Summary
Nós apresentamos um método para isolar e cultivar pilhas epithelial glândula-derivadas humanas preliminares do salivar. Estas pilhas exibem testes padrões da expressão de gene consistentes com eles que são da origem epithelial salivar e podem ser crescidos como salispheres em matrizes da membrana do porão derivadas das pilhas do tumor de engelbreth-Holm-enxame ou como monocamadas em pratos tratados da cultura.
Abstract
As glândulas salivares são um local de interesse significativo para os pesquisadores interessados em múltiplos aspectos da doença humana. Um objetivo dos investigadores é restaurar a função das glândulas danificadas por terapias de radiação ou devido às patologias associadas com Sjögren ' síndrome de s. Um segundo objetivo dos pesquisadores é definir os mecanismos pelos quais os vírus se replicam dentro do tecido glandular, onde eles podem então obter acesso aos fluidos salivares importantes para a transmissão horizontal. Esses objetivos destacam a necessidade de um modelo de glândula salivar robusta e acessível in vitro que possa ser utilizado por pesquisadores interessados nas áreas de pesquisa acima mencionadas, bem como relacionadas. Aqui nós discutimos um protocolo simples para isolar pilhas epithelial das glândulas salivares humanas e para propagá-las in vitro. Nosso protocolo pode ser otimizado para atender às necessidades de estudos individuais. Resumidamente, o tecido salivar é mecanicamente e enzimaticamente separado para isolar células individuais ou pequenos aglomerados de células. A seleção para pilhas epithelial ocorre chapeando em uma matriz da membrana do porão na presença dos meios aperfeiçoados para promover o crescimento epithelial da pilha. Estas culturas resultantes podem ser mantidas como aglomerados tridimensionais, denominados "salispheres", ou cultivados como monocamada em pratos de cultura de tecidos plásticos tratados. Este protocolo resulta no crescimento de uma população heterogénea de células principalmente epiteliais que podem ser propagadas para 5-8 passagens (15-20 duagações populacionais) antes de se submeterem à senescência celular.
Introduction
Em mamíferos, as glândulas salivares são organizadas em 3 pares de glândulas salivares principais: as glândulas parótida, submandibular e sublingual. Existe também uma série de glândulas menores localizadas na língua e espalhadas por toda a cavidade oral1. As glândulas principais são responsáveis para o volume de maioria de saliva produziu2. Além de fornecer proteção antimicrobiana por meio de fatores secretados, a saliva é importante no processo de mastigação e lubrificação de alimentos à medida que passa pelo esôfago2. Como tal, a disfunção da glândula salivar representa um problema médico em que os doentes que são incapazes de produzir saliva suficiente são mais propensos a desenvolver doenças, como cavidades dentárias ou candidíase oral3. Adicionalmente, a redução da saliva resulta em maior dificuldade em comer e digerir os alimentos com um impacto significativo na qualidade de vida.
A disfunção da glândula salivar é encontrada principalmente em pacientes que sofrem de síndrome de Sjögren, uma desordem auto-imune, ou em pacientes com câncer de cabeça e pescoço que passaram por terapia de irradiação3,4,5, a 6. O ácinos secretora danificado dentro das glândulas em conseqüência da autoimunidade ou da terapia de radiação não se submete à autorenovação, que conduz a um paciente que vive com dano irreversível6. O estudo das glândulas salivares também tem ganhou a atenção ou pesquisadores interessados em mecanismos de patogênese viral. Alguns patógenos, como o citomegalovírus humano (HCMV), persistentemente replicam dentro das glândulas salivares, o que permite a transmissão do vírus nascente para um novo hospedeiro via saliva7,8. Assim, há uma necessidade não satisfeita de desenvolver modelos in vitro robustos e reprodutíveis do tecido da glândula salivar para abordar e compreender uma disposição diversa de problemas médicos.
