Summary
우리는 1 차적인 인간 타액 선 파생된 상피 세포를 격리하고 기양하는 방법을 제시합니다. 이들 세포는 침상 피유래의 유전자 발현 패턴을 나타내며 엥겔브레스-홀름-군단 종양 세포에서 유래한 지하 막 매트릭스 또는 처리된 배양 요리의 단층으로서 살리스피어로 성장될 수 있다.
Abstract
침샘은 인간 질병의 여러 측면에 관심이 있는 연구자들에게 중요한 관심의 부위입니다. 연구원의 한 가지 목표는 방사선 요법또는 Sjögren 증후군과 관련된 병리학으로 인해 손상된 땀샘의 기능을 복원하는 것입니다. 연구원의 두 번째 목표는 바이러스가 그 때 수평 전송을 위해 중요한 타액 액체에 접근을 얻을 수 있는 선 조직 내의 복제하는 기계장치를 정의하는 것입니다. 이러한 목표는 위에서 언급한 연구자뿐만 아니라 관련 연구 분야에 관심이 있는 연구자들이 활용할 수 있는 견고하고 접근가능한 시험관 내 침샘 모델의 필요성을 강조합니다. 여기에서 우리는 인간 적인 타액 선에서 상피 세포를 격리하고 시험관에서 그(것)들을 전파하는 간단한 프로토콜을 토론합니다. 우리의 프로토콜은 개별 연구의 요구를 충족시키기 위해 더 최적화 될 수있다. 간단히 말해서, 타액 조직은 기계적으로 그리고 효소적으로 분리되어 단일 세포 또는 작은 세포 군집을 분리합니다. 상피 세포에 대한 선택은 상피 세포 성장을 촉진하기 위해 최적화 된 매체의 존재에 지하 막 매트릭스에 도금에 의해 발생합니다. 이러한 생성된 배양은 "살리스피어"라고 불리는 3차원 클러스터로서 유지되거나 처리된 플라스틱 조직 배양 접시에 단층으로 성장될 수 있다. 이 프로토콜은 세포 노화를 겪기 전에 5-8 대(15-20인구 두 배)를 위해 전파될 수 있는 주로 상피 세포의 이질적인 집단의 생성을 초래한다.
Introduction
포유류에서 타액선은 3 쌍의 주요 침샘으로 구성됩니다 : parotid, submandibular 및 전하 땀샘. 또한 혀에 위치한 일련의 사소한 땀샘이 존재하며 구강 전체에 흩어져있습니다1. 주요 땀샘은 2 . 분비 인자를 통해 항균 보호를 제공하는 것 외에도 타액은 식도2를통과할 때 음식을 채우고 윤활하는 과정에서 중요합니다. 이와 같이, 타액 선 기능 장애는 충분한 타액을 생성할 수 없는 환자가 치과 충치 또는 구강 칸디다증과 같은 질병을 개발하는 경향이 있는 의학 문제를 나타냅니다3. 또한 타액을 줄이면 음식 섭취와 소화가 삶의 질에 큰 영향을 미칩니다.
타액선 기능 장애는 주로 Sjögren 증후군, 자가 면역 질환또는 방사선 치료를 받은 두경부암 환자에서 3,4,5, 6. 자가 면역 또는 방사선 요법의 결과로 땀샘 내의 손상된 분비 아시니는 자가 갱신을 거치지 않아돌이킬 수없는 손상을 입은 환자가 6. 타액 선의 연구는 또한 바이러스 성 병인의 메커니즘에 관심이있는 주의 또는 연구원을 얻고있다. 인간 사이토메갈로바이러스(HCMV)와 같은 일부 병원체는 타액선 내에서 지속적으로 복제되며, 이는 타액7,8을통해 새로운 숙주에게 초기 바이러스의 전염을 허용한다. 따라서, 다양 한 의료 문제를 해결 하 고 이해 하는 타 액 선 조직의 강력 하 고 재현 가능한 생체 외 모델을 개발 하는 충족 되지 않은 필요가 있다.
