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Immunology and Infection

साल्फियर्स या मोनोलेयर्स के रूप में इन विट्रो विकास के लिए मानव सालिवरी ग्लैंड्स से सालिवरी एपिथेलियल कोशिकाओं का अलगाव

Published: July 15, 2019 doi: 10.3791/59868
Automatic Translation
1, 1
1Department of Molecular Genetics, Biochemistry, and Microbiology, University of Cincinnati College of Medicine

Summary

हम अलग करने और प्राथमिक मानव लार ग्रंथि व्युत्पन्न उपकला कोशिकाओं की खेती के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं। इन कोशिकाओं को उनके साथ संगत जीन अभिव्यक्ति पैटर्न प्रदर्शन लार उपकला मूल की जा रही है और तहखाने झिल्ली matrices Engelbreth-Holm-Swarm ट्यूमर कोशिकाओं से व्युत्पन्न या इलाज संस्कृति व्यंजनों पर monolayers के रूप में salispheres के रूप में उगाया जा सकता है.

Abstract

लार ग्रंथियों मानव रोग के कई पहलुओं में रुचि शोधकर्ताओं के लिए महत्वपूर्ण ब्याज की एक साइट हैं. शोधकर्ताओं का एक लक्ष्य विकिरण चिकित्सा से क्षतिग्रस्त ग्रंथियों के समारोह को बहाल करने के लिए है या एसजेग्रेन सिंड्रोम के साथ जुड़े रोगों के कारण. शोधकर्ताओं का एक दूसरा लक्ष्य तंत्र है जिसके द्वारा वायरस ग्रंथियों ऊतक के भीतर दोहराने जहां वे तो क्षैतिज संचरण के लिए महत्वपूर्ण लार तरल पदार्थ तक पहुँच प्राप्त कर सकते हैं परिभाषित करने के लिए है. इन लक्ष्यों को इन लक्ष्यों को एक मजबूत और इन विट्रो लार ग्रंथि मॉडल है कि ऊपर उल्लेख के रूप में के रूप में अच्छी तरह से संबंधित अनुसंधान क्षेत्रों में रुचि शोधकर्ताओं द्वारा उपयोग किया जा सकता में सुलभ की आवश्यकता पर प्रकाश डाला. यहाँ हम मानव लार ग्रंथियों से उपकला कोशिकाओं को अलग करने और उन्हें इन विट्रो में प्रचार करने के लिए एक सरल प्रोटोकॉल पर चर्चा. हमारे प्रोटोकॉल आगे व्यक्तिगत अध्ययन की जरूरतों को पूरा करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. संक्षेप में, लार ऊतक यंत्रवत् और एंजाइमी रूप से एकल कोशिकाओं या कोशिकाओं के छोटे समूहों को अलग करने के लिए अलग है। उपकला कोशिकाओं के लिए चयन उपकला कोशिका विकास को बढ़ावा देने के लिए अनुकूलित मीडिया की उपस्थिति में एक तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स पर चढ़ाना द्वारा होता है। इन परिणामस्वरूप संस्कृतियों तीन आयामी समूहों के रूप में बनाए रखा जा सकता है, कहा "salispheres", या इलाज प्लास्टिक ऊतक संस्कृति व्यंजनों पर एक मोनोलेयर के रूप में हो. इस प्रोटोकॉल का परिणाम मुख्य रूप से उपकला कोशिकाओं की विषमजात जनसंख्या की वृद्धि में होता है जिसे सेलुलर जीर्णता से गुजरने से पहले 5-8 मार्ग (15-20 जनसंख्या दोहरीकरण) के लिए प्रचारित किया जा सकता है।

Introduction

स्तनधारियों में लार ग्रंथियों प्रमुख लार ग्रंथियों के 3 जोड़े में आयोजित कर रहे हैं: कर्णमूल, submandibular, और sublingual ग्रंथियों. वहाँ भी छोटी ग्रंथियों की एक श्रृंखला मौजूद है जीभ पर स्थित है और मौखिक गुहा1भर में बिखरे हुए . प्रमुख ग्रंथियां लार की भारी मात्रा के लिए उत्तरदायी होती हैं जो2उत्पन्न होती हैं . स्रावित कारकों के माध्यम से एंटीमाइक्रोबियल सुरक्षा प्रदान करने के अलावा, लार चबाने और भोजन चिकनाई की प्रक्रिया में महत्वपूर्ण है क्योंकि यह घेघा2से गुजरता है। इस प्रकार, लार ग्रंथि रोग एक चिकित्सा मुद्दे का प्रतिनिधित्व करता है जहां पीड़ित जो पर्याप्त लार का उत्पादन करने में असमर्थ हैं दंत गुहाओं या मौखिक कैंडिडिआसिस3जैसे बीमारियों के विकास के लिए अधिक प्रवण हैं। इसके अतिरिक्त, कम लार अधिक से अधिक कठिनाई खाने और जीवन की गुणवत्ता पर एक महत्वपूर्ण प्रभाव होने भोजन पचाने में परिणाम.

