Summary
Birincil insan tükürük bezi türevi epitelyal hücreleri izole etmek ve yetiştirmek için bir yöntem sunuyoruz. Bu hücreler onları tükürük epitelyal orijinli olmak ile tutarlı gen ifade desenleri sergiler ve Engelbreth-Holm-Swarm tümör hücrelerinden türetilen Bodrum membran matrisleri üzerinde salispheres olarak veya tedavi kültür yemekleri monolayers olarak yetişebilir.
Abstract
Tükürük bezleri insan hastalığının birden fazla yönü ile ilgilenen araştırmacılar için önemli bir ilgi alanı vardır. Araştırmacıların bir amacı, Radyasyon terapileri veya Sjögren sendromu ile ilişkili patolojiler nedeniyle hasar görmüş bezlerin fonksiyonunu geri yüklemek. Araştırmacıların ikinci hedefi, virüslerin glandüler doku içinde çoğaldığı mekanizmaları tanımlamaktır, böylece yatay iletim için önemli olan tükürük sıvılarına erişim sağlayabilirler. Bu hedefler yukarıda bahsedilen yanı sıra ilgili araştırma alanları ile ilgilenen araştırmacılar tarafından kullanılabilecek sağlam ve erişilebilir bir in vitro tükürük bezi modeli için ihtiyaç vurgulayın. Burada, epitelyal hücreleri insan tükürük bezlerinden yalıtmak ve onları in vitro yaymak için basit bir protokol tartışıyoruz. Protokollerimiz, bireysel çalışmaların ihtiyaçlarını karşılamak için daha da optimize edilebilir. Kısaca, tükürük dokusu mekanik ve enzince tek hücreleri veya hücrelerin küçük kümeleri yalıtmak için ayrılır. Epitelyal hücreler için seçim, epitelyal hücre büyümesini teşvik etmek için optimize edilmiş medyanın varlığında bir Bodrum membran matrisinin üzerine kaplamadan oluşur. Bu ortaya çıkan kültürler üç boyutlu kümeleri olarak muhafaza edilebilir, "salispheres" olarak adlandırılan, ya da tedavi plastik doku kültürü yemekleri bir tek tabakalı olarak büyüdü. Bu protokol, hücresel senescence yapmadan önce 5-8 pasajlar (15-20 nüfus doublings) için yayılabilir ağırlıklı olarak epitelyal hücrelerin heterojen bir nüfusun gelişmesinde sonuçlanır.
Introduction
Memelilerde, tükürük bezleri 3 çift büyük tükürük bezi halinde düzenlenmiştir: parotis, submandibular ve dil altı bezleri. Ayrıca dilde bulunan ve ağız boşluğu boyunca dağınık küçük bezleri bir dizi var1. Büyük bezleri üretilen tükürük toplu hacminin sorumludur2. Salgılanmış faktörler aracılığıyla antimikrobiyal koruma sağlamaya ek olarak, tükürük, özofagus2' den geçerken gıda çiğneme ve yağlama sürecinde önemlidir. Bu nedenle, tükürük bezi disfonksiyon yeterli tükürük üretmek mümkün olmayan hastalarında diş boşlukları veya oral kandidiyasis3gibi maladies gelişmekte daha eğilimli olduğu bir tıbbi sorunu temsil eder. Ayrıca, düşük tükürük sonuçları yaşam kalitesi üzerinde önemli bir etkiye sahip yemek ve sindirme daha fazla zorluk.
Tükürük bezi disfonksiyon öncelikle Sjögren sendromu muzdarip hastalarda bulunur, otoimmün bozukluk, ya da ışınlama terapisi geçirmiş olan baş ve boyun kanseri olan hastalarda3,4,5, 6' ya kadar. Otoimmünite veya radyasyon tedavisinin bir sonucu olarak bezler içinde hasarlı salgını acini kendi kendine yenilenmez, bu da geri dönüşümsüz hasar6ile yaşayan bir hasta ile sonuçlanır. Tükürük bezleri çalışma da dikkat veya viral patogenezi mekanizmaları ile ilgilenen araştırmacılar topladı. İnsan sitomegalovirüs (HCMV) gibi bazı patojenler, daha sonra tükürük7,8üzerinden yeni bir ana bilgisayara doğmakta olan virüsü iletimi için izin veren tükürük bezleri içinde ısrarla çoğaltır. Böylece, çeşitli tıbbi sorunları çözmek ve anlamak için tükürük bezi dokusunun sağlam ve tekrarlanabilir in vitro modellerini geliştirmek için karşılanmamış bir ihtiyaç vardır.
