Summary
نقدم طريقة لعزل وزراعة الخلايا الظهارية المشتقة من الغدة اللعابية البشرية الأولية. هذه الخلايا تظهر أنماط التعبير الجيني متسقة مع كونها من أصل ظهاري اللعابي ويمكن زراعتها كما ساليسفيرس على مصفوفات غشاء الطابق السفلي المستمدة من الخلايا السرطانية Engelbreth-Holm-Swarm أو كطبقات أحادية على أطباق الثقافة المعالجة.
Abstract
الغدد اللعابية هي موقع مهم كبير للباحثين المهتمين في جوانب متعددة من الأمراض البشرية. هدف واحد من الباحثين هو استعادة وظيفة الغدد التالفة من العلاجات الإشعاعية أو بسبب الأمراض المرتبطة بمتلازمة Sjögren. والهدف الثاني للباحثين هو تحديد الآليات التي تتكرر بها الفيروسات داخل الأنسجة الغدية حيث يمكنها بعد ذلك الوصول إلى السوائل اللعابية الهامة للانتقال الأفقي. وتبرز هذه الأهداف الحاجة إلى نموذج قوي ويمكن الوصول إليه في المختبر للغدة اللعابية التي يمكن استخدامها من قبل الباحثين المهتمين في المجالات المذكورة أعلاه وكذلك مجالات البحوث ذات الصلة. هنا نناقش بروتوكول بسيط لعزل الخلايا الظهارية من الغدد اللعابية البشرية ونشرها في المختبر. ويمكن تحسين بروتوكولنا لتلبية احتياجات الدراسات الفردية. باختصار، يتم فصل الأنسجة اللعابية ميكانيكيًا وعنأنزيمي لعزل الخلايا المفردة أو مجموعات صغيرة من الخلايا. اختيار الخلايا الظهارية يحدث عن طريق الطلاء على مصفوفة غشاء الطابق السفلي في وجود وسائل الإعلام الأمثل لتعزيز نمو الخلايا الظهارية. ويمكن الحفاظ على هذه الثقافات الناتجة كمجموعات ثلاثية الأبعاد، تسمى "ساليسفيرز"، أو تزرع كطبقة أحادية على أطباق زراعة الأنسجة البلاستيكية المعالجة. ينتج عن هذا البروتوكول نمو السكان غير المتجانسين من الخلايا الظهارية بشكل رئيسي التي يمكن نشرها لمدة 5-8 ممرات (15-20 تضاعف السكان) قبل أن تخضع للشيخوخة الخلوية.
Introduction
في الثدييات يتم تنظيم الغدد اللعابية في 3 أزواج من الغدد اللعابية الرئيسية: الغدد النكفية، تحت الفك السفلي، وتحت اللسان. هناك أيضا سلسلة من الغدد الثانوية الموجودة على اللسان ومتناثرة في جميع أنحاء تجويف الفم1. الغدد الرئيسية هي المسؤولة عنحجم الجزء الأكبر من اللعاب المنتجة 2. بالإضافة إلى توفير الحماية المضادة للميكروبات من خلال عوامل سرية ، فإن اللعاب مهم في عملية مضغ وتزييت الطعام أثناء مروره عبر المريء2. على هذا النحو ، يمثل خلل الغدة اللعابية مشكلة طبية حيث يكون المصابون غير القادرين على إنتاج ما يكفي من اللعاب أكثر عرضة لتطوير أمراض مثل تجاويف الأسنان أو داء المبيضات الفموي3. بالإضافة إلى ذلك، يؤدي انخفاض اللعاب إلى صعوبة أكبر في تناول الطعام وهضمه مما يؤثر بشكل كبير على نوعية الحياة.
يوجد خلل في الغدة اللعابية في المقام الأول في المرضى الذين يعانون من متلازمة Sjögren، اضطراب المناعة الذاتية، أو في المرضى الذين يعانون من سرطان الرأس والرقبة الذين خضعوا للعلاج بالتشعيع3،4،5، 6. أسيني إفرازي تالف داخل الغدد نتيجة للمناعة الذاتية أو العلاج الإشعاعي لا تخضع للتجديد الذاتي، مما يؤدي إلى مريض يعيش مع ضرر لا رجعة فيه6. وقد جذبت دراسة الغدد اللعابية أيضا الاهتمام أو الباحثين المهتمين في آليات مسببات الأمراض الفيروسية. بعض مسببات الأمراض، مثل الفيروس المضخم للخلايا البشرية (HCMV)، تتكرر باستمرار داخل الغدد اللعابية، والذي يسمح بعد ذلك بانتقال الفيروس الوليد إلى مضيف جديد عن طريق اللعاب7،8. وهكذا، هناك حاجة غير ملباة لتطوير نماذج قوية واستنساخفي المختبر من أنسجة الغدة اللعابية لمعالجة وفهم مجموعة متنوعة من المشاكل الطبية.