Vários modelos do sistema de glândula salivar Murina têm sido utilizados como ponto de partida para compreender e caracterizar as diferentes células epiteliais que formam as glândulas salivares9,10. Existem diferenças óbvias e importantes entre as glândulas salivares humanas e murinas11. Mais notavelmente, a glândula parótida humana é maior em relação à glândula submandibular, enquanto o camundongo submandibular e a parótida são muito semelhantes no tamanho1,2,11. Quando as linhas de pilha submandibular humanas imortalizado existirem, há umas preocupações principais que as pilhas imortalized não mantêm exatamente o phenotype do tecido preliminar e das preocupações secundárias que as pilhas imortalized não são derivadas realmente do epitélio salivar próprio12. Por estas razões há um interesse e uma necessidade de estudar o tecido salivar preliminar dos seres humanos.
Aqui nós descrevemos um protocolo para isolar pilhas epithelial preliminares das glândulas salivares humanas para a cultura do tecido. Nosso protocolo é baseado nas obras de Pringle et al. e Tran et al. com modificações feitas para simplificar geralmente seus procedimentos13,14. Primeiro, enquanto o protocolo de Tran et al. exige uma longa incubação de cinco horas para digerir enzimaticamente o tecido salivar, nosso protocolo modificado tem sido bem-sucedido com pouco tempo de incubação de uma hora, semelhante ao de Pringle et al. Em segundo lugar, nós usamos enzimas diferentes para a digestão do tecido, o mais notàvelmente nós não usamos o tripsina como é usado no protocolo original de Tran et al., mas usamos uma mistura do Dispase e do Collagenase. Nós preferimos evitar o tripsina nas etapas iniciais da digestão como um estudo recente sugeriu que a digestão inicial do tecido salivar pela tripsina resulte na viabilidade reduzida da pilha, possivelmente pela perda de uma população rara da pilha de haste15. Por fim, nós cultive os salispheres na superfície da matriz da membrana do porão (BMM) usando meios comercialmente disponíveis originalmente formulados para a propagação de pilhas epithelial brônquicas. Nosso protocolo pode ser usado para isolar as células salivares das glândulas parótidas, submandibulares e sublinguais. Estas pilhas expressam a amilase salivar e outros genes específicos salivares que indicam que mantêm um phenotype similar àquele de pilhas epithelial acinar salivares7. Nós geramos com sucesso culturas salivares de > 50 amostras preliminares do tecido humano usando esta metodologia. Além disso, as pilhas salivares preliminares podem facilmente ser cryopreservado para o uso em uma data mais atrasada.
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Protocol
Estes protocolos e estudos foram revistos e aprovados pelo Conselho de revisão institucional da Universidade de Cincinnati (Federal-Wide Assurance #00003152, protocolo IRB 2016-4183). O tecido salivar é geralmente resected em muitos procedimentos cirúrgicos da cabeça e da garganta e é geralmente não involvido pelo processo maligno. Tipicamente, o tecido da glândula salivar recentemente resected é usado dentro de 2-4 h após a remoção do paciente (Figura 1a).
1. preparação do reagente
-
Meio de crescimento de células epiteliais brônquicas (BEGM)
- Adicione componentes do kit fornecido pelo fabricante (consulte a tabela de materiais).
- Lave cada tubo uma vez com a mídia de base para garantir a transferência completa de componentes. Em seguida, adicione o carvão vegetal despojado soro bovino fetal para fazer uma concentração final de 4% soro.
-
Tampão de lise do glóbulo vermelho (RBC)
- Para fazer o estoque 10x, adicione 40,15 g de NH4Cl, 5,0 g de NaHCO3, e 0,186 g de ácido etilenodiaminotraacético (EDTA) e trazer até um volume final de 200 ml usando DH2o. Em seguida, filtrar esterilizar e armazenar a 4 ° c.
- Diluir para uma concentração de trabalho de 1x em estéril dH2o antes de usar.