Murine tükürük bezi sisteminin birkaç modeli, tükürük bezlerini oluşturacak farklı epitelyal hücreleri anlamak ve karakterize etmek için bir başlangıç noktası olarak kullanılmıştır9,10. İnsan ve murine tükürük bezleri arasında açık ve önemli farklar var11. Fare submandibular ve parotis boyutu1,2,11çok benzer iken en önemlisi insan parotis bezi submandibular bezi ile ilgili olarak daha büyük. Ölümsüzleştirilmiş insan submandibular hücre hatları var iken, ölümsüzleştirilmiş hücrelerin doğru birincil doku ve ikincil endişeleri fenotipi korumak değil büyük endişeleri vardır ölümsüzleştirilmiş hücreler aslında türetilmemiş tükürük epitelin kendisi12. Bu nedenlerle bir ilgi ve insanlardan birincil tükürük dokusu çalışması için bir ihtiyaç vardır.
Burada, primer epitelyal hücreleri doku kültürü için insan tükürük bezlerinden yalıtmak için bir protokol açıklanmaktadır. Protokollerimiz Pringle ve al. ve Tran ve Al 'ın eserlerine dayanmaktadır. genellikle prosedürlerini kolaylaştırmak için yapılan değişikliklerle13,14. İlk olarak, Tran ve al. ' nin Protokolü, tükürük dokusunu enzikatik olarak sindirmek için uzun bir beş saatlik kuluçka çağrısı yaparken, modifiye protokolüm, Pringle ve Al 'da benzer şekilde bir saatlik kuluçka gibi az başarılı olmuştur. İkinci olarak, doku sindirimi için farklı enzimler kullanıyoruz, özellikle de orijinal Tran ve el protokolünde kullanılan tripsin kullanmayın, ancak bunun yerine dispaz ve collagenase karışımı kullanın. Biz yeni bir çalışma olarak ilk sindirim adımlarında tripsin önlemek için tercih düşük hücre viability tripsin sonuçları tarafından tükürük dokusunun ilk sindirim, muhtemelen nadir bir kök hücre nüfus kaybı tarafından önerilen15. Son olarak, biz kültür Bodrum membran matris (BMM) yüzeyinde salispheres aslen bronş epitelyal hücrelerin yayılması için formüle ticari olarak kullanılabilen bir medya kullanarak. Protokollerimiz, parotis, submandibular ve altdilde bezlerden gelen tükürük hücrelerini izole etmek için kullanılabilir. Bu hücreler, tükürük asiner epitelyal hücrelerine benzer bir fenotip bulundurduğunu gösteren tükürük amilaz ve diğer tükürük spesifik genlerini ifade ederler7. Bu metodolojisi kullanarak > 50 primer insan dokusu örneklerinden tükürük kültürlerini başarıyla üretiyoruz. Dahası, birincil tükürük hücreleri kolayca daha sonraki bir tarihte kullanılmak üzere kriokonservirovannogo olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu protokoller ve çalışmalar Cincinnati Üniversitesi 'nde (Federal kapsamlı güvence #00003152, ıRB protokol 2016-4183) Kurumsal Inceleme Kurulu tarafından gözden geçirildi ve onaylanmıştır. Tükürük dokusu yaygın olarak birçok baş ve boyun cerrahi prosedürlerinde rezeke edilir ve genellikle malign süreç tarafından yer almaz. Genellikle, hasta (Şekil 1a) kaldırıldıktan sonra 2-4 h içinde taze rezeke tükürük bezi dokusu kullanılır.
1. reakajın hazırlanması
-
Bronşiyal epitelyal hücre büyüme ortamı (BEGM)
- Üretici tarafından sağlanan Kitten bileşenler ekleyin ( malzeme tablosunabakın).
- Bileşenlerin tam transferini sağlamak için her tüpü temel medyadan bir kez yıkayın. Sonra% 4 serum son konsantrasyon yapmak için kömür aldı fetal Sığır serum ekleyin.
-
Kırmızı kan hücresi (RBC) liziz tamponu
- 10X stok yapmak, eklemek 40,15 g NH4Cl, 5,0 g NaHCO3, ve 0,186 g ethylenediaminetetraasetic asit (EDTA) ve son hacmine kadar getirmek 200 ml kullanarak DH2O. Sonra filtre sterilize ve 4 °C ' de saklayın.