وقد استخدمت عدة نماذج من نظام الغدة اللعابية المورين كنقطة انطلاق لفهم وتوصيف الخلايا الظهارية المختلفة التي تشكل الغدد اللعابية9،10. هناك اختلافات واضحة وكبيرة بين الغدد البشرية والغدد اللعابية المورين11. أبرزها الغدة النكفية البشرية أكبر بالنسبة للغدة تحت الفك السفلي في حين أن الماوس تحت الفك السفلي وparotid متشابهة إلى حد كبير في حجم1،2،11. في حين توجد خطوط الخلايا تحت الفك السفلي البشرية الخالدة، هناك مخاوف كبيرة من أن الخلايا الخالدة لا تحافظ بدقة على النمط الظاهري للأنسجة الأولية والمخاوف الثانوية التي لا تستمد الخلايا الخالدة في الواقع من ظهارة اللعاب ية نفسها12. لهذه الأسباب هناك اهتمام والحاجة إلى دراسة الأنسجة اللعابية الأولية من البشر.
هنا نقوم بوصف بروتوكول لعزل الخلايا الظهارية الأولية من الغدد اللعابية البشرية لثقافة الأنسجة. ويستند بروتوكولنا على أعمال Pringle وآخرون وتران وآخرون مع التعديلات التي أدخلت لتبسيط إجراءاتها عموما13،14. أولاً، في حين أن بروتوكول تران وآخرون يدعو إلى حضانة لمدة خمس ساعات طويلة لهضم الأنسجة اللعابية بشكل أنزيمي، فإن بروتوكولنا المعدل كان ناجحاً بأقل من ساعة واحدة من الحضانة، على غرار ما هو الحال في برينغل وآخرون. ثانيا، نحن نستخدم إنزيمات مختلفة لهضم الأنسجة، وأبرزها أننا لا نستخدم التربسين كما هو مستخدم في بروتوكول تران وآخرون الأصلي، ولكن بدلا من ذلك استخدام خليط من dispase والكولاجين. نحن نفضل تجنب التربسين في خطوات الهضم الأولية كما اقترحت دراسة حديثة أن الهضم الأولي للأنسجة اللعابية عن طريق التربسين يؤدي إلى انخفاض صلاحية الخلايا، وربما عن طريق فقدان مجموعة نادرة من الخلايا الجذعية15. وأخيرا، نحن ثقافة ساليسفيرس على سطح مصفوفة غشاء الطابق السفلي (BMM) باستخدام وسائل الإعلام المتاحة تجاريا وضعت أصلا لنشر الخلايا الظهارية القصبية. يمكن استخدام بروتوكولنا لعزل الخلايا اللعابية من الغدد النكفية، تحت الفك السفلي، وتحت اللسان. هذه الخلايا تعبر عن الميليز اللعابي وغيرها من الجينات الخاصة اللعابية تشير إلى أنها تحافظ علىالنمط الظاهري مماثلة لتلك التي من الخلايا الظهارية acinar اللعاب7 . لقد نجحنا في توليد الثقافات اللعابية من > 50 عينة الأنسجة البشرية الأولية باستخدام هذه المنهجية. وعلاوة على ذلك، يمكن بسهولة حفظ الخلايا اللعابية الأولية بالتبريد لاستخدامها في وقت لاحق.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وقد تم استعراض هذه البروتوكولات والدراسات والموافقة عليها من قبل مجلس الاستعراض المؤسسي في جامعة سينسيناتي (#00003152 الضمان على نطاق الاتحاد، بروتوكول IRB للفترة 2016-4183). عادة ما يتم استئصال الأنسجة اللعابية في العديد من العمليات الجراحية للرأس والرقبة وعادة ما تكون غير متورطة في العملية الخبيثة. عادة، يتم استخدام أنسجة الغدة اللعابية استئصال حديثا في غضون 2-4 ساعة بعد إزالة من المريض (الشكل1A).
1. إعداد الكاشف
-
نمو الخلايا الظهارية القصبية المتوسطة (BEGM)
- إضافة مكونات من المجموعة التي توفرها الشركة المصنعة (انظر جدولالمواد).
- غسل كل أنبوب مرة واحدة مع وسائل الإعلام الأساسية لضمان النقل الكامل للمكونات. ثم إضافة الفحم تجريد المصل البقر الجنين لجعل التركيز النهائي من 4٪ المصل.