लार ग्रंथि रोग मुख्य रूप से एसजेग्रेन सिंड्रोम, एक autoimmune विकार, या सिर और गर्दन केकैंसर के साथ रोगियों में जो विकिरण चिकित्सा 3,4,5से पीड़ित रोगियों में पाया जाता है 6. ऑटोरिवेन्शन या विकिरण चिकित्सा के परिणामस्वरूप ग्रंथियों के भीतर क्षतिग्रस्त स्रावी acini आत्म-नवीकरण से गुजरना नहीं है, जो अपरिवर्तनीय क्षति के साथ रहने वाले एक रोगी में परिणाम6. लार ग्रंथियों के अध्ययन ने वायरल रोगजनन के तंत्र में रुचि रखने वाले ध्यान या शोधकर्ताओं को भी आकर्षित किया है। कुछ रोगजनक, जैसे मानव साइटोमेगागोवायरस (एचसीएमवी), लार ग्रंथियों के भीतर लगातार प्रतिकृति करते हैं, जो तब लार7,8के माध्यम से एक नए मेजबान को नवजात वायरस के संचरण की अनुमति देता है। इस प्रकार, चिकित्सा समस्याओं की एक विविध सरणी से निपटने और समझने के लिए लार ग्रंथि ऊतक के इन विट्रो मॉडल में मजबूत और पुन: उत्पादनीय विकसित करने की आवश्यकता है।

मौरीन लार ग्रंथि प्रणाली के अनेक मॉडलों का प्रयोग विभिन्न उपकला कोशिकाओं को समझने और उनकी विशेषता के लिए किया गया है जो लार ग्रंथियों9,10का निर्माण करती हैं . मानव और मौरलार लार ग्रंथियों के बीच स्पष्ट और प्रमुख अंतर मौजूदहैं. सबसे विशेष रूप से मानव कर्णमूल ग्रंथि उपमंडीबलर ग्रंथि के संबंध में अधिक है जबकि माउस सबमडिबुलर और कर्णमूलका आकार1,2,11में बहुत समान है . जबकि अमर मानव submandibular सेल लाइनों मौजूद है, वहाँ प्रमुख चिंताओं है कि अमर कोशिकाओं को सही प्राथमिक ऊतक और माध्यमिक चिंताओं है कि अमर कोशिकाओं से प्राप्त नहीं कर रहे हैं phenotype बनाए रखने नहीं कर रहे हैं लार उपकला ही12. इन कारणों के लिए वहाँ एक ब्याज और मनुष्य से प्राथमिक लार ऊतक का अध्ययन करने की जरूरत है.

यहाँ हम ऊतक संस्कृति के लिए मानव लार ग्रंथियों से प्राथमिक उपकला कोशिकाओं को अलग करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन. हमारा प्रोटोकॉल Pringle एट अल और Tran एट अल के कार्यों पर आधारित है, जिसमें आम तौर पर उनकी प्रक्रियाओं को सरल बनाने के लिए किए गए संशोधनों के साथ13,14. सबसे पहले, जबकि Tran एट अल प्रोटोकॉल enzymaticly लार ऊतक पचाने के लिए एक लंबे समय से पांच घंटे ऊष्मायन के लिए कहता है, हमारे संशोधित प्रोटोकॉल के रूप में छोटे रूप में एक घंटे ऊष्मायन के साथ सफल रहा है, Pringle एट अल में है कि इसी तरह. दूसरा, हम ऊतक पाचन के लिए विभिन्न एंजाइमों का उपयोग करें, सबसे विशेष रूप से हम trypsin का उपयोग नहीं के रूप में मूल Tran एट अल प्रोटोकॉल में प्रयोग किया जाता है, लेकिन इसके बजाय dispase और collagenase का एक मिश्रण का उपयोग करें. हम प्रारंभिक पाचन चरणों में trypsin से बचने के लिए पसंद करते हैं के रूप में हाल ही में एक अध्ययन का सुझाव दिया है कि trypsin द्वारा लार ऊतक के प्रारंभिक पाचन कम सेल व्यवहार्यता में परिणाम, संभवतः एक दुर्लभ स्टेम सेल जनसंख्या के नुकसान से15. अंत में, हम मूल रूप से ब्रोन्कियल उपकला कोशिकाओं के प्रचार के लिए तैयार एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध मीडिया का उपयोग कर तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स (BMM) की सतह पर salispheres संस्कृति. हमारे प्रोटोकॉल कर्णमूल, submandibular, और sublingual ग्रंथियों से लार कोशिकाओं को अलग करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. ये कोशिकाएं लार एमिलेस और अन्य लार विशिष्ट जीनों को व्यक्त करती हैं जो यह दर्शाती हैं कि वे लार आणि उपकला कोशिकाओं7के समान एक फीनोटाइप को बनाए रखते हैं . हम सफलतापूर्वक इस पद्धति का उपयोग कर 50 प्राथमिक मानव ऊतक नमूने से लार संस्कृतियों उत्पन्न किया है. इसके अलावा, प्राथमिक लार कोशिकाओं को आसानी से एक बाद की तारीख में उपयोग के लिए cryopreserved किया जा सकता है.