- Steril dH2O önce kullanım için 1 bir çalışma konsantrasyonu seyreltildi.
-
Dissociation çözüm
- Bir 100 ml şişe dispase çözüm için (bkz: malzeme tablosu) eklemek 0,15 g kolajenaz türü III. Kolajenaz tamamen çözülür sonra filtre sterilize yeni çözüm ve aliquot. -20 °C ' de saklayın.
2. doku sindirim
- 100 mm 'lik doku kültürü plakasını kullanarak, dokuyu, otoklav sterilize edilmiş Diseksiyon makas ve cerrahi forseps (Şekil 1B,C) kullanarak ince parçalara% ~ 1-2 mm 'lik bir boyutta yerleştirin. Parçaları arasında bağ dokusu doğru ayırma ve daha fazla adımda kolaylığı sağlamak için kesilmelidir.
- Kıyılmış dokuya dispase/collagenase çözeltisi 6 mL ekleyin. Sonra yaklaşık 30 dk 1 h için 37 °C ' de inkübe.
- 5 mL serolojik pipet 15-20 kez pipetleme ile dokusu bozar.
- 37 °C ' de 30 dakika ila 1 saat arasında inküye yapın.
- 2,3 ve 2,4 iki-üç kez daha veya doku bir bulamaç benzer ve kolayca pipet açma (Şekil 1D) geçebilirsiniz adımları yineleyin.
Not: Doku örneğinin başlangıç boyutu ve doku kıyma ne kadar hassas bir adım 2,3 ve 2,4 tekrarlamak için gereken kaç kez belirleyecektir. Tipik olarak, yaklaşık 1 cm x 1 cm boyutunda doku alırsınız. Ayrıca, bir standart ters doku kültürü mikroskop kullanarak doku ayrışma izleyebilirsiniz doku hücre dağılma ilerlemesini izlemek için. Küçük hücreler kümeleri salispheres olarak tükürük hücrelerinin ilk büyüme için idealdir.
3. Bodrum membran matrisli kaplama kuyuları
Not: Bodrum membran matrisi (BMM), kullanılacak gün önce 4 °C ' de bir gecede çözülür. Çözülmüş bir kez, BMM sürekli buzda veya 4 °C ' de hızlı bir şekilde (yani, bir jel formu) sıcak sıcaklıklarda korunmalıdır. Ayrıca, örnekler soğuk numuneler BMM "eritmek" ve plastik çanak hücreleri açığa olacak gibi BMM kaplama önce buz üzerinde soğutulmuş olsaydı bakım alınmalıdır.
- Yavaşça BMM pipet ( malzeme tablosunabakın) her iyi içine kaplanmış. BMM 'ye eşit ve yavaşça kuyu üzerinde dağıtın.
Not: genellikle, altı-kuyu plakasının her bir kuyusu için 500 μL kullanıyoruz, ancak bu hacim 12-Well veya 24-Well gibi plakaların diğer varyantları için veya kalın veya daha ince Hidrojeller için istenilen şekilde ayarlanabilir. - 37 °C ' de kaplı plakaları, BMM 'nin yeniden katılaşma süresi için en az 15 dakika önce kullanın.
4. sindirilmemiş doku, RBC lizis ve hücre kaplama filtreleme
- Transfer doku homojenatı adım 2,5 için 15 ml konik tüp. Kalan hücreleri aktarmak için 6 mL Dulbecco fosfat tamponlu tuz (DPBS) ile bir kez yıkayın.
- Sindirilmemiş dokusu kaldırmak için bir 70 μm naylon kafes hücre süzgeci ile bir 50 mL konik tüp içine homojenlik filtre. Santrifüjler 500 x g'de 5 dakika boyunca gergin hücreler.
- 1 adet çalışma çözeltisi yapmak için steril dH2O 'DA 10X RBC lizis tamponunu seyreltin.
- Süpernatant aspirate. Sonra 10 ml 1x RBC liziz tampon hücre Pelet pelletini. 37 °C ' de 5 dak.
- 20-25 mL DPBS ekleme RBC liziz tamponu nötralize ve tükürük hücrelerinin liziz en aza indirmek için. 500 x g'de 5 dakika Santrifüjü.