-
حجر الليسين بخلايا الدم الحمراء (RBC)
- لجعل الأسهم 10X، إضافة 40.15 غرام من NH4Cl، 5.0 غرام من NaHCO3،و 0.186 غرام من حمض اثيلين ديايمينتيتانسيتيك (EDTA) وإحضار ما يصل إلى حجم نهائي من 200 مل باستخدام dH2O. ثم تصفية تعقيم وتخزينها في 4 درجة مئوية.
- تمييع إلى تركيز العمل من 1X في dH معقمة2O قبل الاستخدام.
-
حل التفكك
- إلى زجاجة 100 مل من محلول ديسباس (انظر جدولالمواد) إضافة 0.15 غرام من الكولاجين نوع الثالث. بعد أن يذوب الكولاجين بالكامل، قم بتعقيم الفلتر للحل الجديد وaliquot. تخزين في -20 درجة مئوية.
2. هضم الأنسجة
- باستخدام لوحة 100 ملم ثقافة الأنسجة، ميكانيكيااليالمين الأنسجة إلى قطع غرامة ~ 1-2 ملم في الحجم باستخداممقص تشريح الأوتوكلاف معقمة وملقط الجراحية (الشكل1B،C). يجب قطع النسيج الضام بين القطع لضمان الفصل السليم وسهولة في مزيد من الخطوات.
- أضف 6 مل من محلول ديسباس/كولاجيناز إلى الأنسجة المفرومة. ثم الحضانة في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة تقريبا إلى 1 ساعة.
- تعطيل الأنسجة عن طريق الأنابيب مع ماصة المصلية 5 مل 15-20 مرات.
- حضانة في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة أخرى إلى 1 ساعة.
- كرر الخطوتين 2.3 و 2.4 مرتين أو ثلاث مرات أخرى أو حتى يشبه النسيج الطين ويمكن أن تمر بسهولة من خلال فتح الماصات (الشكل1D).
ملاحظة: حجم البداية للعينة الأنسجة وكيف دقة الأنسجة فرم سوف تحدد عدد المرات التي يحتاج المرء لتكرار الخطوتين 2.3 و 2.4. عادة، نتلقى الأنسجة تقريبا 1 سم × 1 سم في الحجم. بالإضافة إلى ذلك، يمكن للمرء أن يراقب تفكك الأنسجة باستخدام مجهر زراعة الأنسجة المقلوبة القياسية لتتبع تقدم انفصال الخلايا عن الأنسجة. مجموعات صغيرة من الخلايا مثالية للنمو الأولي للخلايا اللعابية كما ساليسفيرس.
3. طلاء الآبار مع مصفوفة غشاء الطابق السفلي
ملاحظة: ينبغي إذابة مصفوفة غشاء الطابق السفلي (BMM) بين عشية وضحاها عند 4 درجة مئوية في اليوم السابق لاستخدامها. وبمجرد ذوبانها، ينبغي الحفاظ على BMM باستمرار على الجليد أو عند 4 درجة مئوية كما أنها سوف تترسخ بسرعة (أي، تشكيل هلام) في درجات حرارة أكثر دفئا. بالإضافة إلى ذلك، ينبغي توخي الحذر إذا كانت العينات قد تم تبريدها على الجليد قبل الطلاء على BMM كما عينات الباردة سوف "تذوب" BMM وتعريض الخلايا إلى الطبق البلاستيك.
- ببطء ماصة BMM (انظر الجدول منالمواد) في كل بئر لتكون مغلفة. توزيع بالتساوي وببطء BMM على البئر.
ملاحظة: عموما، ونحن نستخدم 500 درجة مئوية لكل بئر من لوحة ستة جيدا، ولكن يمكن تعديل هذا الحجم للاستخدام على المتغيرات الأخرى من لوحات مثل 12-جيدا أو 24-جيدا، أو على النحو المطلوب لهيدروجيلز سمكا أو أرق. - قم بحضانة الأطباق المغلفة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة على الأقل قبل استخدامها للسماح لوقت BMM بالتصلب.
4. تصفية الأنسجة غير المهضومة، وlysis RBC، وطلاء الخلايا
- نقل التجانس الأنسجة من الخطوة 2.5 إلى أنبوب مخروطي 15 مل. غسل لوحة مرة واحدة مع 6 مل من الفوسفات دولبيكو المخزنة المالحة (DPBS) لنقل الخلايا المتبقية.
- تصفية التجانس في أنبوب مخروطي 50 مل من خلال 70 ميكرومتر نايلون شبكة مصفاة الخلية لإزالة الأنسجة غير المهضومة. الخلايا المتوترة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 500 × ز.
- تخفيف 10X RBC lysis العازلةفي dH 2 O معقمة لجعل حل العمل 1X.
- يستنشق الخارق. ثم إعادة تعليق بيليه الخلية في 10 مل من 1X RBC lysis العازلة. حضانة لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية.
