Summary
循环肿瘤细胞(CTC)的表征是转化研究的一个热门话题。该协议描述了一种半自动免疫荧光(IF)测定,用于PD-L1表征和非小细胞肺癌(NSCLC)患者样本中CTC的枚举。
Abstract
从原发性肿瘤衍生的循环肿瘤细胞(CTC)被流入血液或淋巴系统。这些稀有细胞(每mL血液1~10个细胞)预后不佳,与几种癌症(如乳腺癌、前列腺癌和结肠直肠)的整体存活率较短有关。目前,抗EpCAM涂层磁珠的CTC捕获系统是美国食品和药物管理局(FDA)批准的用于在血液中列举CTC的黄金标准测试。此测试基于使用涂有抗 EpCAM 标记的磁珠,该标记专门针对上皮癌细胞。许多研究表明,EpCAM不是四氯化委员会检测的最佳标记。事实上,CTCs是癌细胞的异质亚群,能够经历与转移性增殖和入侵相关的上皮到中位转移(EMT)。这些CC能够减少细胞表面上皮标记EpCAM的表达,同时增加等分体标记,如维门他命。为了解决这一技术障碍,开发了基于CTC物理特性的其他隔离方法。微流体技术使全血样本的CTC富集方法无标签。螺旋微流体技术使用惯性和Dean阻力力,在螺旋微流体芯片内产生的曲线通道中连续流动。根据正常血细胞和肿瘤细胞的大小和可塑性的差异,分离细胞。该协议详细介绍了将螺旋微流体装置与可自定义的免疫荧光 (IF) 标记集相结合,以表征 CC 的编程死亡配体 1 (PD-L1) 表达的不同步骤。
Introduction
肿瘤抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)在癌症反应中扮演着关键角色,这个过程被称为癌症"免疫监测"。免疫检查点封锁抗体(如CTLA-4抑制剂和PD-1/PD-L1抑制剂)增强了其抗肿瘤功能。在非小细胞肺癌(NSCLC)中,抗PD-1/PD-L1疗法在PD-L1阴性肿瘤患者中导致反应率在0%-17%到36%-100%。在黑色素瘤和NSCLC中观察到的对PD-1/PD-L1封锁的有力反应通过总体反应率(RR)、持久临床益处和无进展生存(PFS)的证据显示。目前,抗PD1治疗是二线NSCLC治疗的护理标准,无论PD-L1表达如何,对表达PD-L1±1的患者中,使用二线NSCLC治疗均与尼沃鲁马布和pmbrolizumab为标准。在一线治疗中,在NSCLC表达PD-L1+50%的患者中,护理标准是pmbrolizumab,并且可以通过化疗(根据组织学亚型的platin和双药)1、2来增强。
然而,这种治疗患者的方法是有争议的3,因为PD-L1在肿瘤细胞中通过免疫组织化学(IHC)表达可能不是最理想的伴生生物标志物。其他如肿瘤突变负担4(TMB),微卫星不稳定性(MSI)和/或微生物群可能在这个环境中有趣,单独或组合。NSCLC 已知是异构肿瘤,无论是在空间上(从肿瘤部位到另一个)还是从时间上(从诊断到复发)。NSCLC患者通常很脆弱,反复侵入性组织活检可能是一个问题。事实上,第一次进展的复检率从46%-84%不等,取决于系列,而成功的复检(指组织学和全分子分析)范围为33%-75%。这意味着25%-67%的患者在第一次进展5、6、7、8期间不能接受全面的再活检分析。
因此,"液体活检"的出现在这个特定环境中引起了相当大的热情,因为它通过检查从循环中衍生的循环自由DNA(cfDNA),能够对疾病进展期间的分子变化进行关键的重新评估肿瘤细胞(CTCs)。这些活细胞从肿瘤释放到血液中,在那里自由循环。虽然不经常使用,但CTC的分析在肺癌的分子和表型表征、预后和预测意义(通过DNAAq、RNAeq、miRNA和蛋白质分析)方面似乎很有希望。事实上,CTC可能含有活性疾病的型板特征,而不是最初的标记物(在诊断时在组织活检上检测到)。此外,CTCs绕过了肿瘤组织的空间异质性问题,这可能是小活检中的一个关键问题。因此,在CTC上的PD-L1表达可能会揭示其作为肿瘤组织的预测性生物标志物所产生的差异。