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Protocol

इन प्रोटोकॉल और अध्ययन की समीक्षा की गई है और सिनसिनाटी विश्वविद्यालय में संस्थागत समीक्षा बोर्ड द्वारा अनुमोदित (संघीय व्यापक आश्वासन #00003152, आईआरबी प्रोटोकॉल 2016-4183). लार ऊतक आमतौर पर कई सिर और गर्दन शल्य चिकित्सा प्रक्रियाओं में resepted है और आमतौर पर घातक प्रक्रिया द्वारा uninvolved है. आमतौर पर, रोगी से हटाने के बाद ताजा पुन: स्रावित लार ग्रंथि ऊतक का उपयोग 2-4 एच के भीतर किया जाता है (चित्र 1क)।

1. अभिकर्मक तैयारी

  1. ब्रोन्कियल उपकला कोशिका विकास माध्यम (बीईजीएम)
    1. निर्माता द्वारा प्रदान की किट से घटक जोड़ें (सामग्री की तालिकादेखें).
    2. घटकों का पूरा हस्तांतरण सुनिश्चित करने के लिए आधार मीडिया के साथ एक बार प्रत्येक ट्यूब धो लें। फिर जोड़ने लकड़ी का कोयला छीन भ्रूण गोजातीय सीरम 4% सीरम के एक अंतिम एकाग्रता बनाने के लिए.
  2. लाल रक्त कोशिका (आरबीसी) lysis बफर
    1. 10x स्टॉक बनाने के लिए, एनएच4सीएल के 40.15 ग्राम, 5.0 ग्राम नाहको3,और 0.186 ग्राम एथिलीनडायमिनेटेट्रासेटिक एसिड (ईडीटीए) जोड़ें और 200 एमएल की अंतिम मात्रा तक लाएं जिसमें डीएच2व् का उपयोग किया गया है। फिर फ़िल्टर बाँझ और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।
    2. बाँझ dH2हे में 1x की एक काम एकाग्रता के लिए पतला उपयोग करने से पहले.
  3. वियोजन समाधान
    1. dispase समाधान की एक 100 एमएल बोतल के लिए (सामग्री की तालिकादेखें) कोलैजास प्रकार III के 0.15 ग्राम जोड़ें. कोलैजेनस पूरी तरह से भंग हो गया है के बाद, फिल्टर नए समाधान और alicot बाँझ। -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

2. ऊतक पाचन

  1. 100 मिमी ऊतक संस्कृति प्लेट का उपयोग करके, यंत्रवत् ऊतक को ठीक टुकड़ों में ले जाता है - 1-2 मिमी आकार में ऑटोक्लेव-स्टरिलीकृत विच्छेदन कैंची और सर्जिकल संदंश (चित्र 1 बी,ब्) का उपयोग करते हुए। टुकड़ों के बीच संयोजी ऊतक उचित जुदाई और आगे के चरणों में आसानी सुनिश्चित करने के लिए काटा जाना चाहिए।
  2. कीमा बनाया ऊतक के लिए dispase/collagenase समाधान के 6 एमएल जोड़ें। फिर 37 डिग्री सेल्सियस पर लगभग 30 मिनट से 1 एच के लिए इनक्यूबेट करें।
  3. एक 5 एमएल सीरियोलॉजिकल पिपेट 15-20 बार के साथ पाइपिंग द्वारा ऊतक को बाधित।
  4. एक और 30 मिनट से 1 एच के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
  5. 2ण्3 और 2-4 दो-तीन बार या ऊतक एक घोल जैसा दिखता है और आसानी से पिपेट खोलने के माध्यम से पारित कर सकते हैं (चित्र 1D) दोहराएँ।
    नोट: ऊतक नमूना के प्रारंभिक आकार और कैसे ऊतक mincing की सुंदरता निर्धारित करेगा कि कितनी बार एक कदम दोहराने की जरूरत है 2.3 और 2.4. आमतौर पर, हम ऊतक लगभग 1 सेमी x 1 सेमी आकार में प्राप्त करते हैं। इसके अतिरिक्त, एक ऊतक से सेल वियोजन की प्रगति को ट्रैक करने के लिए एक मानक उल्टे ऊतक संस्कृति माइक्रोस्कोप का उपयोग कर ऊतक वियोजन की निगरानी कर सकते हैं। कोशिकाओं के छोटे समूहों salispheres के रूप में लार कोशिकाओं के प्रारंभिक वृद्धि के लिए आदर्श होते हैं.

3. तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स के साथ कोटिंग कुओं

नोट: बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स (बीएमएम) रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर यह प्रयोग किया जाएगा से पहले दिन में thawed किया जाना चाहिए। एक बार thawed, BMM लगातार बर्फ पर या 4 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखा जाना चाहिए के रूप में यह तेजी से ठोस होगा (यानी, एक जेल के रूप में) गर्म तापमान पर. इसके अतिरिक्त, ध्यान रखा जाना चाहिए अगर नमूने BMM पर चढ़ाना से पहले बर्फ पर ठंडा किया गया है के रूप में ठंड के नमूने "मेल्ट" BMM और प्लास्टिक डिश के लिए कोशिकाओं को बेनकाब होगा.