-
Solução de dissociação
- Para um frasco de 100 ml de solução de Dispase (ver a tabela de materiais) adicionar 0,15 g de colagenase tipo III. Após a colagenase ter sido totalmente dissolvida, o filtro esteriliza a nova solução e a alíquota. Conservar a-20 ° c.
2. digestão do tecido
- Usando uma placa da cultura do tecido de 100 milímetros, mechanicallymince o tecido em partes finas ~ 1-2 milímetros no tamanho usando autoclave-esterilizou tesouras dissecando e fórceps cirúrgico (Figura 1b,C). O tecido conjuntivo entre as peças deve ser cortado para garantir a separação adequada e facilidade em etapas adicionais.
- Adicionar 6 mL da solução Dispase/Collagenase ao tecido picado. Em seguida, incubar a 37 ° c por aproximadamente 30 min a 1 h.
- Interrompa o tecido introduzindo pipetagem com uma pipeta serológica de 5 mL 15-20 vezes.
- Incubar a 37 ° c por mais 30 min a 1 h.
- Repita as etapas 2,3 e 2,4 duas-três vezes mais ou até que o tecido se assemelha a uma pasta e pode facilmente passar através da abertura da pipeta (Figura 1D).
Nota: O tamanho de partida do espécime do tecido e como a finura do tecido que picar determinará quantas vezes uma precisa de repetir etapas 2,3 e 2,4. Tipicamente, nós recebemos o tecido aproximadamente 1 cm x 1 cm no tamanho. Adicionalmente, um pode monitorar a dissociação do tecido usando um microscópio invertido padrão da cultura do tecido para seguir o progresso da dissociação da pilha do tecido. Os conjuntos pequenos das pilhas são ideais para o conseqüência inicial de pilhas salivares como salispheres.
3. poços de revestimento com matriz da membrana do porão
Nota: a matriz de membrana basal (BMM) deve ser descongelada durante a noite a 4 ° c no dia anterior ao seu uso. Uma vez descongelado, o BMM deve ser constantemente mantido no gelo ou a 4 ° c, pois irá solidificar rapidamente (ou seja, formar um gel) a temperaturas mais quentes. Adicionalmente, o cuidado deve ser tomado se as amostras foram refrigeradas no gelo antes do chapeamento em BMM porque as amostras frias "derreterão" o BMM e expõem pilhas ao prato plástico.
- Pipeta lentamente BMM (veja a tabela dos materiais) em cada poço para ser revestido. Uniformemente e lentamente distribuir o BMM sobre o poço.
Nota: geralmente, nós usamos 500 μL por cada poço de uma placa de seis poços, mas este volume pode ser ajustado para o uso em outras variações das placas tais como 12-well ou 24-well, ou como desejado para uns hydrogels mais grossos ou mais finos. - Incubar as chapas revestidas a 37 ° c durante, pelo menos, 15 minutos antes da utilização para permitir a solidificação do tempo de BMM.
4. filtragem de tecido não digerido, lise de RBC, e chapeamento de pilha
- Transfira o homogeneato de tecido da etapa 2,5 para um tubo cônico de 15 mL. Lave a placa uma vez com 6 mL de soro fisiológico tamponado com fosfato de Dulbecco (DPBS) para transferir as células restantes.
- Filtre o homogeneate em um tubo cônico de 50 mL através de um filtro de célula de malha de nylon de 70 μm para remover o tecido não digerido. Centrifugar as células tensas por 5 min a 500 x g.
- Diluir 10x tampão de Lise RBC em dH estéril2o para fazer uma solução de trabalho 1x.
- Aspirar o sobrenadante. Em seguida, Ressuspender o pellet celular em 10 mL de 1x RBC lise tampão. Incubar por 5 min a 37 ° c.
- Adicionar 20-25 mL de DPBS para neutralizar o tampão de lise de RBC e minimizar a lise de células salivares. Centrifugador por 5 min a 500 x g.