最近,PD-L1表达在NSCLC的TC中进行了测试。几乎所有测试的患者9是PD-L1阳性,使结果的解释及其临床使用复杂化。总体而言,在平均4.5个细胞/mL10的样本中,69.4%的样本中检测到PD-L1阳性的CTC。放射治疗开始后,PD-L1阳性CTC的比例显著增加,表明PD-L1表达对辐射11的反应上升。因此,PD-L1 CTCs 分析可用于监测肿瘤的动态变化和免疫反应,这可能反映对化疗、放疗和可能的免疫治疗 (IT) 治疗的反应。
迄今为止,CTC隔离和PD-L1表征依赖于各种方法,如抗EpCAM涂层磁珠的CTC捕获、富集基测定和基于尺寸的12、13CTC捕获测定。然而,在45%-65%的转移NSCLC患者中只检测到了CTCs,从而限制了他们为超过一半的转移性NSCLC患者提供任何信息的能力。此外,在大多数使用基于尺寸的方法10的研究中,CTC计数较低。此外,这种方法还导致在健康献血者血液中检测CD45(-)/DAPI(+)细胞具有"恶性细胞形态"的差异。这些关切突出表明,需要使用NSCLC中额外的癌症生物标志物(即TTF1、维门丁、EpCAM和CD44)从健康全血中分离非典型CD45(-)细胞进行免疫-phenotment收集,从而获得高度敏感的CTC收集方法。
因此,我们评估了一种螺旋微流体装置,该装置使用惯性和Dean阻力,通过微流体芯片根据大小和可塑性分离细胞。微流体芯片中存在的Dean涡流的形成导致沿内壁的较大CT和沿着芯片外壁的较小免疫细胞。浓缩过程通过将较大的细胞作为浓缩的CTC部分吸入收集出口完成。这种方法特别敏感和具体(检测全血约1CTC/mL)14,可与定制的免疫荧光(IF)分析相关。这些工具将启用临床解释的正阈值。因此,描述了一个工作流程,使生物学家能够分离和免疫类三氯苯甲酸碳酸盐具有高回收率和特异性。该协议描述了螺旋微流体器件收集CTC的最佳用途,根据癌症类型可定制的优化IF检测,以及使用免费的开源软件测量和分析细胞图像,以执行半自动根据荧光染色对细胞进行计数。此外,显微镜复用可以根据可用的荧光过滤器/标记的数量进行。
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Protocol
在患者书面同意后,在里昂大学医院的CIRCAN("CIRCsatCANcer")队列框架内,对样本进行了前瞻性采集。这项研究被纳入了CIRCAN_ALL队列。该研究 CIRCAN_ALL 在参考 L15-188 下被 CPP 东南 IV 于 2015 年 4 月 4 日确认为不干预。2016年9月20日,根据参考L16-160,修订版被确认为不干预。CIRCAN_ALL 研究于 2015 年 1 月 12 日根据参考文献 15-131 向里昂市公民协会 IT 和自由通讯员宣布。当医生观察到肿瘤进展的最早迹象时,进行血液采集。
注:使用材料表中概述的所有试剂和材料以及相应的存储条件进行预分析样品制备和免疫荧光测定。替代试剂和/或修改储存条件可能导致不理想的测定性能。
1. 螺旋微流体装置的去污