  1. धीरे धीरे pipette BMM (सामग्री की मेजदेखें) प्रत्येक अच्छी तरह से लेपित होने के लिए. शाम और धीरे धीरे अच्छी तरह से पर BMM वितरित.
    नोट: आम तौर पर, हम एक छह अच्छी तरह से प्लेट के प्रत्येक अच्छी तरह से प्रति 500 $L का उपयोग करें, लेकिन इस मात्रा में इस तरह के रूप में प्लेटों के अन्य वेरिएंट पर उपयोग के लिए समायोजित किया जा सकता 12-अच्छी तरह से या 24 अच्छी तरह से, या मोटा या thinner hydrogels के लिए वांछित के रूप में.
  2. बीएमएम समय को ठोस करने की अनुमति देने के लिए उपयोग करने से पहले कम से कम 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर लेपित प्लेटों को इनक्यूबेट करें।

4. अपाच्य ऊतक, आरबीसी lysis, और सेल चढ़ाना की फ़िल्टरिंग

  1. स्थानांतरण ऊतक homogenate चरण 2.5 से एक 15 एमएल शंकु ट्यूब के लिए. शेष कोशिकाओं को स्थानांतरित करने के लिए Dulbecco के फॉस्फेट बफर ्ड नमकीन (DPBS) के 6 एमएल के साथ एक बार प्लेट धो लें।
  2. एक 70 m नायलॉन जाल सेल छलनी के माध्यम से एक 50 एमएल शंकु ट्यूब में homogenate फ़िल्टर ungested ऊतक को दूर करने के लिए. 500 x ग्रामपर 5 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज तनावपूर्ण कोशिकाओं .
  3. एक 1x काम कर समाधान बनाने के लिए बाँझ डी एच2हे में Dilute 10x आरबीसी lysis बफर।
  4. अधिनान्त को प्रेरित करें। फिर 1x आरबीसी lysis बफर के 10 एमएल में सेल गोली resuspend. 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट।
  5. आरबीसी lysis बफर बेअसर और लार कोशिकाओं के lysis को कम करने के लिए DPBS के 20-25 एमएल जोड़ें। 500 x ग्रामपर 5 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज |
    नोट: आरबीसी lysis बफर के साथ उपचार के बाद, सेल गोली सफेद होना चाहिए। गोली में लाल रंग इंगित करता है कि नहीं सभी आरबीसी पूरी तरह से lysed किया गया है. सभी आरबीसी की पूर्ण lysis के लिए आवश्यक हो, तो 4.4 से 4.5 के माध्यम से कदम दोहराएँ।
  6. अधिनान्त को प्रेरित करें। बीईजीएम के 1-2 एमएल में गोली को अच्छी तरह से फिर से लागू करें तो बीएमएम लेपित कुओं पर फिर से निलंबित कोशिकाओं को रखें। 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
  7. एक बार BMM पर चढ़ाया, कोशिकाओं गोलाकार संरचनाओं या "saispheres" में एक 2-3 दिन की अवधि में फार्म का होगा. कोशिकाओं के बारे में 5-7 दिनों के लिए salispheres के रूप में बनाए रखा जा सकता है इससे पहले कि BMM कोशिकाओं का उपयोग करने के लिए और प्लास्टिक का पालन करें और एक monolayer के रूप में विकसित करने की अनुमति नीचा करने के लिए शुरू होता है.

5. BMM पर salispheres और रखरखाव subculturing

  1. कुओं से Aspirate मीडिया, तो प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए dispase/collagenase समाधान के 1 एमएल जोड़ें और $ 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर या जब तक BMM ज्यादातर भंग कर दिया है.
  2. एक 15 एमएल शंकु ट्यूब के लिए कोशिकाओं स्थानांतरण और शेष कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए DPBS के साथ एक बार कुओं धोने. 500 x ग्रामपर 5 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज |
  3. अधिनान्त को प्रेरित करें। 2 एमएल ट्रिप्सिन में गोली को फिर से 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  4. 10% सीरम युक्त किसी भी पूरा मीडिया का उपयोग trypsin बेअसर. 500 x ग्रामपर 5 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज |
  5. अधिनान्त को प्रेरित करें। अवशिष्ट मीडिया, trypsin, और सीरम को निकालने के लिए DPBS में कक्षों को पुन: निलंबित करें। 500 x ग्रामपर 5 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज |
  6. अधिनान्त को प्रेरित करें। BEGM में फिर से निलंबित और ठोस BMM लेपित संस्कृति व्यंजनों पर resuspended कोशिकाओं प्लेट. निलंबित कोशिकाओं को भी सेल संस्कृति पर सीधे चढ़ाया जा सकता है एक monolayer के रूप में प्रसार के लिए व्यंजन इलाज किया. एक मोनोलेयर के रूप में लार कोशिकाओं के विकास के बारे में अधिक जानकारी के लिए, अनुभाग 6 देखें। बीएमएम या प्लास्टिक पर उगाई जाने वाली कोशिकाओं को हर 2-3 दिनों में ताजा BEGM के साथ खिलाया जाना चाहिए।
  7. 5% सीओ2के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखा एक आर्द्र इनक्यूबेटर में कोशिकाओं को संस्कृति .