뮤린 타액선 시스템의 여러 모델은 타액선을 형성하는 상피 세포를 이해하고 특성화하기 위한 출발점으로 사용되어 왔다9,10. 인간과 뮤린 타액선 사이에 는 명백하고 중요한 차이가 존재한다11. 가장 주목할 만한 인간 parotid 동맥은 하악골선과 관련하여 더 큰 반면 마우스 하악골과 parotid는크기 1,2,11에서훨씬 유사합니다. 불멸의 인간 하악 세포주들이 존재하지만, 불멸화된 세포가 1차 조직의 표현형을 정확하게 유지하지 못하고 불멸화된 세포가 실제로 유래되지 않는다는 이차적인 우려가 있다. 타액 상피 자체12. 이러한 이유로 인간에게서 1 차적인 타액 조직을 공부하는 관심과 필요가 있습니다.
여기에서 우리는 조직 배양을 위한 인간 적인 타액 선에서 1 차상 상피 세포를 격리하는 프로토콜을 기술합니다. 우리의 프로토콜은 프링글 외 와 트란 등의 작품을 기반으로 일반적으로 자신의 절차를 단순화하기 위해 만든 수정13,14. 첫째, Tran et al.의 프로토콜은 침 조직을 효소적으로 소화하기 위한 긴 5시간 배양을 요구하는 반면, 우리의 수정된 프로토콜은 프링글 외의 것과 유사한 1시간 배양으로 성공했습니다. 둘째, 우리는 조직 소화를 위해 다른 효소를 사용하며, 특히 원래 Tran et al. 프로토콜에서 사용되는 트립신을 사용하지 않고 대신 디스파제와 콜라게나아제의 혼합물을 사용합니다. 최근 연구에 의한 트립신의 초기 소화가 트립신에 의한 타액 조직의 초기 소화가 희귀 줄기 세포 집단(15)의 손실에 의해 세포생존력 감소의 결과로 이어질 수 있다는 것을 시사하면서 초기 소화 단계에서 트립신을 피하는 것을 선호한다. 마지막으로, 우리는 기관지 상피 세포의 전파를 위해 원래 제형화된 시판매체를 사용하여 지하 막 매트릭스(BMM)의 표면에 염구를 배양한다. 우리의 프로토콜은 타액 세포를 parotid, 하악골 및 전하 땀샘으로부터 분리하는 데 사용할 수 있습니다. 이들 세포는 타액 아밀라아제 및 다른 타액 특이적 유전자를 발현하여 타액 아피나 상피 세포의것과 유사한 표현형을 유지한다는 것을 나타낸다 7. 우리는 이 방법론을 사용하여 >50의 1차 인간 조직 샘플에서 타액 배양을 성공적으로 생성했습니다. 또한, 1 차 타액 세포는 쉽게 나중에 사용하기 위해 냉동 보존 될 수있다.
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Protocol
이러한 프로토콜과 연구는 신시내티 대학의 기관 검토 위원회에 의해 검토 되고 승인되었습니다 (연방 전체 보증 #00003152, IRB 프로토콜 2016-4183). 타액 조직은 일반적으로 많은 머리와 목 외과 적 절차에서 절제되고 일반적으로 악성 과정에 의해 관련되지 않습니다. 전형적으로, 갓 절제된 침샘 조직은 환자로부터 제거한 후 2-4시간 이내에 사용된다(도1A).
1. 시약 준비
-
기관지 상피 세포 성장 배지 (BEGM)
- 제조업체에서 제공하는 키트에서 구성 요소를 추가합니다(재료 표참조).
- 각 튜브를 베이스 매지로 한 번 세척하여 부품을 완전히 전달합니다. 그런 다음 숯을 벗겨진 태아 소 세럼을 추가하여 최종 농도인 4% 혈청을 만듭니다.
-
적혈구 (RBC) 라기 완충제
- 10x 스톡을 만들려면 NH4Cl 40.15 g, NaHCO35.0 g, 에틸렌디아미네테트라아세트산(EDTA) 0.186g을 추가하고 dH2O를 사용하여 최종 부피를 200mL까지 올린다. 그런 다음 걸기 살균하고 4 °C에서 보관하십시오.
- 사용하기 전에 멸균 dH2O에서 1x의 작동 농도로 희석하십시오.
-
해리 솔루션
- 디스파스 용액 100 mL 병에 (재료 표참조) 콜라게나제 타입 III 0.15 g을 추가하십시오. 콜라게나아제가 완전히 용해된 후, 필터는 새로운 용액과 알리쿼트(aliquot)를 살균합니다. -20 °C에서 보관하십시오.