注:螺旋微流体装置的去污是去除细菌污染产生的所有免疫荧光背景,探索CC的细胞形态,并能够将其与正常免疫细胞区分的要求。该协议针对在血液取样后6小时内在K2 EDTA管中采集的血液样本进行了优化,并在清洁条件下使用螺旋微流体装置进行浓缩。将此测定用于其他类型的样品(其他生物流体)可能需要额外的优化。此净化协议应每周执行一次。
- 试剂制备
- 稀释剂缓冲液的制备
- 使用0.22 μm注射器过滤器对20 mL稀释添加剂试剂进行消毒,并直接加入1 L的1x磷酸缓冲盐(PBS)超纯级(材料表)。
- 试剂和输入吸管的灭菌
- 消毒 RBC 赖沙缓冲液和再悬浮缓冲器(RSB;材料表)使用0.22 μm注射器过滤器,并储存在新的50mL聚丙烯锥形管中。
- 在多功能清洁试剂(材料表)中,在室温(RT)下孵育1小时,对输入吸管进行消毒。将吸管转移到漂白剂(材料表),在RT下孵育1小时。
- 用无菌PBS冲洗输入吸管两次,每次1小时,并将消毒的输入吸管存放在手术无菌袋(材料表)中。
- 稀释剂缓冲液的制备
- 去除螺旋微流体装置
- 使用通用清洁试剂进行消毒
- 通过拧下棕色螺钉,将稀释瓶盖从螺旋微流体装置的稀释口断开。在微生物安全柜下,将高达250 mL的多用途清洁试剂(材料表)转移到一个新的空瓶中。
- 将稀释瓶盖和吸管拧到微生物安全柜下的 250 mL 多用途清洁试剂瓶中。将该瓶子拧回棕色螺钉,将此瓶子连接到螺旋微流体装置的稀释口。
- 输送高达100 mL的漂白剂(1%最终浓度;材料表)到运行工具包中提供的废物容器 (图 1A)。
- 将新的无菌输入吸管加载到输入端口的螺旋微流体装置(材料表)。在输入端口中加载新的 50 mL 离心管。在输出端口中装载新的 50 mL 离心管。
- 单击螺旋微流体装置(3 分钟)上的Prime,继续为螺旋微流体装置注油。在质数完成后,拆下输入管。
- 将高达 15 mL 的多用途清洁试剂转移到新的 50 mL 离心管中,该管在微生物安全柜下带有血清学移液器,并将该管连接到螺旋微流体装置的输入端口。
- 在开始运行之前,请检查解决方案是否没有过多的气泡。如果存在气泡,则用移液器缓慢吸气将其移除。
- 在螺旋微流体装置中加载去污微流体芯片。通过单击"运行"并选择程序3(31 分钟)在螺旋微流体设备上运行程序 3。
注:螺旋微流体装置的程序3可在31分钟内快速浓缩CTC。 - 使用输入管中多用途清洁试剂的剩余体积继续螺旋微流体装置的清洁步骤。
- 清洁步骤完成后丢弃输入管,留下输入吸管。
- 使用漂白剂消毒
- 通过拧下棕色螺钉,将通用清洁试剂瓶盖从螺旋微流体装置的稀释口断开。在微生物安全柜下,将高达 250 mL 的漂白剂(材料表)转移到新的空瓶中(图 1A)。
- 将多用途清洁试剂瓶盖和吸管拧到装有基于漂白剂的瓶子,在微生物安全柜下。将该瓶子拧回棕色螺钉,将此瓶子连接到螺旋微流体装置的稀释口。
- 使用微生物安全柜下的血清学移液器将高达 15 mL 的漂白剂转移到新的 50 mL 离心管输入管中。加载 50 mL 离心管输入位置。在输出位置加载空管。
- 在处理运行之前,检查样品是否没有过多的气泡,如果存在任何气泡,则使用移液器缓慢吸气,以清除气泡。
- 通过单击"运行"并选择程序 3(31 分钟)来运行程序 3。运行后,使用输入管中剩余的漂白剂清洁剂,直接进入清洁步骤。
- 丢弃输入和输出管。
- 冲洗螺旋微流体装置。
- 拧下棕色螺钉,将漂白剂瓶盖从螺旋微流体装置的稀释口断开。在微生物安全柜下,将吸管从装有漂白剂的瓶子转移到含有稀释剂缓冲液的新瓶中。将瓶子拧到螺旋微流体装置上。
- 使用微生物安全柜下的血清学移液器将高达 15 mL 的灭菌水(材料表)转移到新的 50 mL 离心管输入管中。加载 50 mL 离心管输入位置。在输出位置加载空管。