6. इलाज प्लास्टिक ऊतक संस्कृति व्यंजनों पर salispheres subculturing

नोट: यदि प्लास्टिक पर एक monolayer के रूप में कोशिकाओं को बनाए रखने, इस कदम पर शुरू करते हैं. निम्नप्रोटोकॉल एक 100 मिमी पकवान में बढ़ रही कोशिकाओं के लिए लागू होता है.

  1. मीडिया को प्रेरित करें। अवशिष्ट मीडिया को निकालने के लिए DPBS के साथ एक बार धो लें।
  2. trypsin के 2 एमएल जोड़ें तो 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट, या जब तक कोशिकाओं को पूरी तरह से अलग कर दिया है.
  3. 10% सीरम युक्त किसी भी पूरा मीडिया के 4 एमएल का उपयोग trypsin बेअसर. कोशिकाओं को 15 एमएल शंकु नली में स्थानांतरित करें.
  4. शेष कक्षों को एकत्रित करने के लिए लगभग 5 एमएल DPBS के साथ एक बार प्लेट को धो लें। 500 x ग्रामपर 5 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज |
  5. अधिनान्त को प्रेरित करें। अवशिष्ट मीडिया को निकालने के लिए DPBS के 6-10 एमएल में कक्षों को पुन: निलंबित करें।
  6. 500 x ग्रामपर 5 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज |
  7. महादलितों को प्रेरित करें और बीईजीएम में फिर से निलंबित करें। प्लास्टिक ऊतक संस्कृति व्यंजनों का इलाज पर प्लेट कोशिकाओं. हर 2-3 दिनों में ताजा BEGM के साथ फ़ीड.
  8. 5% सीओ2के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखा एक आर्द्र इनक्यूबेटर में कोशिकाओं को संस्कृति .

7. कोशिकाओं का क्राईसंरक्षण

नोट: कोशिकाओं के Cryopservation या तो salisphere या monolayer विकसित कोशिकाओं से शुरू होने वाले एक एकल सेल निलंबन से पूरा किया जा सकता है.

  1. उपस्थित कोशिकाओं की कुल मात्रा की गणना करने के लिए हेमेटोसाइटमापी पर कोशिकाओं की गणना करें।
  2. 500 x ग्रामपर 5 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज |
  3. अधिनान्त को प्रेरित करें। BEGM में 10% dimethyl sulfoxide (DMSO) के साथ गोली resuspend. कोशिकाओं की एकाग्रता होना चाहिए 2 x 106 कोशिकाओं / एमएल करने के लिए 10 x 106 कोशिकाओं /
  4. बाँझ क्रायोजेनिक भंडारण ट्यूबों में अलीकोट कोशिकाओं। कोशिकाओं को फ्रीज करने के लिए ट्यूब को एक अछूता फोम रैक में रखें और रात -80 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  5. अगले दिन, लंबी अवधि के भंडारण के लिए तरल नाइट्रोजन में ट्यूब जगह है.
    नोट: कोशिकाओं को तेजी से 37 डिग्री सेल्सियस पर thawed किया जाना चाहिए। thawing पर, कोशिकाओं 500 x ग्राम पर गोली चलाई जानी चाहिए और DMSO युक्त मीडिया चढ़ाना से पहले हटा दिया.

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Representative Results

बीएमएम पर डाइजेस्ट ऊतक से कोशिकाओं को चढ़ाने के दो-तीन दिन बाद, कोशिकाएं आसानी से छोटे समूहों का निर्माण करेंगी जो समूह प्रति 15-20 कोशिकाओं तक आकार में विस्तार करना जारी रखेंगे (चित्र 2क)। सेलुलर मलबे और अलग मृत कोशिकाओं को आम तौर पर देखा जाता है और aspirating और ताजा मीडिया के साथ reploying द्वारा हटाया जाना चाहिए. कोशिकाओं के बारे में 3-10 दिनों के लिए salispheres के रूप में बढ़ ने जारी रहेगा, या जब तक BMM परत बरकरार रहता है. कभी कभी, BMM के आंशिक टूटने के कारण, कोशिकाओं अंतर्निहित प्लास्टिक से जुड़ा हो जाएगा और एक मोनोलेयर के रूप में proliferate करने के लिए शुरू. Salispheres BMM पर बड़े आकार और संरचनात्मक जटिलता में परिवर्तनशीलता का प्रदर्शन करेंगे. Salispheres उन्हें ताजा तैयार BMM पर पारित के रूप में प्रोटोकॉल में वर्णित द्वारा बनाए रखा जा सकता है. ताजा BMM पर पारित करने के बाद 2-3 दिनों के भीतर, कोशिकाओं क्षेत्रों में सुधार होगा. लवणीय कोशिकाओं को कोशिका संस्कृति पर भी चढ़ाया जा सकता है- प्लास्टिक का उपचार किया जाता है और एक मोनोलेयर के रूप में उगाया जा सकता है जहां वे उपकला मूल की कोशिकाओं के अनुरूप आकृति विज्ञान का प्रदर्शन करते हैं जैसा कि चित्र 2खमें दर्शाया गया है। जबकि salisphere कोशिकाओं BMM पर हो salispheres लार ऊतक के एक phenotype अधिक विशेषता बनाए रखने की संभावना है, एक मोनोलेयर के रूप में हो कोशिकाओं कुछ प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल के लिए फायदेमंद हो सकता है. अधिक व्यापक लक्षण किस हद तक कोशिकाओं को एक लार phenotype बनाए रखने के लिए जब एक monolayer पर हो के रूप में salispheres के रूप में विकसित कोशिकाओं की तुलना में निर्धारित करने के लिए प्रदर्शन किया जा करने की आवश्यकता होगी.