2. 조직 소화
- 100 mm 조직 배양 판을 사용하여, 오토 클레이브 살균 해부 가위와 수술 집게를 사용하여 미세 한 조각 ~ 1-2mm 크기로조직을 기계적으로 다듬어 (그림1B,C). 조각 사이의 결합 조직은 추가 단계에서 적절한 분리와 용이성을 보장하기 위해 절단해야합니다.
- 다진 조직에 디스파스/콜라게나제 용액 6 mL를 추가합니다. 이어서 37°C에서 약 30분 내지 1시간 동안 배양한다.
- 5 mL 혈청학적 파이펫으로 15-20 회 파이펫팅하여 조직을 파괴하십시오.
- 37°C에서 30분 내지 1시간 동안 배양한다.
- 2.3 단계 와 2.4 단계를 2-3 번 더 반복하거나 조직이 슬러리와 유사할때까지 또는 피펫 개구부를 쉽게 통과 할 수 있습니다 (그림 1D).
참고: 조직 시편의 시작 크기와 조직 다진의 미세함은 2.3 단계 와 2.4 단계를 반복할 필요가 있는 횟수를 결정합니다. 전형적으로, 우리는 크기에 있는 대략 1 cm x 1 cm 조직을 수신합니다. 추가적으로, 하나는 조직으로부터 세포 해리의 진행을 추적하기 위해 표준 반전 된 조직 배양 현미경을 사용하여 조직 해리를 모니터링 할 수 있습니다. 세포의 작은 클러스터는 침구로 타액 세포의 초기 파생에 이상적입니다.
3. 지하 멤브레인 매트릭스로 우물 코팅
참고: 지하 멤브레인 매트릭스(BMM)는 사용 전날 4°C에서 밤새 해동되어야 합니다. 일단 해동되면, BMM은 얼음 또는 4 °C에서 지속적으로 유지되어야하며, 이는 따뜻한 온도에서 빠르게 고화 (즉, 젤을 형성)할 것입니다. 또한, 차가운 샘플이 BMM을 "녹이고 세포를 플라스틱 접시에 노출"하기 때문에 BMM에 도금하기 전에 얼음에 시료를 냉장 한 경우주의해야합니다.
- 천천히 피펫 BMM (재료의 표참조) 코팅 될 각 우물에. BMM을 웰 위에 고르게 서서히 분배합니다.
참고 : 일반적으로, 우리는 여섯 웰 플레이트의 각 우물 당 500 μL을 사용하지만,이 볼륨은 12 웰 또는 24 웰과 같은 플레이트의 다른 변형에 사용하기 위해 또는 더 두껍거나 얇은 하이드로 겔에 대한 원하는대로 조정할 수 있습니다. - BMM 시간이 고화될 수 있도록 사용하기 전에 적어도 15분 동안 코팅된 플레이트를 37°C에서 배양한다.
4. 소화되지 않은 조직의 필터링, RBC 분해 및 세포 도금
- 조직 균질화 를 단계 2.5에서 15 mL 원엽 관으로 전달합니다. Dulbecco의 인산완충 식염수(DPBS)의 6 mL로 한 번 세척하여 남은 세포를 이송합니다.
- 70 μm 나일론 메쉬 세포 스트레이너를 통해 50 mL 원엽 튜브로 균질계를 걸러 소화되지 않은 조직을 제거합니다. 원심 분리기 는 500 x g에서5 분 동안 세포를 변형시 .
- 멸균 dH 2O에서 10x RBC 용해 완충액을 희석하여 1x 작동 용액을 만듭니다.
- 상급자 흡인. 그런 다음 1x RBC 라시스 버퍼의 10 mL에서 세포 펠릿을 다시 중단합니다. 37 °C에서 5 분 동안 배양하십시오.
- RBC 용해 완충액을 중화하고 타액 세포의 용해를 최소화하기 위해 DPBS 20-25 mL을 추가하십시오. 500 x g에서 5 분 동안 원심 분리기 .
참고 : RBC 라시스 버퍼로 치료 한 후 세포 펠릿은 흰색이어야합니다. 펠릿의 붉은 색은 모든 RBC가 완전히 lysed되지 않았다는 것을 나타냅니다. 모든 RBC의 완전한 용해에 필요한 경우 4.4~4.5단계를 반복합니다. - 상급자 흡인. 잘 당 BEGM의 1-2 mL에 펠릿을 다시 일시 중단 한 다음 BMM 코팅 된 우물에 다시 부유 한 세포를 배치합니다. 37 °C에서 배양하십시오.