- 在处理运行之前,检查样品是否没有过多的气泡,如果存在任何气泡,则使用移液器缓慢吸气,以清除气泡。
- 通过单击"运行"并选择程序 3(31 分钟)来运行程序 3。运行后,使用输入管中剩余的消毒水体积直接进入清洁步骤。
- 丢弃输入和输出管。
- 使用通用清洁试剂进行消毒
2. 维护保持螺旋微流体设备无细菌
注:在上次清洁步骤中,应在一天结束时进行日常维护。
- 使用微生物安全柜下的血清学移液器将高达 7 mL 的漂白剂转移到新的 50 mL 离心管中。在螺旋微流体装置的输入端口中拧下基于漂白剂的清洗管。
- 在处理清洁运行之前,检查输入样本是否没有过多的气泡,如果存在气泡,则使用移液器缓慢吸气,以清除气泡。
- 在螺旋微流体装置上运行清洁。
3. 从患者血液样本中预分析浓缩四氯化细胞
- 在K2 EDTA管中收集7.5 mL的血液,保持温和的搅拌,以避免细胞沉淀和凝固。在 6 小时内处理。
注:如果血液被收集在含有防腐剂的无细胞DNA血液收集管中,储存在4°C,直到处理。在继续浓缩步骤之前,请确保血液样本、RBC 莱沙缓冲液和 RBS 缓冲液位于 RT。 - 使用微生物安全柜下的血清学移液器将高达 7.5 mL 的全血转移到新的 50 mL 离心管输入管中。
- 在RT处以1,600 x g离心10分钟。用移液器收集等离子体分数,而不会干扰布漆。将直接等效的 PBS 体积添加到 7.5 mL,从而替换等离子体馏分。
- 轻轻地将RBC莱沙缓冲液(材料表)添加到血液样本中,最终体积为30 mL(对于K2EDTA管)或37.5 mL(对于无细胞DNA血液采集管)。轻轻反转采血管10倍,在RT孵育10分钟。
注:在红着红热压膜下,血样变成深红色。如果 10 分钟后未观察到变化(从深红色和不透明开始),请轻轻反转管 3 倍,并留出最多 5 分钟。请勿将样品留在 RBC 莱沙缓冲液中超过 15 分钟,因为它会损害样品质量和检测性能。 - 在 RT 处,在 500 x g下将分离的血液样本离心 10 分钟,并打开离心制动器(或最高减速速度)。使用巴斯德移液器或血清学移液器轻轻去除上清液,直到体积达到 4-5 mL 标记。然后,使用过滤的微移液器尖端去除剩余的上清液。
- 使用带有过滤尖端的 P1000 微移液器,在 50 mL 离心管输入管壁上添加 1.0 mL RSB。为了避免在混合物中引入气泡,请通过轻轻上下移液来重新悬浮细胞颗粒,直到样品均匀。
- 在 50 mL 离心管输入管(总容积 4 mL)壁上再添加 3 mL RSB。避免在混合物中引入气泡。通过上下轻轻移液,轻轻混合细胞悬架。
注:万一常规移液无法分解细胞团块(通过可见或阻塞移液器尖端定义),通过40μm细胞滤网过滤样品以去除任何团块。在样品中添加 150 μL 的 RSB,以弥补滤波产生的体积损失。请注意,此方法应谨慎使用,并且仅在观察到大块时才使用。 - 在继续浓缩步骤之前,请检查样品是否没有过多的气泡,如果存在任何气泡,请取出气泡并注意不要丢弃任何样品。如果存在微小的气泡,则不需要去除气泡。
- 在螺旋微流体装置上处理样品。
4. 用螺旋微流体装置从患者全血中浓缩CTC
- 加载新的螺旋微流体芯片。在输入和输出端口中加载两个空 50 mL 离心管。
- 单击螺旋微流体装置上的素数(3 分钟),运行质数。拆下输入和输出管并装载要在输入端口中处理的样品。
- 在输出端口中加载一个清晰的15 mL锥形管以收集丰富的CTC。通过单击运行并选择程序3(31分钟)运行程序3。