- إضافة 20-25 مل من DPBS لتحييد العازلة اللليس RBC وتقليل lysis من الخلايا اللعابية. الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 500 × ز.
ملاحظة: بعد العلاج مع المخزن المؤقت الانليس RBC، يجب أن يكون بيليه الخلية بيضاء. اللون الأحمر في بيليه يشير إلى أن ليس كل RBC قد تم lysed تماما. كرر الخطوات من 4.4 إلى 4.5 إذا لزم الأمر للحصول على lysis كاملة من كافة RBC. - يستنشق الخارق. إعادة تعليق بيليه في 1-2 مل من BEGM لكل بئر ثم وضع الخلايا المعاد تعليقها على الآبار المغلفة BMM. الحضانة عند 37 درجة مئوية
- مرة واحدة مطلية على BMM، وسوف تشكل الخلايا في هياكل كروية أو "ساليسفيرس" على مدى فترة 2-3 أيام. يمكن الحفاظ على الخلايا كساليسفيرات لمدة 5-7 أيام قبل أن يبدأ BMM في التدهور مما يسمح للخلايا بالوصول إلى البلاستيك والتمسك به وتنمو كطبقة أحادية.
5. إخضاع الساليسفيرات والصيانة على BMM
- يستنشق وسائل الإعلام من الآبار، ثم إضافة 1 مل من محلول dispase / collagenase إلى كل بئر وحضانة في 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة ~ أو حتى BMM قد حل في الغالب.
- نقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي 15 مل وغسل الآبار مرة واحدة مع DPBS للحصول على الخلايا المتبقية. الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 500 × ز.
- يستنشق الخارق. إعادة تعليق بيليه في 2 مل من التربسين ثم احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
- تحييد التربسين باستخدام أي وسائل الإعلام كاملة تحتوي على 10٪ المصل. الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 500 × ز.
- يستنشق الخارق. إعادة تعليق الخلايا في DPBS لإزالة الوسائط المتبقية، التربسين، والمصل. الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 500 × ز.
- يستنشق الخارق. إعادة تعليق في BEGM ولوحة الخلايا التي تم تعليقها على أطباق الثقافة المغلفة BMM الصلبة. كما يمكن أن تكون الخلايا المعلقة مطلية مباشرة على أطباق الخلية المعالجة للانتشار كطبقة أحادية. لمزيد من المعلومات حول نمو الخلايا اللعابية كطبقة أحادية، راجع القسم 6. يجب تغذية الخلايا المزروعة على BMM أو على البلاستيك مع BEGM الطازجة كل 2-3 أيام.
- زراعة الخلايا في حاضنة رطبة الحفاظ على 37درجة مئوية مع 5٪ CO 2.
6. إخضاع الساليسفيرات على أطباق زراعة الأنسجة البلاستيكية المعالجة
ملاحظة: إذا تم الحفاظ على الخلايا كطبقة أحادية على البلاستيك، ابدأ في هذه الخطوة. ينطبق البروتوكول التالي على الخلايا التي تنمو في طبق 100 مم.
- يستنشق وسائل الإعلام. غسل مرة واحدة مع DPBS لإزالة الوسائط المتبقية.
- إضافة 2 مل من التربسين ثم احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة، أو حتى الخلايا قد فصل تماما.
- تحييد التربسين باستخدام 4 مل من أي وسائل الإعلام كاملة تحتوي على 10٪ المصل. نقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي 15 مل.
- اغسل اللوحة مرة واحدة مع ما يقرب من 5 مل من DPBS لجمع الخلايا المتبقية. الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 500 × ز.
- يستنشق الخارق. إعادة تعليق الخلايا في 6-10 مل من DPBS لإزالة الوسائط المتبقية.
- الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 500 × ز.
- يستنشق ال [سوبرنتنت] و [رلّووت] في [بغم]. خلايا اللوحة على أطباق زراعة الأنسجة البلاستيكية المعالجة. تغذية مع BEGM الطازجة كل 2-3 أيام.
- زراعة الخلايا في حاضنة رطبة الحفاظ على 37درجة مئوية مع 5٪ CO 2.
7- حفظ الخلايا بالتبريد
ملاحظة: يمكن تحقيق الحفظ بالتبريد للخلايا من تعليق خلية واحدة تنشأ إما من الخلايا الساليسفيرة أو الخلايا المزروعة أحادية الطبقة.
- عد الخلايا على مقياس الدم لحساب الكمية الإجمالية للخلايا الموجودة.
- الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 500 × ز.
- يستنشق الخارق. إعادة تعليق بيليه في BEGM مع 10٪ ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO). يجب أن يكون تركيز الخلايا 2 × 106 خلايا / مل إلى 10 × 106 خلايا / مل.