Nota: após o tratamento com tampão de lise de RBC, a pelota da pilha deve ser branca. A cor vermelha na pelota indica que nem todos os RBC foram totalmente lisados. Repita os passos 4,4 a 4,5 se necessário para a Lise completa de todos os RBC. - Aspirar o sobrenadante. Resuspend o pellet em 1-2 mL de BEGM por poço, em seguida, colocar as células resrepended em Poços revestidos de BMM. Incubar a 37 ° c.
- Uma vez chapeado em BMM, as células se formam em estruturas esféricas ou "salispheres" durante um período de 2-3 dias. As pilhas podem ser mantidas como salispheres por aproximadamente 5-7 dias antes que o BMM comece a degradar permitindo que as pilhas acessem e aderem ao plástico e cresçam como um monocamada.
5. subculturando os salispheres e manutenção em BMM
- Aspirar meios dos poços, a seguir adicione 1 mL da solução do Dispase/Collagenase a cada poço e incubar em 37 ° c para ~ 15 minutos ou até que o BMM dissolveu na maior parte.
- Transfira as células para um tubo cônico de 15 mL e lave os poços uma vez com o DPBS para obter as células restantes. Centrifugador por 5 min a 500 x g.
- Aspirar o sobrenadante. Suspender a pelota em 2 mL de tripsina, em seguida, incubar a 37 ° c por 15 min.
- Neutralize a tripsina usando qualquer mídia completa contendo 10% de soro. Centrifugador por 5 min a 500 x g.
- Aspirar o sobrenadante. Ressuscite as células no DPBS para remover meios residuais, tripsina e soro. Centrifugador por 5 min a 500 x g.
- Aspirar o sobrenadante. Resuspend no begm e na placa as pilhas ressuscipended em pratos de cultura BMM-revestidos solidificado. As células ressuscipended também podem ser chapeadas diretamente na cultura celular pratos tratados para a proliferação como uma monocamada. Para mais informações sobre o crescimento de células salivares como monocamada, ver secção 6. As células cultivadas em BMM ou em plástico devem ser alimentadas com BEGM fresco a cada 2 – 3 dias.
- Cultura as pilhas em uma incubadora humidificada mantida em 37 ° c com 5% CO2.
6. subculturando os salispheres em pratos plásticos tratados da cultura do tecido
Nota: se a manutenção de células como monocamada em plástico, comece nesta etapa. O seguinte protocolo aplica-se às células que crescem em um prato de 100 mm.
- Aspirar a mídia. Lave uma vez com o DPBS para remover a mídia residual.
- Adicione 2 mL de tripsina e, em seguida, incubar a 37 ° c durante 15 min, ou até as células terem sido totalmente destacadas.
- Neutralize a tripsina usando 4 mL de qualquer mídia completa contendo 10% de soro. Transfira as células para um tubo cônico de 15 mL.
- Lave a placa uma vez com aproximadamente 5 mL de DPBS para recolher as células restantes. Centrifugador por 5 min a 500 x g.
- Aspirar o sobrenadante. Ressuscite as células em 6-10 mL de DPBS para remover os meios residuais.
- Centrifugador por 5 min a 500 x g.
- Aspirar o sobrenadante e ressuscito em BEGM. Pilhas de placa em pratos plásticos tratados da cultura do tecido. Alimente com BEGM fresco cada 2-3 dias.
- Cultura as pilhas em uma incubadora humidificada mantida em 37 ° c com 5% CO2.
7. criopreservação das células
Nota: a criopreservação das células pode ser realizada a partir de uma única célula de suspensão originada a partir de qualquer salisphere ou monocamada células cultivadas.
- Conte as células em um hematociômetro para calcular a quantidade total de células presentes.
- Centrifugador por 5 min a 500 x g.
- Aspirar o sobrenadante. Ressuscitem o pellet em BEGM com 10% dimetil sulfóxido (DMSO). A concentração de células deve ser de 2 x 106 células/ml para 10 x 106 células/ml.