- 以 500 x g卸载输出管和离心机 10 分钟(加速度:9;减速:5)。使用 5 mL 血清学移液器,在锥形 15 mL 管上 2 mL 标记处去除停止的上清液。使用微移液器,在锥形 15 mL 管上去除以 100 μL 标记停止的上清液。直接处理浓缩样品,用于免疫荧光染色。
5. 免疫荧光染色
- 在具有血细胞计类型网格的腔室幻灯片上枚举每 mL 的细胞数。用0.2%的抗结合溶液(材料表)稀释浓缩样品,浓度达到每细胞针100,000个细胞/100μL。
- 用50μL的0.2%抗粘结溶液润湿样品室的轮廓(材料表)。在样品室中放置多酶玻璃滑块并关闭。
- 通过上下移液 3 倍,用 0.2% 的防粘结溶液涂抹尖端。重新悬浮富集样品,并将细胞溶液转移到样品室中。带专用离心机(材料表)在 400 rpm 下离心 4 分钟(加速低)。
- 在沉积区域周围放置硅隔离器。让玻璃滑块在微生物安全柜下干燥 2 分钟。
- 用3mL无菌PBS稀释1mL的16%甲醛(PFA)制备固定溶液。每个样品加入100μL的固定溶液(4%PFA),在RT孵育10分钟。 去除固定溶液,用200μL的PBS进行三次处理,并在RT下孵育2分钟。
警告:在化学品安全柜下使用 PFA 以防止吸入。 - 通过在5%处稀释胎儿牛血清(FBS),在5%处阻断试剂,在无菌PBS(材料表)中稀释牛血清白蛋白(BSA),制备饱和液。每个样品加入100μL饱和溶液,在RT下孵育30分钟。去除饱和溶液。
- 每个样品添加100μL抗体溶液(CD45抗体1/20;泛克抗体1/500;PD-L1抗体1/200;Qsp饱和度溶液100μL) (材料表)将多色酶玻璃滑片放入 100 mm x 15 mm 培养皿中。用2 mL的无菌水润湿吸水纸,用盖子合上培养皿。在4°C过夜,并远离光线。
- 去除抗体混合物,用200μL的PBS进行3次洗涤,每次洗涤2分钟。让样品干燥 5 分钟,并保护它免受光线照射。将10μL的安装溶液(材料表)放在沉积区域,用显微镜盖玻片盖住,而不会制造气泡。用指甲油密封盖玻片。
6. 使用直荧光显微镜和相关软件采集免疫荧光图像
- 使用带 X/Y 电动平台的直荧光显微镜。使用 20x 目标在四个通道中拍摄 8 位 RGB tiff 图像,这些通道对应于 DNA 染料 (4',6-二甲苯-2-ph_nylindole [DAPI])、PanCK 染料(氟素等子素 [FITC])、PD-L1 染料 (CY3) 和 CD45 染料 (CY5)。使用前 15 分钟打开汞灯,并将显微镜和相关软件调整到半自动拍摄。
- 将玻璃滑块放在平台上。
- 在采集菜单中,定义四个通道并设置曝光时间(DAPI:15 ms,FITC [PanCK]:500 ms;CY3 [PD-L1]:800毫秒;CY5 [CD45]:1,000 毫秒)。定义要扫描的切片。单击磁贴。在高级实验中,定义要扫描的区域。
- 调整屏幕上的焦点。单击"开始实验"。
- 导出每个通道的 TIF 文件,并具体命名图像文件,其中显示此信息:示例_数字的"区域"_d_NumberOfsif.tif(例如,Sample1_TR1_c1m01)。名称染料如下:DAPI 通道为 c1,FITC 通道为 c2,CY3 通道为 c3,CY5 通道为 c4。
7. 使用图像分析软件分析免疫荧光图像
- 从博德研究所网站下载并安装免费图像分析软件。在安装过程中接受所有默认值。打开图像分析软件并单击"文件" |来自文件的管道|分析_4通道_CTC.cppipe.