Not: RBC liziz tampon ile tedavi sonra, hücre peleti beyaz olmalıdır. Pelet kırmızı renk tüm RBC tamamen lysed olduğunu gösterir. Tüm RBC tam liziz için gerekirse 4,4 ile 4,5 arasındaki adımları yineleyin. - Süpernatant aspirate. İyi başına Begm 1-2 ml içinde Pelet resuspend sonra BMM kaplı kuyuları üzerine yer resuspended hücreler. 37 °C ' de Inküye yapın.
- Bir kez BMM üzerinde kaplama, hücreler küresel yapıları veya "salispheres" bir 2-3-gün dönemi boyunca oluşturur. Hücreler için salispheres olarak muhafaza edilebilir yaklaşık 5-7 gün önce BMM hücreleri erişmek ve plastik uymak ve bir monolayer olarak büyümek izin düşürmeye başlar.
5. BMM üzerinde salispheres ve bakım subculturing
- Kuyular medya aspirate, daha sonra 1 mL dispase/collagenase çözeltisi her iyi ekleyin ve ~ 15 dakika veya BMM çoğunlukla çözünmüş kadar 37 °C ' de inküye.
- Kalan hücreleri elde etmek için hücreleri bir kez DPBS ile 15 mL konik boruya aktarın ve kuyuları yıkayın. 500 x g'de 5 dakika Santrifüjü.
- Süpernatant aspirate. 2 ml tripsin içinde Pelet resuspend sonra 15 dakika için 37 °c ' de inkübe.
- % 10 serum içeren tüm ortamları kullanarak tripsin nötralize. 500 x g'de 5 dakika Santrifüjü.
- Süpernatant aspirate. Kalan medyayı, tripsin ve serumu kaldırmak için DPBS 'deki hücreleri yeniden resuspend. 500 x g'de 5 dakika Santrifüjü.
- Süpernatant aspirate. Resuspend BEGM ve plaka üzerine resuspended hücreler üzerine katılaştırılmış BMM kaplı kültür yemekleri. Resuspended hücreler de doğrudan hücre kültürü üzerine kaplı olabilir bir monolayer olarak proliferasyon için yemekler tedavi. Bir monolayer olarak tükürük hücrelerinin büyümesi ile ilgili daha fazla bilgi için Bölüm 6 ' ya bakın. BMM veya plastik üzerinde yetiştirilen hücreler her 2 – 3 günde bir taze BEGM ile beslenmelidir.
- % 5 CO2Ile 37 °c ' de tutulan nemlendirilmiş bir kuluçin hücrelerinin kültürü.
6. tedavi plastik doku kültürü yemekleri üzerinde salispheres subculturing
Not: hücreleri plastik üzerinde bir tek tabakalı olarak koruyarak, bu adımda başlayın. Aşağıdaki protokol 100 mm 'lik bir çanak içinde büyüyen hücrelere uygulanır.
- Medyayı aspirate. Kalan medyayı kaldırmak için DPBS ile bir kez yıkayın.
- 2 mL tripsin ekleyin, ardından 37 °C ' de 15 dakika veya hücreler tamamen ayrılıncaya kadar inküye yapın.
- % 10 serum içeren herhangi bir komple medyanın 4 mL 'ini kullanarak tripsin nötralize edilmesi. Hücreleri 15 mL Konik Tüpe aktarın.
- Kalan hücreleri toplamak için yaklaşık 5 mL DPBS ile plakayı bir kez yıkayın. 500 x g'de 5 dakika Santrifüjü.
- Süpernatant aspirate. 6-10 mL DPBS içinde resuspend hücreler kalan medya kaldırmak için.
- 500 x g'de 5 dakika Santrifüjü.
- Begm süpernatant ve pelletini aspirate. Tedavi plastik doku kültürü yemekleri üzerine plaka hücreleri. Her 2-3 gün taze BEGM ile yem.
- % 5 CO2Ile 37 °c ' de tutulan nemlendirilmiş bir kuluçin hücrelerinin kültürü.
7. hücrelerin ağaloprezervasyon
Not: hücrelerin Cryopreservation, ya salisphere veya tek tabakalı yetiştirilen hücrelerden kaynaklanan tek bir hücre süspansiyondan gerçekleştirilebilir.
- Mevcut hücrelerin toplam miktarını hesaplamak için bir hematokytometer üzerindeki hücreleri saymak.
- 500 x g'de 5 dakika Santrifüjü.
- Süpernatant aspirate. % 10 dimetil sülfoxid (DMSO) ile Begm içinde Pelet resuspend. Hücreler konsantrasyonu 2 x 10 6 hücreler/ ml 10 x 106 hücreler/ml olmalıdır.