- Células alíquotas em tubos de armazenamento criogênicos estéreis. Coloc os tubos em uma cremalheira isolada da espuma e incubar em-80 ° c durante a noite para congelar lentamente as pilhas.
- No dia seguinte, coloque os tubos em nitrogênio líquido para armazenamento a longo prazo.
Nota: as células devem ser descongelados rapidamente a 37 ° c. Ao descongelar, as células devem ser peletizadas em 500 x g e a mídia contendo DMSO removida antes do chapeamento.
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Representative Results
Dois-três dias após o chapeamento de células de tecido digerido para BMM, as células prontamente formam pequenos clusters que continuarão a expandir em tamanho até 15-20 células por cluster (Figura 2a). Os restos celulares e as pilhas inoperantes destacadas são vistos tipicamente e devem ser removidos aspirando e reabastecendo com meios frescos. As células continuarão a proliferar como salispheres por cerca de 3-10 dias, ou contanto que a camada de BMM permaneça intacta. Ocasionalmente, devido à repartição parcial do BMM, as pilhas tornar-se-ão Unidas ao plástico subjacente e começam a proliferar como um monolayer. Os salispheres crescidos no BMM exibirão a variabilidade no tamanho e na complexidade estrutural. Os salispheres podem ser mantidos passando-os para o BMM preparado na hora, conforme descrito no protocolo. Dentro de 2-3 dias após a passagem para BMM fresco, as células vão reformar em esferas. As pilhas de salisphere podem igualmente ser chapeadas no plástico cultura-Tratado pilha e ser crescidas como um monocamada onde exibem a morfologia consistente com as pilhas da origem epithelial como mostrado na Figura 2b. Quando as pilhas do salisphere crescidas em BMM como salispheres forem prováveis manter um phenotype mais característico do tecido salivar, as pilhas crescidas como um monocamada podem ser vantajosas para alguns protocolos experimentais. Uma caracterização mais extensiva precisará de ser executada para determinar a que extensão as pilhas mantêm um phenotype salivar quando crescido em um monocamada em comparação às pilhas crescidas como salispheres.
Figura 1 : Processamento inicial de glândulas submandibulares humanas para a preparação do salisphere. O tecido da glândula salivar extirpada aproximadamente 1 cm no diâmetro (A) é triturado mecanicamente em partes menores usando tesouras afiadas (B) até que a glândula esteja separada em partes digestíveis de aproximadamente 1-2 milímetros no tamanho (C). As peças glandulares são então incubadas na solução de Dispase/colagenase por 30-90 min com passagem periódica através de Pipetas sorológicas até que a amostra seja digerida para a maioria das células únicas ou pequenos aglomerados de células (D). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : As pilhas humanas preliminares do salisphere podem ser cultivadas como esferas na matriz da membrana do porão ou como um monocamada em pratos tratados da cultura da pilha. Após a digestão inicial do tecido salivar, as glândulas digeridas são chapeadas diretamente no BMM e cultivadas por 3-10 dias. As células são alimentadas a cada 2-3 dias para fornecer nutrientes frescos. Uma vez que os salispheres preliminares se desenvolvem, as matrizes podem ser digeridas na solução do Dispase/Collagenase, tripsinizadas para gerar únicas pilhas, e re-plated no BMM fresco onde refazem em esferas (A) ou chapearam em pratos da cultura da pilha onde forma prontamente uma morfologia de paralelepípedos típica de uma monocamada epitelial (B). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
A disfunção salivar representa uma preocupação com a qualidade de vida para aqueles que sofrem de síndrome de Sjögren, bem como aqueles submetidos a radioterapia para cânceres adjacentes às glândulas salivares3,4,5, a 16. Uma terapia propor para tratar estes pacientes é crescer pilhas de haste salivares funcionais ou organóides in vitro, que podem então ser introduzidos na glândula salivar danificada para substituir o tecido afetado9. Adicionalmente, as glândulas salivares são frequentemente um local para a persistência e a transmissão de micróbios patogénicos humanos. Por exemplo, os Herpesvirus humanos tais como o citomegalovírus humano (HCMV) são sabidos para infectar e usar as glândulas salivares e a saliva para transmitir o vírus aos anfitriões novos7,8,17. Os mecanismos moleculares subjacentes à persistência viral na glândula salivar e o movimento à saliva permanecem desconhecidos. O desenvolvimento de sistemas de células salivares in vitro proporcionará um sistema de modelo essencial para explorar esta informação mecanicista.