- 일단 BMM에 도금되면, 세포는 2-3 일 기간 동안 구형 구조물 또는 "salispheres"로 형성될 것입니다. 세포는 BMM이 분해되기 시작하기 전에 약 5-7 일 동안 타액구로서 유지될 수 있어 세포가 플라스틱에 접근하여 부착하고 단층으로 성장할 수 있도록 한다.
5. BMM에 침구 및 유지 보수를 침하
- 우물에서 흡인 제폐를 한 다음, 각 우물에 디스파제/콜라게나제 용액 1 mL을 넣고 37°C에서 ~15분 동안 또는 BMM이 대부분 용해될 때까지 배양합니다.
- 세포를 15 mL 원엽 튜브로 옮기고 DPBS로 웰을 한 번 세척하여 남은 세포를 얻습니다. 500 x g에서 5 분 동안 원심 분리기 .
- 상급자 흡인. 펠릿을 트립신 2 mL에서 다시 중단한 다음 37°C에서 15분 동안 배양합니다.
- 10% 혈청을 함유한 완전한 미디어를 사용하여 트립신을 중화시다. 500 x g에서 5 분 동안 원심 분리기 .
- 상급자 흡인. 잔류 매체, 트립신 및 혈청을 제거하기 위해 DPBS에서 세포를 다시 일시 중단하십시오. 500 x g에서 5 분 동안 원심 분리기 .
- 상급자 흡인. BEGM에서 다시 중단하고 다시 부유 한 세포를 응고 된 BMM 코팅 배양 접시에 접시. 재중단 된 세포는 또한 단층으로서 증식을 위해 세포 배양 처리 접시상에 직접 도금될 수 있다. 단일층으로 타액 세포의 성장에 관한 자세한 내용은 섹션 6을 참조하십시오. BMM 또는 플라스틱에서 자란 세포는 2-3 일마다 신선한 BEGM으로 공급해야합니다.
- 가습된 인큐베이터에서 세포를 배양하여 5% CO2로37°C에서 유지하였다.
6. 처리 된 플라스틱 조직 배양 접시에 침구를 subculturing
참고: 플라스틱의 단층으로 셀을 유지하는 경우 이 단계에서 시작하십시오. 다음 프로토콜은 100mm 접시에서 자라는 세포에 적용됩니다.
- 미디어를 흡인합니다. 잔류 매체를 제거하기 위해 DPBS로 한 번 씻으하십시오.
- 트립신 2 mL를 추가한 다음 37°C에서 15분 동안 또는 세포가 완전히 분리될 때까지 배양합니다.
- 10% 혈청을 함유한 완전한 매체의 4 mL를 사용하여 트립신을 중화시화하십시오. 세포를 15 mL 원엽 튜브로 옮김.
- 남은 세포를 수집하기 위해 DPBS의 약 5 mL로 플레이트를 한 번 씻으소서. 500 x g에서 5 분 동안 원심 분리기 .
- 상급자 흡인. 잔류 매체를 제거하기 위해 DPBS의 6-10 mL에서 세포를 다시 일시 중단합니다.
- 500 x g에서 5 분 동안 원심 분리기 .
- 상급자 인해 및 BEGM에서 다시 일시 중단. 처리 된 플라스틱 조직 배양 접시에 플레이트 세포. 2-3일마다 신선한 BEGM으로 먹이오시면 됩니다.
- 가습된 인큐베이터에서 세포를 배양하여 5% CO2로37°C에서 유지하였다.
7. 세포의 동결 보존
참고: 세포의 동결 보존은 침구 또는 단층 성장 세포에서 유래한 단일 세포 현탁액으로부터 수행될 수 있다.
- 혈세포계의 세포를 세어 존재하는 세포의 총량을 계산합니다.
- 500 x g에서 5 분 동안 원심 분리기 .
- 상급자 흡인. 10% 디메틸 설폭사이드(DMSO)로 BEGM에서 펠릿을 다시 일시 중단합니다. 세포의 농도는 2 x 106 세포 / mL ~ 10 x 106 세포 / mL이어야합니다.
- 멸균 극저온 저장 튜브에 알리쿼트 세포. 튜브를 절연 폼 랙에 놓고 밤새 -80°C에서 배양하여 세포를 천천히 동결시되게 합니다.