- خلايا Aliquot في أنابيب تخزين المبردة المعقمة. وضع الأنابيب في رف رغوة معزول وحضانة في -80 درجة مئوية بين عشية وضحاها لتجميد الخلايا ببطء.
- في اليوم التالي، وضع أنابيب في النيتروجين السائل للتخزين على المدى الطويل.
ملاحظة: يجب إذابة الخلايا بسرعة عند 37 درجة مئوية. عند الذوبان، يجب أن تكون الكريات الخلايا في 500 × ز وإزالة وسائل الإعلام التي تحتوي على DMSO قبل الطلاء.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
بعد يومين أو ثلاثة أيام من طلاء الخلايا من الأنسجة المهضومة على BMM، سوف تشكل الخلايا بسهولة مجموعات صغيرة من شأنها أن تستمر في التوسع في حجم يصل إلى 15-20 خلية لكل كتلة (الشكل2A). وعادة ما ينظر إلى الحطام الخلوي والخلايا الميتة المنفصلة وينبغي إزالتها عن طريق التبذير وتجديدها مع وسائل الإعلام الطازجة. وسوف تستمر الخلايا في الانتشار كساليسفيرس لمدة 3-10 أيام، أو طالما أن طبقة BMM لا تزال سليمة. في بعض الأحيان، بسبب انهيار جزئي من BMM، سوف تصبح الخلايا تعلق على البلاستيك الكامنة وتبدأ في التكاثر كطبقة أحادية. سوف Salispheres نمت على BMM تظهر تباين في الحجم والتعقيد الهيكلي. ويمكن الحفاظ على الساليسفيرات عن طريق تمريرها إلى BMM المعدة حديثا كما هو موضح في البروتوكول. في غضون 2-3 أيام بعد مرورها على BMM جديدة، والخلايا إصلاح في المجالات. كما يمكن أن تكون خلايا ساليسفير مطلية على البلاستيك المعالج بزراعة الخلايا وتزرع كطبقة أحادية حيث تظهر مورفولوجيا متسقة مع الخلايا ذات الأصل الظهاري كما هو موضح في الشكل 2B. في حين أن الخلايا الساليسفير نمت على BMM كما ساليسفيرس من المرجح أن تحافظ على النمط الظاهري أكثر تميزا من الأنسجة اللعابية، والخلايا نمت كطبقة أحادية يمكن أن تكون مفيدة لبعض البروتوكولات التجريبية. وسيتعين إجراء توصيف أوسع نطاقاً لتحديد إلى أي مدى تحافظ الخلايا على النمط الظاهري اللعابي عندما تزرع على طبقة أحادية بالمقارنة مع الخلايا المزروعة كساليسفيرات.
الشكل 1 المعالجة الأولية للغدد تحت الفك السفلي البشري لإعداد الساليسفير. أنسجة الغدة اللعابية المقتطعةحوالي 1 سم في القطر (A) يتم قطع ميكانيكيا إلى قطع أصغر باستخدام مقص حاد (B) حتى يتم فصل الغدة إلى قطع قابلة للهضم من حوالي 1-2 ملم في الحجم (C). ثم يتم احتضان القطع الغدية في محلول ديسباسي / كولاجيناز لمدة 30-90 دقيقة مع مرور دوري من خلال الماصات المصليةحتى يتم هضم العينة إلى خلايا واحدة في الغالب أو كتل صغيرة من الخلايا (D ). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2 يمكن أن تكون خلايا ساليسفير البشرية الأولية مستوّلة كمجالات على مصفوفة غشاء الطابق السفلي أو كطبقة أحادية على أطباق زراعة الخلايا المعالجة. بعد الهضم الأولي للأنسجة اللعابية، يتم طلاء الغدد المهضومة مباشرة على BMM ومثقفة لمدة 3-10 أيام. يتم تغذية الخلايا كل 2-3 أيام لتوفير المواد الغذائية الطازجة. بمجرد تطوير الساليسفيرات الأولية، يمكن هضم المصفوفات في محلول ديسباسي / كولاجيناز، trypsinized لتوليد خلايا واحدة، وإعادة مطلي علىBMM الطازجة حيث أنها إصلاح في المجالات (أ) أو مطلي على أطباق ثقافة الخلية حيث أنها تشكل بسهولة مورفولوجيا المرصوفة بالحصى نموذجيةمن أحادية الظهارية (B). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يمثل الخلل اللعابي مصدر قلق لنوعية الحياة لأولئك الذين يعانون من متلازمة Sjögren وكذلك أولئك الذين يخضعون للعلاج الإشعاعي للسرطانات المجاورة للغدد اللعابية3،4،5، 16. واحد العلاج المقترح لعلاج هؤلاء المرضى هو زراعة الخلايا الجذعية اللعابية الوظيفية أو الأعضاء في المختبر، والتي يمكن بعد ذلك إدراجها في الغدة اللعابية التالفة لتحل محل الأنسجة المصابة9. بالإضافة إلى ذلك، غالباً ما تكون الغدد اللعابية موقعًا للثبات وانتقال مسببات الأمراض البشرية. على سبيل المثال، من المعروف أن فيروسات الهربس البشري مثل الفيروس المضخم للخلايا البشرية (HCMV) تصيب وتستخدم الغدد اللعابية واللعاب لنقل الفيروس إلى المضيفين الجدد7و8و17. الآليات الجزيئية الكامنة وراء الثبات الفيروسي في الغدة اللعابية والحركة إلى اللعاب لا تزال غير معروفة. وسوف يوفر تطوير أنظمة الخلايا اللعابية في المختبر نظام نموذج أساسي لاستكشاف هذه المعلومات الميكانيكية.