注:管道将 RGB 彩色图像转换为灰度,通过中值滤波器平滑图像来移除伪影,识别核和细胞质,量化每个通道的荧光强度,并将其导出到 Excel 文件中。 - 将文件删除在文件列表中。更新元数据以按磁贴对文件进行分组。
注:在软件中指定了对图像进行分组的所有说明。名称文件出现在名称和类型模块中,文件根据每个样本的磁贴和通道数进行分组。 - 单击"查看输出设置"并指定正确的默认输出。单击"分析图像"。打开与度量强度参数对应的电子表格文件。
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Representative Results
第一个先决条件是获取未受污染的(无传染性代理)的CTC集合,用于组织培养,并避免生成IF背景。净化协议能够清洁所有管道和泵,并收集了具有良好回收率的四氯苯二苯C,没有细菌污染。将富集样品与螺旋微流体装置的去污方案工作流程进行比较。为了验证去污方案,A549细胞系在没有全血的情况下使用,并直接使用螺旋微流体装置进行浓缩。如果没有优化的去污方案,仅24小时后,在富集A549细胞系的组织培养中观察到高细菌污染,导致真核细胞死亡和细胞形态变化(图1B)。
相反,在清洁协议之后,在组织培养和培养基去除10小时后,在3D条件下(图1B)以及患者样本(图1C)中,通过2D培养中生长获得活A549细胞。潜在的CTC用红十字识别(图1C)。
图2概括了全血富集的CPC免疫荧光型荧光的完整工作流程。它由四个主要步骤组成:全血取样、CTC浓缩、免疫荧光(IF)测定和使用软件的图像分析。此前,螺旋微流体装置的回收率已解决14.使用荧光模拟CTC(mCTC),这种回收率在1.3CTC/mL全血14。
目前的工作重点是为丰富CT和下游可视化的IF分析建立最佳条件(图2)。首先,为了测试PD-L1抗体的特异性,使用了两个细胞系:(1)PC3高正PD-L1细胞系和(2)SW620低正-PD-L1细胞系。然后,通过螺旋微流体装置丰富细胞,并通过IF进行分析。所有细胞都沾染了肿瘤抗潘CK标记、白细胞抗CD45标记、抗PD-L1(可用于肺癌)和DAPI(核染料)。白血球对DAPI和CD45被鉴定为阳性,而癌细胞对DAPI和PanCK为阳性,对CD45为阴性。PD-L1 的 PC3 高 PD-L1 阳性细胞系为 PD-L1 正染色,而在 SW620 低 PD-L1 阴性细胞系中检测到较低的 PD-L1 表达。
然后,对下列情况进行了比较:(i)液体IF染色测定,(ii)直接沉积在多酶涂层幻灯片上的CTC染色,以及(iii)聚酶涂层幻灯片上细胞平后CTC的IF染色。可以清楚地注意到,CTC的回收率取决于所使用的协议类型(图3A)。在液体IF染色测定中,峰值mCTC的回收率仅为10%,最低。这种低恢复率给大多数转移性 NSCLC 患者带来了问题,因为它极大地限制了这些测试分离少数 CTC 并提供型板信息的能力。描述的第二和第三节(将mCTC或CTC直接沉积到无细胞氨酸的多酶涂层幻灯片上)系统地使回收率超过60%(图3A)。
图 3B使用同一患者的全血样本显示这些 IF 测定的代表性图像,或者使用液体 IF 染色测定或使用细胞平多酶涂层幻灯片上的 IF 染色测定。两个测定结果之间的核枚举明显不同(图3B)。核DAPI染色提供了样品中总细胞的枚举,生物标志物染色使泛CK阳性细胞、PD-L1阳性细胞中的橙色和CD45残留白细胞中的红色突出(图3B)
其次,要从细胞学上从肿瘤细胞中分化白细胞,细胞核的形状必须可视化,因为它是细胞类型的特征。图 3C演示了在缺乏细胞针步时异常的模糊和形态的原子核的轮廓。因此,优化的协议包括在多酶涂层幻灯片上对浓缩CTC进行细胞旋转,然后进行4%的甲醛(PFA)固定,用于在IF染色前保存滑片。这种优化的协议具有与mCTC直接沉积到多酶涂层幻灯片(图3A)类似的恢复率,即使添加的细胞很少。由于这一附加步骤使核形态的保存(图3C),粒细胞被识别其多球核,以及肿瘤细胞(标记与红十字在核)与他们的核异常,恶性模式,和更大的大小相比,白血球。
在优化IF协议后,使用转移性患者全血进行概念验证。样本在里昂大学医院CIRCAN常规队列的框架内进行前瞻性采集。血液收集通常在医生观察到肿瘤进展的早期迹象时进行。在初始诊断期间,所有肿瘤病例在FFPE活检标本上均通过组织学或细胞学确认。在这里,在进展中的三氯图C分析是由那些没有获得或事先了解临床数据的调查员进行的。详细的分析前注意事项已于15日发表。