- 다음날, 장기간 보관을 위해 액체 질소에 튜브를 놓습니다.
참고: 세포는 37°C에서 빠르게 해동되어야 합니다. 해동 시, 세포는 500 x g에서 펠렛되어야하며 도금 전에 DMSO 함유 매체를 제거해야합니다.
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Representative Results
BMM에 소화 된 조직에서 세포를 도금 한 후 2-3 일, 세포는 쉽게 클러스터 당 최대 15-20 세포까지 크기로 확장 하는 작은 클러스터를 형성 할 것 이다 (그림2A). 세포 파편과 분리 된 죽은 세포는 일반적으로 볼 수 있으며 신선한 매체로 흡인하고 보충하여 제거해야합니다. 세포는 약 3-10 일 동안 침구로 증식하는 것을 계속할 것입니다, 또는 BMM 층이 손상되지 않은 상태로 남아 있는 한. 때때로, BMM의 부분적인 고장으로 인해, 세포는 기본 플라스틱에 부착되고 단층으로 증식하기 시작합니다. BMM에서 자란 살리스피어는 크기와 구조적 복잡성의 가변성을 나타낼 것입니다. 살리스피어는 프로토콜에 기재된 바와 같이 신선하게 제조된 BMM상에 전달함으로써 유지될 수 있다. 신선한 BMM에 전달 한 후 2-3 일 이내에 세포는 구체로 개혁됩니다. 살리스피어 세포는 또한 도2B에 도시된 바와 같이 세포 배양 처리 된 플라스틱 상에 도금되고 상피 기원의 세포와 일치하는 형태를 나타내는 단층으로 성장할 수 있습니다. 침구가 침액으로 BMM에서 성장하는 동안 타액 구는 타액 조직의 더 많은 특성을 표현형을 유지할 가능성이 있지만, 단층으로 성장한 세포는 일부 실험 프로토콜에 유리할 수 있습니다. 더 광범위한 특성화는 세포가 침구로 성장한 세포와 비교하여 단층에서 성장할 때 침 표현형을 어느 정도까지 유지하는지 결정하기 위해 수행되어야 할 것이다.
그림 1 : 살리스피어 준비를 위한 인간 하악골의 초기 처리. 절제 된 타 액 선 조직 직경 약1cm (A) 날카로운 가위를 사용 하 여 작은 조각으로 기계적으로 다진 (B) 선 크기 (C)의소화 조각으로 분리 될 때까지. 선 조각은 샘플이 주로 단일 세포 또는 세포의 작은 덩어리로 소화 될 때까지 혈청 피펫을 통해 주기적으로 통과하여 30-90 분 동안 디스파제/ 콜라게 나아제 용액에서 배양됩니다.(D). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 일차 인간 타액구 세포는 지하 막 매트릭스의 구체또는 처리된 세포 배양 접시의 단층으로 배양될 수 있다. 타액 조직의 초기 소화에 이어, 소화 된 땀샘은 BMM에 직접 도금되고 3-10 일 동안 배양됩니다. 세포는 신선한 영양소를 제공하기 위해 2-3 일마다 공급됩니다. 1 차 적인 살리구가 발전하면, 매트릭스는 디스파제/콜라게나제 용액으로 소화되고, 단일 세포를 생성하기 위해 트립시네이드를 생성하고, 신선한BMM에 다시 도금되어 구체(A)로 재구성하거나 세포 배양 접시에 도금할 수 있습니다. 상피 단층 (B)의 전형적인 조약돌 형태를 쉽게 형성한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
타액 기능 장애는 Sjögren 증후군을 앓고있는 사람들뿐만 아니라 침샘에 인접한 암에 대한 방사선 요법을받는 사람들을위한삶의 질에 대한 우려를 나타냅니다 3,4,5, 16. 이러한 환자를 치료하기 위한 하나의 제안된 치료법은 시험관 내에서 기능성 타액 줄기 세포 또는 오르가노이드를 성장시키는것이며, 이는 손상된 타액선에 삽입되어 영향을 받는 조직을 대체한다 9. 또한, 타액 선은 종종 인간의 병원체의 지속성과 전달을위한 사이트입니다. 예를 들어, 인간 시토메갈로바이러스(HCMV)와 같은 인간 헤르페스바이러스는 타액선과 타액을 감염시키고 이용하여 새로운 숙주에게 바이러스를 전달하는 것으로 알려져있다7,8,17. 타액선에 있는 바이러스성 지속성 및 타액에 운동 근본적인 분자 기계장치는 알려지지 않은 남아 있습니다. 시험관 내 타액 세포 시스템의 개발은 이 기계론적 정보를 탐구하는 필수적인 모형 시스템을 제공할 것입니다.