نبلغ هنا بروتوكول قوي لتوليد اللعاب الأولية "salispheres" التي يمكن زراعتها في المختبر إما كمجموعات على BMM أو كطبقات أحادية على البلاستيك. القدرة على زراعة ونشر الخلايا الظهارية الغدة اللعابية البشرية الأولية يمثل منصة هامة التي يمكن للباحثين (1) يحتمل تطوير علاجات بديلة للمرضى الذين يعانون من نقص الغدة اللعابية الذين لا توجد خيارات أخرى موجودة ، ولكن كان هناك الكثير من (2) فهم أفضل فيزيولوجيا الأساسية الكامنة وراء تطور الغدة اللعابية، والانتشار، وإفراز، وما إلى ذلك؛ و(3) تحديد الآليات التي تستخدمها مسببات الأمراض لتكرار وانتشارها إلى المضيفين الجدد.
باستخدام هذه الثقافات الخلايا اللعابية، وقد أبلغنا أن HCMV يتطلب مجمع البروتين السكري الخماسي للعدوى الأولية وأيضا أن الفيروس لا يزال قائما لفترة طويلة، تذكرنا ما يحدث مع HCMV في الجسم الحي7. وعلاوة على ذلك، كشفت دراساتنا الوظيفية أن الثقافات اللعابية لا تحتوي على الخلايا الليفية الملوثة كما فيلبلاف المدارية، مختبر الفيروسات تكييفها تفشل في العدوى وتكرار في الخلايا المشتقة اللعابية الأولية7. في حين أننا استخدمنا هذا البروتوكول لتوليد الخلايا لتقييم النسخ المتماثل HCMV وانتشارها في نظام اللعاب الأولية، يمكن بسهولة تكييف هذا البروتوكول لتوليد الخلايا اللعابية مفيدة لمجموعة واسعة من المواضيع البحثية المذكورة أعلاه. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن تكييف هذا البروتوكول ليتناسب مع احتياجات وميزانية كل باحث على حدة. في حين أننا لم نتحقق من صحة الظروف الأخرى بأنفسنا، فقد أبلغ آخرون عن نجاح نمو الخلايا الظهارية اللعابية في ظل ظروف إعلامية مختلفة. على سبيل المثال، تم الإبلاغ عن وسيط النسر المعدل (DMEM): F12 مع عامل نمو البشرة وعامل نمو الخلايا الليفية-2 لتعزيز النمو القوي للخلايا اللعابية18. بدلا من ذلك، نام وآخرون استخدام الحد الأدنى من وسائل الإعلام الأساسية المكملة مع مصل البقر الجنين قبل نقل الخلايا إلى نسخة خالية من المصل من وسائل الإعلام نمو الخلايا الكيراتينية وأفادت النمو القوي للخلايا اللعابية على البلاستيك15. وبالتالي، لا يبدو أن الخلايا الظهارية اللعابية تظهر شرطا مطلقا لنوع واحد من وسائل الإعلام معينة، ولكن يبدو بدلا من ذلك أن تنمو وتنتشر على عدد من أنواع وسائل الإعلام المتاحة تجاريا.