Figure 1
चित्र 1 : salisphere तैयारी के लिए मानव submandibular ग्रंथियों के प्रारंभिक प्रसंस्करण. जब तक कि ग्रंथि का आकार लगभग 1-2 मिमी तक नहीं होता , तब तक तेज कैंची (बी) का उपयोग करके लगभग 1 सेमी व्यास (ए) को यंत्रवत् छोटे टुकड़ों में कीमा बनाया जाता है . ग्रंथियों के टुकड़े तो dispase/collagenase समाधान में incubated रहे हैं 30-90 मिनट के लिए serological pipettes के माध्यम से आवधिक मार्ग के साथ जब तक नमूना ज्यादातर एकल कोशिकाओं या कोशिकाओं के छोटे clumps को पचा है (डी) . कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2 : प्राथमिक मानव salisphere कोशिकाओं तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स पर क्षेत्रों के रूप में या इलाज सेल संस्कृति व्यंजनों पर एक मोनोलेयर के रूप में सुसंस्कृत किया जा सकता है. लार ऊतक के प्रारंभिक पाचन के बाद, पचा ग्रंथियों BMM पर सीधे चढ़ाया और 3-10 दिनों के लिए सुसंस्कृत कर रहे हैं. कोशिकाओं को ताजा पोषक तत्व प्रदान करने के लिए हर 2-3 दिनों में खिलाया जाता है। एक बार प्राथमिक salispheres विकसित, matrices dispase/collagenase समाधान में पचा जा सकता है, एक कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए trypsinized, और ताजा BMM पर फिर से चढ़ाया जहां वे क्षेत्रों में सुधार (ए) या सेल संस्कृति व्यंजन पर चढ़ाया जहां वे एक उपकला मोनोलेयर (बी) की विशिष्ट एक मोची पत्थर आकृति विज्ञान का आसानी से निर्माण करें । कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

सालरी रोग के रूप में अच्छी तरह से लार ग्रंथियों के निकट कैंसर के लिए विकिरण चिकित्सा के दौर से गुजर उन लोगों के लिए जीवन की गुणवत्ता के लिए एक चिंता का विषय का प्रतिनिधित्व करता है3,4, 16. इन रोगियों के इलाज के लिए एक प्रस्तावित चिकित्सा यह है कि इन विट्रो में कार्यात्मक लार स्टेम सेल या organoids विकसित करने के लिए है, जो तब प्रभावित ऊतक9को बदलने के लिए क्षतिग्रस्त लार ग्रंथि में डाला जा सकता है. इसके अतिरिक्त, लार ग्रंथियों अक्सर दृढ़ता और मानव रोगजनकों के संचरण के लिए एक साइट है. उदाहरण के लिए, मानव साइटोमेगागोवायरस (एचसीएमवी) जैसे मानव हर्पीवायरस नए मेजबानोंकोवायरस को संचारित करने के लिए लार ग्रंथियों और लार को संक्रमित और उपयोग करने के लिए जाने जाते हैं । लार ग्रंथि और लार के लिए आंदोलन में वायरल हठ अंतर्निहित आणविक तंत्र अज्ञात रहते हैं। इन विट्रो लार सेल सिस्टम का विकास इस मशीनी जानकारी का पता लगाने के लिए एक आवश्यक मॉडल प्रणाली प्रदान करेगा।

हम यहाँ प्राथमिक लार पैदा करने के लिए एक मजबूत प्रोटोकॉल रिपोर्ट "salispheres" कि इन विट्रो में या तो BMM पर समूहों के रूप में या प्लास्टिक पर monolayers के रूप में उगाया जा सकता है. संस्कृति और प्राथमिक मानव लार ग्रंथि उपकला कोशिकाओं का प्रचार करने की क्षमता एक महत्वपूर्ण मंच है जिस पर शोधकर्ताओं कर सकते हैं का प्रतिनिधित्व करता है (1) संभावित लार ग्रंथि की कमी के साथ रोगियों के लिए प्रतिस्थापन चिकित्सा विकसित कर सकते हैं जिनके लिए कोई अन्य विकल्प मौजूद हैं; (2) बेहतर लार ग्रंथि विकास, प्रसार, स्राव, आदि अंतर्निहित बुनियादी शरीर क्रिया विज्ञान को समझते हैं; और (3) रोगजनकों द्वारा नए मेजबानों को दोहराने और फैलाने के लिए उपयोग किए जाने वाले तंत्र ों को परिभाषित करना।