우리는 여기에서 BMM에 클러스터 또는 플라스틱에 단층으로 시험관내에서 성장할 수 있는 1 차적인 타액 "salispheres"를 생성하기 위한 강력한 프로토콜을 보고합니다. 1 차적인 인간 타액 선 상피 세포를 배양하고 전파하는 능력은 연구원이 (1) 잠재적으로 타액 선 결핍증을 가진 환자를 위한 대체 요법을 개발할 수 있는 중요한 플랫폼을 나타냅니다. 존재; (2) 타액선 발달, 증식, 분비 등 기본적인 생리학을 더 잘 이해한다. (3) 병원체가 새로운 숙주에게 복제하고 퍼지기 위해 사용하는 메커니즘을 정의합니다.
이러한 타액 세포 배양을 사용하여, 우리는 HCMV가 1 차 감염을 위한 pentameric 당단백질 복합체를 요구하고 또한 바이러스가 생체 내 HCMV로 일어나는 무슨을 연상시키는 연장된 기간 동안 지속한다는 것을 보고했다7. 더욱이, 우리의 기능적 연구는 타액 배양체가 섬유아세포열대로 오염된 섬유아세포를 포함하지 않는다는 것을 밝혀냈으며, 실험실적응형 바이러스는 1차 타액 유래 세포에서 감염 및 복제에 실패한다 7. 우리는 HCMV 복제의 평가를 위해 세포를 생성하고 1 차적인 타액 시스템에서 퍼지기 위하여 이 프로토콜을 이용하는 동안, 이 프로토콜은 위에서 언급한 연구 주제의 넓은 범위에 유용한 타액 세포를 생성하기 위하여 쉽게 적응될 수 있었습니다. 또한, 이 프로토콜은 각 개별 연구원의 필요와 예산에 맞게 조정될 수 있습니다. 우리는 다른 조건을 스스로 검증하지 는 않았지만, 다른 사람들은 다른 매체 조건하에서 타액 상피 세포를 성장시키는 성공을 보고했습니다. 예를 들어, 덜베코의 변형된 이글 배지(DMEM):표피 성장 인자 및 섬유아세포 성장 인자-2로 보충된 F12 혼합물은 타액 세포의 견고한 성장을 촉진하는 것으로 보고되었다18. 대안적으로, Nam et al. 세포를 각질세포 성장 매체의 혈청 없는 버전으로 옮기기 전에 태아 소 혈청으로 보충된 최소한의 필수 매체를 사용하고 플라스틱15에타액 세포의 견고한 성장을 보고하였다. 따라서, 타액 상피 세포가 하나의 특정 매질 유형에 대한 절대적인 요구 사항을 나타내는 것이 아니라, 오히려 다수의 시판되는 매체 유형에서 성장하고 증식하는 것으로 나타난다.
매체 제형 이외에, 다른 지하 막 제형은 강력한 타액 상피 세포 성장을 지원하는 그들의 능력을 위해 평가될 수 있었습니다. 시판되는 지하막-함유 매트릭스상에서 세포의 성장은 쉽게 타액구를 산출하고, 고가의배양 시스템 7,19이기는하지만 간단하고, 수율구를 제공한다. 세포 성장을 위한 매체의 선택에 관하여 위에서 토론한 것과 유사하게, 연구원은 다른 매트릭스 및 하이드로겔 시스템의 수에 살리스구의 성장 그리고 발달을 보고했습니다. 히알루론산으로 만든 하이드로겔은 세포에 대한 상호 작용과 효과를 연구하기 위해 원하는 화학 성분과 상호 연결된 세포 외 매트릭스를 만드는 데 추가적인 이점이 있습니다. 1 차적인 인간 조직 유래 타액 세포를 사용하여, Srinivasan 외. 히알루론산 하이드로겔에서 타액 전구 세포 집단의 성장 및 유지에 성공을 보고; 하이드로겔이 펄레칸 및 라미닌20과같은 지하 막 단백질로부터 유래된 펩타이드와 결합되었을 때 증가된 전구 세포 성장은 더욱 관찰되었다. Foraida 등에서 최근에 개발한 또 다른 시스템은 "전기 방사"를 사용하여 폴리(젖산-코글리콜산)(PLGA)로 만들어진 나노섬유 스캐폴드를 개발합니다. 첨가된 엘라스틴을 가진 PLGA 하이드로겔은 편광 된 하악 세포 시스템의 개발을 용이하게 촉진하는 것으로 나타났으며, 이는 세포 편광이 타액 생물학 및 생화학에 미치는 영향을 확인하는 데 유용 할 수 있습니다21.