بالإضافة إلى صياغة وسائل الإعلام، يمكن تقييم تركيبات غشاء الطابق السفلي مختلفة لقدراتهم على دعم نمو الخلايا الظهارية اللعابية قوية. نمو الخلايا على مصفوفات الطابق السفلي المتاحة تجاريا التي تحتوي على غشاء تسفر بسهولة salispheres ويوفر نظام زراعة بسيطة، وإن كانت مكلفة7،19. وعلى غرار تلك التي نوقشت أعلاه فيما يتعلق باختيار وسائل الإعلام لنمو الخلايا، أبلغ الباحثون عن نمو وتطور الساليسفيرات على عدد من المصفوفات المختلفة ونظم هيدروجيل. هيدروجيلات مصنوعة من حمض الهيالورونيكس لها فائدة إضافية في خلق مصفوفة خارج الخلية crosslinked مع المكونات الكيميائية المطلوبة لدراسة تفاعلاتها وآثارها على الخلايا. باستخدام الخلايا اللعابية المشتقة من الأنسجة البشرية الأولية، أفاد سرينيفاسان وآخرون عن نجاح في نمو وصيانة خلايا السلف اللعابية في هيدروجيلات حمض الهيالورونيكس. ولوحظ زيادة نمو الخلايا السلف كذلك عندما تم دمج هيدروجيلات مع الببتيدات المستمدة من بروتينات غشاء الطابق السفلي مثل بيرلكان ولامينين20. نظام آخر تم تطويره مؤخرا من قبل فوريدا وآخرون تقرير باستخدام "الكهربائي الغزل" لتطوير سقالة نانوفيبر مصنوعة من بولي (حمض اللاكتيك-co-غليكوليك) (PLGA). تم العثور على هيدروجيلات PLGA مع الإيلاستين المضافة لتعزيز بسهولة تطوير نظام الخلايا تحت الفك السفلي الاستقطاب، والتي قد تكون مفيدة في التأكد من كيفية تأثير استقطاب الخلايا البيولوجيا اللعابية والكيمياء الحيوية21.
في هذا البروتوكول، قدمنا طريقة بسيطة لعزل ونمو الخلايا الظهارية المشتقة من الغدة اللعابية الأولية. ينتج عن هذا البروتوكول النمو السريع لخلايا الظهارية السكانية التي يمكن الاحتفاظ بها في المتوسط لمدة 5-8 مقاطع. من المهم مراقبة الأنسجة أثناء العلاج مع ديسباس / كولاجيناز لضمان الهضم المناسب كما هو مذكور في البروتوكول. الهضم غير المكتمل سوف يقلل بشدة من عدد الساليسفيرات التي تعيش. من المهم أيضًا مراقبة الثقافات لنمو الخلايا الليفية التي لها شكل ممدود ومتميزة جدًا عن الخلايا الظهارية المضلعة التي تنمو عادة ً في بقع منفصلة أو كتل. لقد استخدمنا هذا البروتوكول لعزل الخلايا الظهارية من البشر والفئران، ولكن يبدو من المرجح أنه يمكن تكييفه للاستخدام مع أنظمة الثدييات الأخرى. وعلاوة على ذلك، يمكن تعديل هذا البروتوكول مرة أخرى باستخدام خطوات تنقية إضافية تستند إلى تعبير علامات سطح الخلية وقياس التدفق الخلوي الذي يمكن أن يؤدي إلى توليد مجموعات خلايا أولية أكثر تجانساً. وبالمثل، يمكن استخدام هذا البروتوكول لتحديد الكيفية التي تؤدي بها الوسائط المختلفة أو تركيبة المصفوفة/المواد المائية إلى نمو أنواع محددة من الخلايا عند توليد الساليسفيرات لأول مرة. وفي الختام، ينبغي أن يكون هذا البروتوكول بمثابة منصة انطلاق قوية لعزل ونمو الخلايا اللعابية الأولية التي يمكن تكييفها بسهولة مع مجموعة واسعة من البروتوكولات التجريبية ومجالات البحوث.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ولا يبلغ أصحاب البلاغ عن أي شيء يكشفون عنه.
Acknowledgments
ونود أن نشكر جيمس ب. بريدجز على تقديم توجيهات هامة بشأن المنهجيات التي ينطوي عليها زراعة الخلايا الأولية. ماثيو ج. بيوكلير بدعم من المعاهد الوطنية للتدريب الصحي منحة T32-ES007250. كما تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة المنح R01-AI121028 و R21-DE026267 الممنوحة لوليام ميلر.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mm culture dishes | Thermo Scientific | 172931 | |
| 15 mL conical tubes | Thermo Scientific | 339651 | |
| 50 mL conical tubes | Thermo Scientific | 339653 | |
| Bronchial Epithelial Cell Growth Media | Lonza | CC-3171 | Add bullet kit as per manufacturer's instructions. Supplement with 20 mL of charcoal stripped serum. |
| Cell strainer 70 µm nylon mesh | Fisher | 22-363-548 | |
| Charcoal stripped fetal bovine serum | Gibco | 12676-029 | |
| Collagenase type III | Worthington | LS004182 | Store at 4 °C. |
| Cryogenic Tube | Fisher | 5000-0020 | |
| Dispase | Cell Applications | 07923 | Dissolve collagenase to make a 0.15% (w/v) stock. Filter sterilize then store at -20 °C. |
| Dissecting scissors | Fisher | 08-940 | |
| Dulbecco phosphate buffered saline | Corning | 55-031-PC | |
| General Chemicals | Sigma | ||
| PathClear Basement membrane extract | Cultrex | 3432-005-01 | Thaw at 4 °C at least 24 hr prior to use. Always handle on ice. |
| Six-well culture dishes | Falcon | 353046 | |
| Surgical forceps | Fisher | 22-079-742 | |
| Trypsin-EDTA solution | Corning | 25-052-CI |
References
- Kessler, A. T., Bhatt, A. A. Review of the Major and Minor Salivary Glands, Part 1: Anatomy, Infectious, and Inflammatory Processes. Journal of Clinical Imaging Science. 8, 47 (2018).
