner er isolert av deres affinitet av binding til metabolitten, deretter eluert og identifisert av masse massespektrometri eller vestlig blotting. Metoden har en enkel arbeidsflyt som er følsom, ikke-radioaktivt, liposome, og passelig, støtter analyse av protein og metabolitten interaksjon med presisjon. Denne tilnærmingen kan brukes i etikett-fri eller i amino acid-merket kvantitative masse massespektrometri metoder for å identifisere protein-metabolitten interaksjoner i komplekse biologiske prøver eller ved hjelp av renset proteiner. Denne protokollen er optimalisert for analyse av proteiner fra Trypanosoma brucei, men det kan tilpasses til relaterte protozoan parasitter, gjær eller pattedyrceller.
Inositol fosfater (IPS) og phosphoinositides (PIs) spiller en sentral rolle i eukaryote biologi gjennom regulering av cellulære prosesser som kontroll av genuttrykk1,2,3, vesicle smugling 4, signal Transduction5,6, metabolisme7,8,9og utvikling8,10. Den regulatoriske funksjon av disse metabolitter resultater fra deres evne til å samhandle med proteiner og dermed regulere protein funksjon. Ved binding av proteiner, kan IPs og PIs endre protein konformasjon11, katalysatorer aktivitet12, eller interaksjoner13 og dermed påvirker mobilnettet funksjon. IPS og PIs distribueres i flere subcellulære rom, for eksempel nucleus2,3,14,15, endoplasmatiske retikulum16,17, plasma membran1 og stoffer18, enten forbundet med proteiner3,19 eller med RNAs20.
Kløften av membranen-assosiert PI (4, 5) P2 ved fosfolipase C resulterer i utgivelsen av ins (1, 4, 5) P3, som kan fosforylert eller dephosphorylated av IP kinaser og phosphatases, henholdsvis. IPs er løselige molekyler som kan bindes til proteiner og utøver regulatoriske funksjoner. For eksempel ins (1, 4, 5) P3 i metazoan kan fungere som en andre Messenger ved binding til IP3 reseptorer, som induserer reseptor conformational endringer og dermed utgivelsen av ca2 + fra intracellulære butikker11. Ins (1, 3, 4, 5) P4 binder seg til Histone deacetylase komplekse og regulerer protein kompleks montering og aktivitet13. Andre eksempler på IPS forskriftsmessig funksjon inkluderer kontroll av kromatin organisasjon21, RNA transport22,23, RNA redigering24, og transkripsjon1,2,3 . I kontrast, PIs er ofte forbundet med rekruttering av proteiner til plasma membranen eller organelle membraner25. Men en voksende egenskap av PIs er evnen til å assosiere med proteiner i et ikke-membranous miljø3,15,19,26. Dette er tilfelle av den kjernefysiske reseptor steroidogenic faktor, som transcriptional kontrollfunksjonen er regulert av PI (3, 4, 5) P319, og Poly-A polymerase som enzymatisk aktivitet er regulert av kjernefysiske PI (4, 5) P226. En regulerende rolle for IPS og PIs har blitt vist i mange organismer, inkludert gjær22,27, pattedyrceller19,23, Drosophila10 og Worms28. Av betydning er rollen til disse metabolitter i trypanosomes, som skilt tidlig fra eukaryote avstamning. Disse metabolitter spiller en viktig rolle i Trypanosoma brucei transcriptional kontroll1,3, utvikling8, organelle kognitiv og protein trafikk29,30 , 31 andre , 32, og er også involvert i å kontrollere utvikling og smitte i patogener T. cruzi33,34,35, Toxoplasma36 og Plasmodium 5 andre priser , 37. herav, forståelse rollen av IPS og PIs inne trypanosomes kanskje hjelpe å belyse ny Biological funksjonen for disse molekyler og å identifisere romersk bedøve mål.