इन लार सेल संस्कृतियों का उपयोग करते हुए, हमने सूचित किया है कि एचसीएमवी को प्राथमिक संक्रमण के लिए पेंटामेरिक ग्लाइकोप्रोटीन परिसर की आवश्यकता होती है और यह भी कि वायरस एक विस्तारित अवधि के लिए बना रहता है, जो विवो7में एचकेएमवी के साथ होता है की याद ताजा करता है। इसके अलावा, हमारे कार्यात्मक अध्ययनों से पता चला है कि लार संस्कृतियों फाइब्रोब्लास्ट के रूप में contaminating फाइब्रोब्लास्ट शामिल नहीं है, प्रयोगशाला अनुकूलित वायरस को संक्रमित करने और प्राथमिक लार व्युत्पन्न कोशिकाओं में दोहराने में विफल7. जबकि हम इस प्रोटोकॉल का इस्तेमाल किया है एचसीएमवी प्रतिकृति के मूल्यांकन के लिए कोशिकाओं को उत्पन्न करने और एक प्राथमिक लार प्रणाली में फैल, इस प्रोटोकॉल आसानी से ऊपर उल्लेख किया अनुसंधान विषयों की विस्तृत श्रृंखला के लिए उपयोगी लार कोशिकाओं उत्पन्न करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. इसके अतिरिक्त, इस प्रोटोकॉल की जरूरत है और प्रत्येक व्यक्ति शोधकर्ता के बजट के अनुरूप अनुकूलित किया जा सकता है. हालांकि हम अन्य शर्तों खुद को मान्य नहीं किया है, दूसरों की सफलता की सूचना दी है विभिन्न मीडिया की स्थिति के तहत लार epithelial कोशिकाओं बढ़ रही है. उदाहरण के लिए, Dulbecco के संशोधित ईगल माध्यम (DMEM): F12 मिश्रण epidermal विकास कारक और फाइब्रोब्लास्ट विकास कारक-2 के साथ पूरक लार कोशिकाओं के मजबूत विकास को बढ़ावा देने के लिए सूचित किया गया है18. वैकल्पिक रूप से, नाम एट अल का उपयोग न्यूनतम आवश्यक मीडिया भ्रूण गोजातीय सीरम के साथ पूरक एक keratincyte विकास मीडिया के एक सीरम मुक्त संस्करण के लिए कोशिकाओं को स्थानांतरित करने से पहले और प्लास्टिक पर लार कोशिकाओं के मजबूत विकास की सूचना दीहै 15. इस प्रकार, यह प्रतीत नहीं होता है कि लार उपकला कोशिकाओं एक विशेष मीडिया प्रकार के लिए एक पूर्ण आवश्यकता प्रदर्शन, बल्कि बढ़ने और व्यावसायिक रूप से उपलब्ध मीडिया प्रकार के एक नंबर पर proliferate दिखाई देते हैं.

मीडिया तैयार करने के अलावा, विभिन्न तहखाने झिल्ली योगों मजबूत लार उपकला कोशिका विकास का समर्थन करने के लिए उनकी क्षमताओं के लिए मूल्यांकन किया जा सकता है। व्यावसायिक रूप से उपलब्ध बेसमेंट झिल्ली युक्त मैट्रिक्स पर कोशिकाओं की वृद्धि आसानी से salispheres उपज और एक सरल प्रदान करता है, हालांकि महंगी culturing प्रणाली7,19. कोशिका विकास के लिए मीडिया के चुनाव के विषय में ऊपर चर्चा के समान, शोधकर्ताओं ने विभिन्न matrices और hydrogel प्रणालियों के एक नंबर पर salispheres के विकास और विकास की सूचना दी है. hyaluronic एसिड से बने hydrogels एक extracellular मैट्रिक्स वांछित रासायनिक घटकों के साथ crosslinked बनाने में जोड़ा लाभ है उनकी बातचीत और कोशिकाओं पर प्रभाव का अध्ययन करने के लिए. प्राथमिक मानव ऊतक लार कोशिकाओं व्युत्पन्न का उपयोग करना, श्रीनिवासन एट अल वृद्धि और hyaluronic एसिड hydrogels में एक लार जनक कोशिका आबादी के रखरखाव में सफलता की सूचना दी; जब हाइड्रोजेल्स को पेप्टाइड्स के साथ शामिल किया गया था , तब पेप्टाइड्स को पेप्टाइड्स के साथ शामिल किया गया था , जैसे कि पेरलेकन और लेमिनिन20. एक अन्य प्रणाली हाल ही में Foraida एट अल द्वारा विकसित की रिपोर्ट "इलेक्ट्रोस्पिनिंग" का उपयोग कर एक नैनोफाइबर पाड़ पॉली (लैक्टिक-को-ग्लाइकोलिक एसिड) (PLGA) से बना विकसित करने के लिए। अतिरिक्त इलैस्टिन के साथ पीएलजीए हाइड्रोजेल्स को एक ध्रुवीकृत सबमैन्डबुलर सेल सिस्टम के विकास को आसानी से बढ़ावा देने के लिए पाया गया , जो यह सुनिश्चित करने में उपयोगी हो सकता है कि सेल ध्रुवीकरण लार जीव विज्ञान और जैव रसायन21को कैसे प्रभावित करता है .