- Steril kriyojenik depolama tüpleri içine aliquot hücreleri. Tüpleri yalıtılmış bir köpük rafına yerleştirin ve hücreleri yavaşça dondurmak için-80 °C ' de bir gecede inküye yapın.
- Ertesi gün, uzun süreli depolama için sıvı nitrojen yerleştirin tüpler.
Not: hücreler 37 °C ' de hızla çözülür. Çözülür üzerine, hücreler 500 x g ve DMSO-kaplama önce kaldırıldı medya içeren pelleted olmalıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
İki-üç gün sonra BMM üzerine sindirilmiş doku hücreleri kaplama, hücreler kolayca küme başına 15-20 hücre boyutuna kadar genişletmek için devam edecek küçük kümeleri oluşturacak (Şekil 2a). Hücresel enkaz ve müstakil ölü hücreler genellikle görülür ve taze medya ile duman çekiş ve yenileyici tarafından kaldırılması gerekir. Hücreler yaklaşık 3-10 gün boyunca salispheres olarak çoğalırlar devam edecektir, ya da sürece BMM tabaka bozulmamış kalır. Bazen, BMM kısmi dökümü nedeniyle, hücreler temel plastik bağlı olacak ve bir monolayer olarak çoğalırlar başlar. BMM 'de yetiştirilen salispheres boyutu ve yapısal karmaşıklık değişkenlik gösterecektir. Salispheres, protokolde açıklandığı gibi taze hazırlanmış BMM 'ye geçirerek muhafaza edilebilir. 2-3 gün içinde taze BMM üzerine geçtikten sonra, hücreler küreler içine reform olacaktır. Salisphere hücreler de hücre kültürü-tedavi plastik üzerine kaplama ve Şekil 2B'de gösterildiği gibi epitelyal orijinli hücreler ile tutarlı morfoloji sergiler bir tek tabakalı olarak yetiştirilen olabilir. Salispheres olarak BMM üzerinde yetiştirilen salisphere hücreleri tükürük dokusu daha karakteristik bir fenotip korumak muhtemeldir iken, bir tek tabakalı olarak yetiştirilen hücreler bazı deneysel protokoller için avantajlı olabilir. Daha geniş karakterizasyon ne ölçüde hücreler salispheres olarak yetiştirilen hücrelere kıyasla bir tek tabakalı üzerinde yetiştirilen bir tükürük fenotipi korumak belirlemek için gerçekleştirilmesi gerekir.
Şekil 1 : Salisphere hazırlığı için insan submandibular bezlerinin ilk işlenmesi. Yaklaşık olarak 1 cm çapında (A), bezin yaklaşık 1-2 mm boyutunda (C) sindirilebilir parçalara ayrılması kadar, keskin makas (B) kullanarak küçük parçalara mekanik olarak taşmış olan ekselleştirilmiş tükürük bezi dokusu. Glandüler parçalar daha sonra örnek çoğunlukla tek hücrelere veya hücrelerin küçük kümeleri (D) sindirilmiş kadar serolojik pipetler aracılığıyla periyodik geçiş ile 30-90 dakika için dispase/collagenase çözeltisi içinde inkübe edilir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 2 : Primer insan salisphere hücreleri, Bodrum membran matrisinde küreler olarak veya tedavi edilen hücre kültürü yemeklerinde bir tek tabakalı olarak kültürlü olabilir. Tükürük dokusunun ilk sindirimi sonrasında, sindirilmiş bezleri doğrudan BMM üzerine kaplı ve 3-10 gün boyunca kültürlü. Hücreler taze besin sağlamak için her 2-3 gün beslenir. Birincil salispheres geliştirdikten sonra, matrisler dispase/collagenase solüsyonu sindirilebilir, tek hücreler oluşturmak için tripsinize, ve onlar küreler içine reform nerede taze BMM üzerine yeniden kaplama (A) ya da hücre kültürü yemekleri üzerine kaplama nerede onlar kolayca bir epitelyal Tek tabakalı tipik bir Arnavut kaldırımlı morfoloji formu (B). Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tükürük disfonksiyon, Sjögren sendromundan muzdarip olanlar için yaşam kalitesinin yanı sıra tükürük bezlerine bitişik kanserler için radyasyon terapisi3,4,5, 16 yaşında. Bu hastalar tedavi etmek için bir önerilen terapi fonksiyonel tükürük kök hücreleri veya organoids içinde vitro, daha sonra etkilenen doku9yerine hasarlı tükürük bezi içine eklenebilir büyümek etmektir. Ayrıca, tükürük bezleri genellikle kalıcı ve insan patojenlerin iletimi için bir sitedir. Örneğin, insan sitomegalovirus (HCMV) gibi insan herpesvirüsler enfekte ve yeni hosts7,8,17virüs iletmek için tükürük bezleri ve tükürüğü kullanmak bilinmektedir. Tükürük bezinde viral kalıcılığı temel alan moleküler mekanizmalar ve tükürüğe hareket bilinmiyor. İn vitro tükürük hücre sistemlerinin geliştirilmesi, bu mekanik bilgileri keşfetmek için temel bir model sistemi sağlayacaktır.