Det spesielle ved protein og IP eller PI bindende avhenger protein samspill domener og fosforylering staten Inositol13,38, selv om interaksjoner med lipid delen av PIs oppstår også19. Variasjonen av IPs og PIs og deres modifisere kinaser og phosphatases gir en fleksibel cellulær mekanisme for å kontrollere protein funksjon som er påvirket av metabolitten tilgjengelighet og overflod, den fosforylering tilstanden til Inositol, og protein affinitet av samspill1,3,13,38. Selv om noen protein domener er godt preget39,40,41, f. eks, pleckstrin homologi domene42 og SPX (SYG1/Pho81/XPR1) domener43 ,44,45, noen proteiner samhandle med IPS eller PIs av mekanismer som forblir ukjent. For eksempel, hemmende-aktivator protein 1 (RAP1) av T. brucei mangler kanoniske PI-bindende domener, men SAMHANDLER med PI (3, 4, 5) P3 og kontroll transkripsjon av gener involvert i antigen variasjon3. Affinitet kromatografi og masse massespektrometri analyse av IP eller PI samhandler proteiner fra trypanosome, gjær eller pattedyrceller identifisert flere proteiner uten kjente IP-eller PI-bindende domener8,46, 47. dataene tyder på flere uncharacterized protein domener som binder til disse metabolitter. Derfor, identifisering av proteiner som samhandler med IP eller PIs kan avdekke romanen mekanismer av protein-metabolitten interaksjon og nye cellulære regulatoriske funksjoner for disse små molekyler.
Metoden beskrevet her sysselsetter affinitet kromatografi koplet til vestlige blotting eller masse massespektrometri å identifisere proteiner som binder til IPs eller PIs. Den bruker biotinylated IP-adresser eller behandlingsinstruksjoner som enten er krysskoblet til streptavidin som bøyes likt til agarose perler eller alternativt, tatt opp via streptavidin magnetiske perler (figur 1). Metoden gir en enkel arbeidsflyt som er følsom, ikke-radioaktivt, liposome og er egnet for å oppdage bindingen av proteiner fra celle lysater eller renset proteiner3 (figur 2). Metoden kan brukes i etikett-Free8,46 eller koplet til amino acid-merket kvantitative masse massespektrometri47 å identifisere IP eller PI-bindende proteiner fra komplekse biologiske prøver. Derfor er denne metoden et alternativ til de få metodene som er tilgjengelige for å studere samspillet av IPs eller PIs med cellulære proteiner og vil bidra til å forstå regulatoriske funksjon av disse metabolitter i trypanosomes og kanskje andre Landplantenes.
Identifisering av proteiner som binder til IPs eller PIs er avgjørende for å forstå cellulære funksjon av disse metabolitter. Affinitet kromatografi koplet til Western Blot eller masse massespektrometri gir en mulighet til å identifisere IP eller PI samspill proteiner og dermed få innsikt i sin regulatoriske funksjon. IPs eller PIs kjemisk merket [f. eks ins (1, 4, 5) P3 kjemisk knyttet til biotin] og krysskoblet til agarose perler via streptavidin eller fanget av streptavidin magnetiske perler tillater isolering a…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av Natural Sciences og engineering Research Council of Canada (NSERC, RGPIN-2019-04658); NSERC Discovery lanseringen supplement for tidlig karriere forskere (DGECR-2019-00081) og ved McGill University.