- Holmberg, K. V., Hoffman, M. P. Anatomy, Biogenesis and Regeneration of Salivary Glands. Monographs in Oral Science. Ligtenberg, A. J. M., Veerman, E. C. I. 24, S. KARGER AG. 1-13 (2014).
- Vissink, A., et al. Prevention and Treatment of the Consequences of Head and Neck Radiotherapy. Critical Reviews in Oral Biology & Medicine. 14, 213-225 (2003).
- Gualtierotti, R., Marzano, A., Spadari, F., Cugno, M. Main Oral Manifestations in Immune-Mediated and Inflammatory Rheumatic Diseases. Journal of Clinical Medicine. 8, 21 (2018).
- Tsukamoto, M., Suzuki, K., Takeuchi, T. Ten-year observation of patients with primary Sjögren's syndrome: Initial presenting characteristics and the associated outcomes. International Journal of Rheumatology. Dis. , (2018).
- Dirix, P., Nuyts, S., Van den Bogaert, W. Radiation-induced xerostomia in patients with head and neck cancer: A literature review. Cancer. 107, 2525-2534 (2006).
- Morrison, K. M., et al. Development of a primary human cell model for the study of human cytomegalovirus replication and spread within salivary epithelium. Journal of Virology. , (2018).
- Pomeroy, C., Englund, J. A. Cytomegalovirus: epidemiology and infection control. American Journal of Infection Control. 15, 107-119 (1987).
- Maimets, M., et al. Long-Term In Vitro Expansion of Salivary Gland Stem Cells Driven by Wnt Signals. Stem Cell Reports. 6, 150-162 (2016).
- Varghese, J. J., et al. Salivary gland cell aggregates are derived from self-organization of acinar lineage cells. Archives of Oral Biology. 97, 122-130 (2019).
- Maruyama, C., Monroe, M., Hunt, J., Buchmann, L., Baker, O. Comparing human and mouse salivary glands: A practice guide for salivary researchers. Oral Diseases. , (2018).
- Lin, L. C., et al. Cross-contamination of the human salivary gland HSG cell line with HeLa cells: A STR analysis study. Oral Diseases. 24, 1477-1483 (2018).
- Tran, S. D., et al. Primary Culture of Polarized Human Salivary Epithelial Cells for Use in Developing an Artificial Salivary Gland. Tissue Engineering. 11, 172-181 (2005).
- Pringle, S., et al. Isolation of Mouse Salivary Gland Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. , (2011).
- Nam, H., et al. Characterization of Primary Epithelial Cells Derived from Human Salivary Gland Contributing to in vivo Formation of Acini-like Structures. Molecules and Cells. 41, 515-522 (2018).
- Vissink, A., Jansma, J., Spijkervet, F. K. L., Burlage, F. R., Coppes, R. P. Oral Sequelae of Head and Neck Radiotherapy. Critical Reviews in Oral Biology & Medicine. 14, 199-212 (2003).
- Cannon, M. J., et al. Repeated measures study of weekly and daily cytomegalovirus shedding patterns in saliva and urine of healthy cytomegalovirus-seropositive children. BMC Infect. Dis. 14, (2014).
- Pringle, S., et al. Human Salivary Gland Stem Cells Functionally Restore Radiation Damaged Salivary Glands: Hyposalivation Cell Therapy. STEM CELLS. 34, 640-652 (2016).
- Maria, O. M., Maria, O., Liu, Y., Komarova, S. V., Tran, S. D. Matrigel improves functional properties of human submandibular salivary gland cell line. International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 43, 622-631 (2011).
- Srinivasan, P. P., et al. Primary Salivary Human Stem/Progenitor Cells Undergo Microenvironment-Driven Acinar-Like Differentiation in Hyaluronate Hydrogel Culture: Differentiation of Salivary Stem/Progenitor Cells. STEM CELLS Translational Medicine. 6, 110-120 (2017).
- Foraida, Z. I., et al. Elastin-PLGA hybrid electrospun nanofiber scaffolds for salivary epithelial cell self-organization and polarization. Acta Biomaterialia. 62, 116-127 (2017).