Burada, BMM 'de kümeler olarak ya da plastik üzerinde monolayers olarak yetiştirilen, ana tükürük "salispheres" üretmek için sağlam bir protokol bildiriyoruz. Kültür ve primer insan tükürük bezi epitelyal hücreleri yaymak için yetenek hangi araştırmacılar olabilir önemli bir platform temsil eder (1) potansiyel tükürük bezi eksiklikleri olan hastalar için yedek tedaviler geliştirmek kim başka hiçbir seçenek yok (2) daha iyi tükürük bezi gelişimi, proliferasyon, salgılanma, vb temel fizyolojisi anlamak; ve (3) yeni konaklara çoğalmak ve yaymak için patojenler tarafından kullanılan mekanizmaları tanımlayın.
Bu tükürük hücre kültürlerini kullanarak, biz HCMV primer enfeksiyon için pentamerik glikoprotein kompleksi gerektirir ve aynı zamanda virüsün uzun bir süre devam ettiğini bildirdik, HCMV içinde vivo7ile neler olduğunu anımsatan. Dahası, fonksiyonel çalışmalarımız, tükürük kültürlerinin fibroblast Tropic gibi kontamine fibroblastlar içermediğini, laboratuvarda adapte edilen virüslerin primer tükürük türevi hücrelerde enfekte olmasına ve çoğalmaya başarısız olduğunu ortaya koydu7. Biz bu protokol HCMV çoğaltma ve birincil tükürük sisteminde Spread değerlendirilmesi için hücreler oluşturmak için kullanılan iken, bu protokol kolayca tükürük hücreleri yukarıda bahsedilen geniş araştırma konuları için yararlı üretmek için adapte edilebilir. Ayrıca, bu protokol her bir araştırmacının ihtiyaçlarına ve bütçesine uyacak şekilde adapte edilebilir. Biz diğer koşulları kendimizi doğrulanmadı iken, diğerleri farklı medya koşullarında altında tükürük epitelyal hücreleri büyüyen başarı bildirdi. Örneğin, Dulbecco 'nun modifiye kartal Orta (DMEM): F12 karışımı epidermal büyüme faktörü ve fibroblast büyüme Factor-2 ile tamamlayıcı tükürük hücrelerinin sağlam büyüme teşvik bildirilmiştir18. Alternatif olarak, Nam ve al. bir keratinosit büyüme medyanın serum içermeyen sürümüne hücreleri aktarmadan önce fetal sığır serumu ile tamamlayıcı minimal temel medya kullanın ve plastik üzerinde tükürük hücrelerinin sağlam büyüme bildirdi15. Böylece, tükürük epitelyal hücrelerin belirli bir medya türü için mutlak bir gereksinim sergiler, ancak daha ziyade büyümek ve ticari olarak kullanılabilir medya türleri bir dizi çoğalırlar görünür görünmüyor.