Acetone | Sigma-Aldrich | 650501 | Ketone |
Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 271004 | Solvent |
Ammonium bicarbonate | Sigma-Aldrich | A6141 | Inorganic salt |
Centrifuge Avanti J6-MI | Beckman Coulter | Avanti J6-MI | Centrifuge for large volumes (e.g., 1L) |
Centrifuge botles | Sigma-Aldrich | B1408 | Bottles for centrifugation of 1L of culture |
Control Beads | Echelon | P-B000-1ml | Affinity chromatography reagent – control |
D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Sugar, Added in PBS to keep cells viable |
Dithiothreitol (DTT) | Bio-Rad | 1610610 | Reducing agent |
Dynabeads M-270 Streptavidin | ThermoFisher Scientific | 65305 | Streptavidin beads for binding to biotin ligands |
EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11836170001 | Protease inhibitors |
Electrophoresis running buffer | Bio-Rad | 1610732 | 25 mM Tris, 192 mM glycine, 0.1% SDS, pH 8.3 |
Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Corning Life Sciences | 430052 | To centrifuge 10 mL cultures |
Formic acid | Sigma-Aldrich | 106526 | Acid |
Glycine | Sigma-Aldrich | G7126 | Amino acid |
HMI-9 cell culture medium | ThermoFisher Scientific | ME110145P1 | Cell culture medium for T. brucei bloodstream forms |
Imperial Protein Stain | ThermoFisher Scientific | 24615 | Coomassie staining for protein detection in SDS/PAGE |
Ins(1,4,5)P3 Beads | Echelon | Q-B0145-1ml | Affinity chromatography reagent |
Instant Nonfat Dry Milk | Thomas Scientific | C837M64 | Blocking reagent for Western blotting |
Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | I6125 | Alkylating reagent for cysteine proteins or peptides |
Lab Rotator | Thomas Scientific | 1159Z92 | For binding assays |
LoBind Microcentrifuge Tubes | ThermoFisher Scientific | 13-698-793 | Low protein binding tubes for mass spectrometry |
Nonidet P-40 (Igepal CA-630) | Sigma-Aldrich | 21-3277 | Detergent |
PBS, pH 7.4 | ThermoFisher Scientific | 10010031 | Physiological buffer |
Peroxidase substrate for chemiluminescence | ThermoFisher Scientific | 32106 | Substrate for Western bloting detection of proteins |
PhosSTOP Phosphatase Inhibitor Cocktail Tablets | Roche | 4906845001 | Phosphatase inhibitors |
PI(3)P PIP Beads | Echelon | P-B003a-1ml | Affinity chromatography reagent |
PI(3,4)P2 PIP Beads | Echelon | P-B034a-1ml | Affinity chromatography reagent |
PI(3,4,5)P3 diC8 | Echelon | P-3908-1mg | Affinity chromatography reagent |
PI(3,4,5)P3 PIP Beads | Echelon | P-B345a-1ml | Affinity chromatography reagent |
PI(3,5)P2 PIP Beads | Echelon | P-B035a-1ml | Affinity chromatography reagent |
PI(4)P PIP Beads | Echelon | P-B004a-1ml | Affinity chromatography reagent |
PI(4,5)P2 diC8 | Echelon | P-4508-1mg | Affinity chromatography reagent |
PI(4,5)P2 PIP Beads | Echelon | P-B045a-1ml | Affinity chromatography reagent |
PI(5)P PIP Beads | Echelon | P-B005a-1ml | Affinity chromatography reagent |
Ponceau S solution | Sigma-Aldrich | P7170 | Protein staining (0.1% [w/v] in 5% acetic acid) |
Potassium hexacyanoferrate(III) | Sigma-Aldrich | 702587 | Potassium salt |
PtdIns PIP Beads | Echelon | P-B001-1ml | Affinity chromatography reagent |
PVDF Membrane | Bio-Rad | 1620177 | For Western blotting |
Refrigerated centrifuge | Eppendorf | 5910 R | Microcentrifuge for small volumes (e.g., 1.5 mL) |
Sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | 862010 | Detergent |
Sodium thiosulfate | Sigma-Aldrich | 72049 | Chemical |
SpeedVac Vacuum Concentrators | ThermoFisher Scientific | SPD120-115 | Sample concentration (e.g., for mass spectrometry) |
T175 flasks for cell culture | ThermoFisher Scientific | 159910 | To grow 50 mL T. brucei culture |
Trypsin, Mass Spectrometry Grade | Promega | V5280 | Trypsin for protein digestion |
Urea | Sigma-Aldrich | U5128 | Denaturing reagent |
Vortex | Fisher Scientific | 02-215-418 | For mixing reactions |
Western blotting transfer buffer | Bio-Rad | 1610734 | 25 mM Tris, 192 mM glycine, pH 8.3 with 20% methanol |
Whatman 3 mm paper | Sigma-Aldrich | WHA3030861 | Paper for Wester transfer |
2-mercaptoethanol (14.2 M) | Bio-Rad | 1610710 | Reducing agent |
2x Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 161-0737 | Protein loading buffer |
4–20% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels | Bio-Rad | 4561094 | Gel for protein electrophoresis |
4x Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 161-0747 | Protein loading buffer |