इस प्रोटोकॉल में, हम अलगाव और प्राथमिक लार ग्रंथि व्युत्पन्न उपकला कोशिकाओं के विकास के लिए एक सरल विधि प्रस्तुत किया है. इस प्रोटोकॉल एक उपकला कोशिका आबादी है कि 5-8 मार्ग के लिए औसत पर बनाए रखा जा सकता है की तेजी से वृद्धि में परिणाम. प्रोटोकॉल में उल्लिखित उचित पाचन सुनिश्चित करने के लिए डिस्पेस/कोलैजानेस के साथ उपचार के दौरान ऊतक की निगरानी करना महत्वपूर्ण है। अधूरा पाचन गंभीर रूप से जीवित है कि salispheres की संख्या कम हो जाएगा. यह भी एक लम्बी आकार है और आम तौर पर असतत पैच या clumps में विकसित कि बहुभुज उपकला कोशिकाओं से बहुत अलग हैं कि फाइब्रोब्लास्ट्स के विकास के लिए संस्कृतियों की निगरानी करने के लिए महत्वपूर्ण है। हम मनुष्यों और चूहों से उपकला कोशिकाओं के अलगाव के लिए इस प्रोटोकॉल का इस्तेमाल किया है, लेकिन यह संभावना है कि यह अन्य स्तनधारी प्रणालियों के साथ उपयोग के लिए अनुकूलित किया जा सकता है लगता है. इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल को और अधिक समरूप प्रारंभिक सेल आबादी की पीढ़ी के लिए नेतृत्व कर सकते हैं कि सेल सतह मार्कर अभिव्यक्ति और प्रवाह साइटोमेट्री के आधार पर अतिरिक्त शुद्धि कदम का उपयोग करके संशोधित किया जा सकता है. इसी प्रकार, इस प्रोटोकॉल का उपयोग यह निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है कि कैसे विभिन्न मीडिया या मैट्रिक्स/हाइड्रोगेल्स निर्माण विशिष्ट सेल प्रकारों की वृद्धि का कारण बनते हैं जब पहली बार सैलिस्बिटर उत्पन्न करते हैं। अंत में, इस प्रोटोकॉल अलगाव और प्राथमिक लार कोशिकाओं जो आसानी से प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल और अनुसंधान क्षेत्रों की एक विस्तृत विविधता के लिए अनुकूलित किया जा सकता है के विकास के लिए एक मजबूत प्रारंभिक मंच के रूप में काम करना चाहिए.

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं रिपोर्ट.

Acknowledgments

हम प्राथमिक कोशिकाओं को गढ़ने के लिए शामिल तरीकों पर महत्वपूर्ण मार्गदर्शन प्रदान करने के लिए जेम्स पी ब्रिज्स को धन्यवाद देना चाहते हैं। मैथ्यू जे Beucler स्वास्थ्य प्रशिक्षण अनुदान T32-ES007250 के राष्ट्रीय संस्थानों द्वारा समर्थित किया गया था. यह काम भी स्वास्थ्य अनुदान R01-AI121028 और R21-DE026267 विलियम ई. मिलर को सम्मानित द्वारा समर्थित किया गया था.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 mm culture dishes Thermo Scientific 172931
15 mL conical tubes Thermo Scientific 339651
50 mL conical tubes Thermo Scientific 339653
Bronchial Epithelial Cell Growth Media Lonza CC-3171 Add bullet kit as per manufacturer's instructions. Supplement with 20 mL of charcoal stripped serum.
Cell strainer 70 µm nylon mesh Fisher 22-363-548
Charcoal stripped fetal bovine serum Gibco 12676-029
Collagenase type III Worthington LS004182 Store at 4 °C.
Cryogenic Tube Fisher 5000-0020
Dispase Cell Applications 07923 Dissolve collagenase to make a 0.15% (w/v) stock. Filter sterilize then store at -20 °C.
Dissecting scissors Fisher 08-940
Dulbecco phosphate buffered saline Corning 55-031-PC
General Chemicals Sigma
PathClear Basement membrane extract Cultrex 3432-005-01 Thaw at 4 °C at least 24 hr prior to use. Always handle on ice.
Six-well culture dishes Falcon 353046
Surgical forceps Fisher 22-079-742
Trypsin-EDTA solution Corning 25-052-CI

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References

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इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक 149 लार ग्रंथियों प्राथमिक संस्कृति सैलीस्फीयर organoid एसजेग्रेन सिंड्रोम मानव साइटोमेगागोवायरस वायरल प्रतिकृति के लिए मॉडल लार
साल्फियर्स या मोनोलेयर्स के रूप में इन विट्रो विकास के लिए मानव सालिवरी ग्लैंड्स से सालिवरी एपिथेलियल कोशिकाओं का अलगाव
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Beucler, M. J., Miller, W. E.… More

Beucler, M. J., Miller, W. E. Isolation of Salivary Epithelial Cells from Human Salivary Glands for In Vitro Growth as Salispheres or Monolayers. J. Vis. Exp. (149), e59868, doi:10.3791/59868 (2019).

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