Medya formülasyonuna ek olarak, farklı Bodrum membran formülasyonları güçlü tükürük epitelyal hücre büyümesini desteklemek için yeteneklerini değerlendirilebilir. Ticari olarak kullanılabilir Bodrum membranı içeren matrisler üzerinde hücrelerin büyümesi kolayca salispheres verim ve basit sağlar, olsa pahalı kültür sistemi7,19. Hücre büyümesi için medya seçimi ile ilgili yukarıda tartışılan benzer, araştırmacılar farklı matrisler ve hidrojel sistemleri bir dizi üzerinde salispheres büyüme ve gelişimi bildirdi. Hyaluronik asit yapılan Hidrojeller hücrelerde etkileşimleri ve etkilerini incelemek için istenilen kimyasal bileşenleri ile çapraz bir ekstrenüler matris oluşturma ek yararı var. Primer insan dokusu kullanarak tükürük hücreleri türetilmiştir, yılmaz ve al. hyaluronik asit Hidrojeller bir tükürük progenitör hücre nüfusunun büyüme ve bakım rapor başarı; artmış progenitör hücre büyümesi daha fazla Hidrojeller perlecan ve laminin20gibi Bodrum membran proteinlerden türetilen peptidler ile dahil edildi gözlenen. Son zamanlarda foraida ve al. tarafından geliştirilen başka bir sistem poli (laktik-Co-Glikolik asit) (PLGA) yapılmış bir nanolifi iskele geliştirmek için "Elektrospinning" kullanarak rapor. Ek elastin ile PLGA hidrogeller kolayca hücre polarizasyon tükürük biyoloji ve biyokimya21etkiler nasıl ascertaining yararlı olabilir bir polarize submandibular hücre sisteminin gelişimini teşvik bulundu.
Bu protokolde, primer tükürük bezi türevi epitelyal hücrelerin izolasyonu ve büyümesi için basit bir yöntem sunduk. Bu protokol, 5-8 geçimleri için Ortalama olarak muhafaza edilebilir bir epitelyal hücre popülasyonunun hızlı gelişmesinde sonuçlanır. Protokolde belirtildiği gibi uygun sindirim sağlamak için dispaz/collagenase ile tedavi sırasında doku izlemek için önemlidir. Tamamlanmamış sindirim, hayatta kalan salispheres sayısını ciddi şekilde azaltacaktır. Aynı zamanda, uzun bir şekle sahip fibroblastların gelişimi için kültürler izlemek ve genellikle ayrık yamalar veya kümeleri büyümek Çokgen epitelyal hücrelerden çok farklıdır önemlidir. Biz insan ve fareler epitelyal hücrelerin yalıtım için bu protokolü kullandık, ama diğer memelinin sistemleri ile kullanılmak üzere adapte olabilir muhtemelen görünüyor. Dahası, bu protokol daha homojen ilk hücre nüfus nesil yol açabilir hücre yüzeyi Marker ifade ve akış sitometri dayalı ek arıtma adımları kullanılarak daha da değiştirilebilir. Benzer şekilde, bu protokol, farklı ortam veya matris/Hidrojeller formülasyonunun ilk salispheres oluştururken belirli hücre türlerinin gelişmesine neden belirlemek için kullanılabilir. Sonuç olarak, bu protokol, çok çeşitli deneysel protokoller ve araştırma alanları için adapte edilebilir primer tükürük hücrelerinin izolasyonu ve büyümesi için sağlam bir başlangıç platformu olarak hizmet etmelidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa etmek için hiçbir şey rapor.
Acknowledgments
Biz birincil hücreler kültür için yer metodolojileri önemli rehberlik sağlamak için James P. Bridges teşekkür etmek istiyoruz. Matthew J. Beucler sağlık eğitim hibe T32-ES007250 Ulusal Enstitüleri tarafından destekleniyordu. Bu çalışma Ayrıca Ulusal Sağlık Bursları R01-AI121028 ve R21-DE026267 tarafından William E. Miller 'a verilir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mm culture dishes | Thermo Scientific | 172931 | |
| 15 mL conical tubes | Thermo Scientific | 339651 | |
| 50 mL conical tubes | Thermo Scientific | 339653 | |
| Bronchial Epithelial Cell Growth Media | Lonza | CC-3171 | Add bullet kit as per manufacturer's instructions. Supplement with 20 mL of charcoal stripped serum. |
| Cell strainer 70 µm nylon mesh | Fisher | 22-363-548 | |
| Charcoal stripped fetal bovine serum | Gibco | 12676-029 | |
| Collagenase type III | Worthington | LS004182 | Store at 4 °C. |
| Cryogenic Tube | Fisher | 5000-0020 | |
| Dispase | Cell Applications | 07923 | Dissolve collagenase to make a 0.15% (w/v) stock. Filter sterilize then store at -20 °C. |
| Dissecting scissors | Fisher | 08-940 | |
| Dulbecco phosphate buffered saline | Corning | 55-031-PC | |
| General Chemicals | Sigma | ||
| PathClear Basement membrane extract | Cultrex | 3432-005-01 | Thaw at 4 °C at least 24 hr prior to use. Always handle on ice. |
| Six-well culture dishes | Falcon | 353046 | |
| Surgical forceps | Fisher | 22-079-742 | |
| Trypsin-EDTA solution | Corning | 25-052-CI |
References
- Kessler, A. T., Bhatt, A. A. Review of the Major and Minor Salivary Glands, Part 1: Anatomy, Infectious, and Inflammatory Processes. Journal of Clinical Imaging Science. 8, 47 (2018).