Nós relatamos aqui um protocolo robusto para gerar "salispheres salivares preliminares" que podem ser crescidos in vitro como aglomerados em BMM ou como monocamadas no plástico. A capacidade de cultura e propagação de células epiteliais da glândula salivar humana primária representa uma importante plataforma em que os pesquisadores podem (1) potencialmente desenvolver terapias de reposição para pacientes com deficiências da glândula salivar para quem nenhuma outra opção Existem (2) compreender melhor a fisiologia básica subjacente ao desenvolvimento da glândula salivar, proliferação, secreção, etc.; e (3) definir mecanismos usados por patógenos para replicar e se espalhar para novos hospedeiros.
Usando estas culturas de pilha salivar, nós temos relatado que HCMV exige o complexo da glicoproteína pentamérica para a infecção preliminar e igualmente que o vírus persiste por um período prolongado, reminiscente do que ocorre com o HCMV in vivo7. Além disso, nossos estudos funcionais revelaram que as culturas salivares não contêm fibroblastos contaminantes como o fibroblasto Trópico, os vírus adaptados laboratório não conseguem infectar e replicar nas células derivadas salivares primárias7. Quando nós tivermos usado este protocolo para gerar pilhas para a avaliação da replicação de HCMV e a propagação em um sistema salivar preliminar, este protocolo poderia prontamente ser adaptado para gerar as pilhas salivares úteis para a escala larga dos tópicos da pesquisa mencionados acima. Adicionalmente, este protocolo poderia ser adaptado para atender às necessidades e ao orçamento de cada pesquisador individual. Quando nós não validamos outras circunstâncias nós mesmos, outro relataram o sucesso que cresce pilhas epithelial salivares circunstâncias diferentes dos meios. Por exemplo, o meio modificado de Eagle de Dulbecco (DMEM): a mistura F12 suplementada com fator de crescimento epidérmico e fator-2 do crescimento do fibroblasto foi relatada para promover o crescimento robusto de pilhas salivares18. Alternativamente, Nam et al. usam meios essenciais mínimos suplementados com soro fetal bovino antes de transferir as células para uma versão sem soro de um meio de crescimento de queratinócitos e relataram um crescimento robusto das células salivares no plástico15. Assim, não parece que as pilhas epithelial salivares exibem uma exigência absoluta para um tipo particular dos meios, mas parecem rather crescer e proliferar em um número de tipos de meios comercialmente disponíveis.
Além da formulação de mídia, diferentes formulações de membrana basal podem ser avaliadas por suas habilidades para suportar o crescimento robusto das células epiteliais salivares. O crescimento das células em matrizes que contêm membrana basal comercialmente disponíveis prontamente produzem salispheres e fornece um sistema de cultivo simples, embora caro7,19. Similar àquele discutido acima a respeito da escolha dos meios para o crescimento da pilha, os investigadores relataram o crescimento e o desenvolvimento dos salispheres em um número de matrizes e de sistemas diferentes do hidrogel. Hidrogéis feitos de ácido hialurônico têm o benefício adicional na criação de uma matriz extracelular reticulada com componentes químicos desejados para estudar suas interações e efeitos sobre as células. Usando pilhas salivares derivadas do tecido humano preliminar, o sucesso de geovan et al. relatou no crescimento e na manutenção de uma população de pilha do progenitor salivar em hydrogels do ácido hialurónico; aumento do crescimento das células progenitoras foi observado quando os hidrogéis foram incorporados com peptídeos derivados das proteínas da membrana basal, como anticorpos e laminina20. Outro sistema desenvolvido recentemente por Foraida et al. relatam o uso de "eletrofiação" para desenvolver um andaime de nanofibras feito de poli (ácido láctico-co-glicólico) (PLGA). Os hidrogéis de PLGA com elastina adicionado foram encontrados para promover prontamente o desenvolvimento de um sistema de pilha submandibular polarizado, que possa ser útil em verificar como a polarização da pilha influencia a biologia salivar e a bioquímica21.