이 프로토콜에서, 우리는 1 차 타액 선 유래 상피 세포의 분리 그리고 성장을 위한 간단한 방법을 제시했습니다. 이 프로토콜은 5-8 대계에 대해 평균적으로 유지될 수 있는 상피 세포 집단의 급속한 유출을 초래한다. 프로토콜에 언급 된 대로 적절 한 소화를 보장 하기 위해 dispase/콜라겐으로 치료 하는 동안 조직을 모니터링 하는 것이 중요 하다. 불완전한 소화는 살아남는 침구의 수를 심각하게 감소시것입니다. 또한 길쭉한 모양을 가지고 일반적으로 이산 패치 또는 덩어리에서 성장하는 다각형 상피 세포에서 매우 구별되는 섬유 아세포의 생성에 대한 배양을 모니터링하는 것이 중요합니다. 우리는 인간과 마우스에게서 상피 세포의 격리를 위해 이 프로토콜을 이용했습니다, 그러나 그밖 포유류 시스템과 사용을 위해 적응될 수 있었다는 것을 확률이 높습니다. 더욱이, 이 프로토콜은 더 균질한 초기 세포 집단의 생성으로 이어질 수 있는 세포 표면 마커 발현 및 유동 세포측정에 기초한 추가정제 단계를 사용하여 추가로 수정될 수 있었다. 유사하게, 이 프로토콜은 어떻게 다른 매체 또는 매트릭스/하이드로겔 제형이 먼저 살리스피어를 생성할 때 특정 세포 유형의 생성으로 이어지는지 결정하는 데 사용될 수 있다. 결론적으로, 이 프로토콜은 다양한 실험 프로토콜 및 연구 분야에 쉽게 적응할 수 있는 1차 타액 세포의 격리 및 성장을 위한 강력한 시작 플랫폼역할을 해야 한다.
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Disclosures
저자는 공개 아무것도보고하지 않습니다.
Acknowledgments
우리는 1 차적인 세포를 배양하기 위한 관련시킨 방법론에 중요한 지도를 제공하는 제임스 P. Bridges에게 감사하고 싶습니다. 매튜 J. Beucler 건강 교육 그랜트 T32-ES007250의 국립 연구소에 의해 지원 되었다. 이 작품은 또한 윌리엄 E. 밀러에 수여 건강 보조금 R01-AI121028 및 R21-DE026267의 국립 연구소에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mm culture dishes | Thermo Scientific | 172931 | |
| 15 mL conical tubes | Thermo Scientific | 339651 | |
| 50 mL conical tubes | Thermo Scientific | 339653 | |
| Bronchial Epithelial Cell Growth Media | Lonza | CC-3171 | Add bullet kit as per manufacturer's instructions. Supplement with 20 mL of charcoal stripped serum. |
| Cell strainer 70 µm nylon mesh | Fisher | 22-363-548 | |
| Charcoal stripped fetal bovine serum | Gibco | 12676-029 | |
| Collagenase type III | Worthington | LS004182 | Store at 4 °C. |
| Cryogenic Tube | Fisher | 5000-0020 | |
| Dispase | Cell Applications | 07923 | Dissolve collagenase to make a 0.15% (w/v) stock. Filter sterilize then store at -20 °C. |
| Dissecting scissors | Fisher | 08-940 | |
| Dulbecco phosphate buffered saline | Corning | 55-031-PC | |
| General Chemicals | Sigma | ||
| PathClear Basement membrane extract | Cultrex | 3432-005-01 | Thaw at 4 °C at least 24 hr prior to use. Always handle on ice. |
| Six-well culture dishes | Falcon | 353046 | |
| Surgical forceps | Fisher | 22-079-742 | |
| Trypsin-EDTA solution | Corning | 25-052-CI |
References
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