- Holmberg, K. V., Hoffman, M. P. Anatomy, Biogenesis and Regeneration of Salivary Glands. Monographs in Oral Science. Ligtenberg, A. J. M., Veerman, E. C. I. 24, S. KARGER AG. 1-13 (2014).
- Vissink, A., et al. Prevention and Treatment of the Consequences of Head and Neck Radiotherapy. Critical Reviews in Oral Biology & Medicine. 14, 213-225 (2003).
- Gualtierotti, R., Marzano, A., Spadari, F., Cugno, M. Main Oral Manifestations in Immune-Mediated and Inflammatory Rheumatic Diseases. Journal of Clinical Medicine. 8, 21 (2018).
- Tsukamoto, M., Suzuki, K., Takeuchi, T. Ten-year observation of patients with primary Sjögren's syndrome: Initial presenting characteristics and the associated outcomes. International Journal of Rheumatology. Dis. , (2018).
- Dirix, P., Nuyts, S., Van den Bogaert, W. Radiation-induced xerostomia in patients with head and neck cancer: A literature review. Cancer. 107, 2525-2534 (2006).
- Morrison, K. M., et al. Development of a primary human cell model for the study of human cytomegalovirus replication and spread within salivary epithelium. Journal of Virology. , (2018).
- Pomeroy, C., Englund, J. A. Cytomegalovirus: epidemiology and infection control. American Journal of Infection Control. 15, 107-119 (1987).
- Maimets, M., et al. Long-Term In Vitro Expansion of Salivary Gland Stem Cells Driven by Wnt Signals. Stem Cell Reports. 6, 150-162 (2016).
- Varghese, J. J., et al. Salivary gland cell aggregates are derived from self-organization of acinar lineage cells. Archives of Oral Biology. 97, 122-130 (2019).
- Maruyama, C., Monroe, M., Hunt, J., Buchmann, L., Baker, O. Comparing human and mouse salivary glands: A practice guide for salivary researchers. Oral Diseases. , (2018).
- Lin, L. C., et al. Cross-contamination of the human salivary gland HSG cell line with HeLa cells: A STR analysis study. Oral Diseases. 24, 1477-1483 (2018).
- Tran, S. D., et al. Primary Culture of Polarized Human Salivary Epithelial Cells for Use in Developing an Artificial Salivary Gland. Tissue Engineering. 11, 172-181 (2005).
- Pringle, S., et al. Isolation of Mouse Salivary Gland Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. , (2011).
- Nam, H., et al. Characterization of Primary Epithelial Cells Derived from Human Salivary Gland Contributing to in vivo Formation of Acini-like Structures. Molecules and Cells. 41, 515-522 (2018).
- Vissink, A., Jansma, J., Spijkervet, F. K. L., Burlage, F. R., Coppes, R. P. Oral Sequelae of Head and Neck Radiotherapy. Critical Reviews in Oral Biology & Medicine. 14, 199-212 (2003).
- Cannon, M. J., et al. Repeated measures study of weekly and daily cytomegalovirus shedding patterns in saliva and urine of healthy cytomegalovirus-seropositive children. BMC Infect. Dis. 14, (2014).
- Pringle, S., et al. Human Salivary Gland Stem Cells Functionally Restore Radiation Damaged Salivary Glands: Hyposalivation Cell Therapy. STEM CELLS. 34, 640-652 (2016).
- Maria, O. M., Maria, O., Liu, Y., Komarova, S. V., Tran, S. D. Matrigel improves functional properties of human submandibular salivary gland cell line. International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 43, 622-631 (2011).
- Srinivasan, P. P., et al. Primary Salivary Human Stem/Progenitor Cells Undergo Microenvironment-Driven Acinar-Like Differentiation in Hyaluronate Hydrogel Culture: Differentiation of Salivary Stem/Progenitor Cells. STEM CELLS Translational Medicine. 6, 110-120 (2017).
- Foraida, Z. I., et al. Elastin-PLGA hybrid electrospun nanofiber scaffolds for salivary epithelial cell self-organization and polarization. Acta Biomaterialia. 62, 116-127 (2017).