Neste protocolo, nós apresentamos um método simples para o isolamento e o crescimento de pilhas epithelial glândula-derivadas salivares preliminares. Este protocolo resulta no crescimento rápido de uma população de células epiteliais que pode ser mantida em média para 5-8 passagens. É crítico monitorar o tecido durante o tratamento com Dispase/Collagenase para assegurar a digestão apropriada como mencionado no protocolo. A digestão incompleta diminuirá severamente o número de salispheres que sobrevivem. Também é importante monitorar as culturas para o crescimento de fibroblastos que têm uma forma alongada e são muito distintas das células epiteliais poligonais que tipicamente crescem em patches discretos ou aglomerados. Nós usamos este protocolo para o isolamento de células epiteliais de humanos e camundongos, mas parece provável que ele poderia ser adaptado para uso com outros sistemas de mamíferos. Além disso, este protocolo poderia mais ser modificado usando etapas adicionais da purificação baseadas na expressão do marcador da superfície da pilha e no fluxo citometria que poderiam conduzir à geração de umas populações iniciais mais homogêneas da pilha. Similarmente, este protocolo poderia ser usado para determinar como a formulação diferente dos meios ou da matriz/hydrogels conduz ao conseqüência de tipos específicos da pilha ao gerar primeiramente os salispheres. Em conclusão, este protocolo deve servir como uma plataforma de partida robusta para o isolamento e crescimento de células salivares primárias que podem ser prontamente adaptadas para uma ampla variedade de protocolos experimentais e áreas de pesquisa.
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Disclosures
Os autores relatam nada para divulgar.
Acknowledgments
Gostaríamos de agradecer a James P. Bridges por fornecer orientações significativas sobre as metodologias envolvidas na cultura das células primárias. Matthew J. Beucler foi apoiado pelos institutos nacionais de formação em saúde Grant T32-ES007250. Este trabalho também foi apoiado pelos institutos nacionais de saúde concede R01-AI121028 e R21-DE026267 concedidos a William E. Miller.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mm culture dishes | Thermo Scientific | 172931 | |
| 15 mL conical tubes | Thermo Scientific | 339651 | |
| 50 mL conical tubes | Thermo Scientific | 339653 | |
| Bronchial Epithelial Cell Growth Media | Lonza | CC-3171 | Add bullet kit as per manufacturer's instructions. Supplement with 20 mL of charcoal stripped serum. |
| Cell strainer 70 µm nylon mesh | Fisher | 22-363-548 | |
| Charcoal stripped fetal bovine serum | Gibco | 12676-029 | |
| Collagenase type III | Worthington | LS004182 | Store at 4 °C. |
| Cryogenic Tube | Fisher | 5000-0020 | |
| Dispase | Cell Applications | 07923 | Dissolve collagenase to make a 0.15% (w/v) stock. Filter sterilize then store at -20 °C. |
| Dissecting scissors | Fisher | 08-940 | |
| Dulbecco phosphate buffered saline | Corning | 55-031-PC | |
| General Chemicals | Sigma | ||
| PathClear Basement membrane extract | Cultrex | 3432-005-01 | Thaw at 4 °C at least 24 hr prior to use. Always handle on ice. |
| Six-well culture dishes | Falcon | 353046 | |
| Surgical forceps | Fisher | 22-079-742 | |
| Trypsin-EDTA solution | Corning | 25-052-CI |
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