在图4、表1和表2中,从病人样本中给出了不同的发现。CD45(+)、PanCK(-)、PD-L1(-)配置文件代表免疫细胞。白血球的残留计数具有很强的可变性,并且依赖于整个血液样本。这个小试验组的范围是648-11,000个白色CD45(+)细胞(图5A)。因此,在CTC浓缩之后,立即对收集的细胞进行枚举,以调整细胞针区域的细胞密度,密度为100,000个细胞/细胞针(见第6节)。这使得每个患者能够执行多个细胞圈,并优化了用于手动枚举和使用图像分析软件管道的微观观察。
在图4A-C、表1和表2中,报告了残留白细胞计数存在显著差异的典型病例:
(i) 第一个配置文件是图4A所示的 CD45(-)、PanCK(+)和 PD-L1(*)。通常,细胞的大小优于13μm的直径和细胞核形态不规则,代表恶性的细胞形态模式。这一人口很可能由反恐委员会组成。
(ii) 第二个配置文件是 CD45(-)、PanCK(-)和 PD-L1(+)。如已经报告,并非所有的CTCs都表示PanCK生物标志物(图4A)。
(三) 第三个配置文件是 CD45(-)、PanCK(+)和 PD-L1(-)。如已经报告的那样,并非所有的CTCs都表示PD-L1生物标志物。
(iv) 第四个配置文件是图4B中所示的 CD45(+)、PanCK(+)和 PD-L1(*)。它代表患者全血中非典型活化免疫细胞。这种种群在16、17、18的几份出版物中都有所描述,约占富集后细胞总数的5%。如果CD45信号的强度过低,并且细胞核的形态没有得到很好的保存,这种种群的存在可能会增加样本中误报的CTC速率。这强烈地强调了进行补充性肿瘤生物标志物染色的必要性,例如此免疫荧光测定中的维明丁和/或Epcam。
(v) 最后,最后一个配置文件包括未标记的单元格 CD45(-)、PanCK(-) 和 PD-L1(-),如图4C所示。这个种群的细胞核通常显示恶性的细胞形态模式,其直径超过13μm。根据患者全血,这些细胞在样本中的百分比是高度可变的。这突出表明需要使用互补的肿瘤生物标志物来确认该细胞亚群的肿瘤模式。
在表1和表2中,报告了来自晚期转移性NSCLC患者的16个样本的细胞计数。这些细胞根据生物标志物的表达进行分类。在获得的亚种群中观察到高变异性。正如在独立研究中已经报告的那样,在大多数样本中发现了CD45(-)、PanCK(+)和PD-L1(+)配置文件。然而,由于CTC总体高度异质,患者样本也含有CD45(-)、PanCK(-)和PD-L1(+)子群体、CD45(-)、PanCK(+)和PD-L1(-)亚群和未标记细胞CD45(-)、PanCK(-)和PD-L1(-)亚人口。在分析的样本中,残留白细胞的水平变化很大。
为了便于细胞枚举,利用图像分析软件建立了一个试验管道,用于自动分析免疫荧光图像。工作流如图5所示。在这种情况下,从对比度和荧光强度的角度获取高质量的免疫荧光图像非常重要。根据硬件的聚类计算能力,图像分析管道可应用于细胞针的完整合并图像或细胞针的代表性区域。
在这里,基于显微镜,半自动扫描细胞针(X/Y;不包括Z焦点)区域生成150-200个合并图像。这些图像可以合并在一起,并使用图像分析管道直接进行分析。然而,这个过程是时间和计算集群资源消耗,这是实验室日常使用的重要限制。因此,根据在细胞血液学领域的经验,在显微镜下验证细胞在细胞自旋整个区域的分布是同质的后,决定分析每个样品的代表性区域。然后,用荧光显微镜扫描细胞针总面积的25%(约40块瓷砖),生成40 x 4独立图像。合并的文件被通道拆分,图像文件使用显微镜软件自动生成(参见第 7 节;图 5A),这些文件被导入图像分析管道,以便根据所述参数进行分析(见第8节;图 5A)
在图 5B中,我们手动标识了一个代表性图像,该图像显示 77 个免疫细胞 [CD45(+)、PanCK(--)和 PD-L1(-)]中的四个 CTC [CD45(-)、和 PD-L1(-)]。图 5B说明了图像分析软件如何根据 DAPI 染色识别并枚举细胞数。它还说明了图像分析软件如何计算辅助对象。最后,报告图像中报告的所有物体的荧光通道的荧光强度。
背景由样本中存在的负单元格计算和表示。例如,非活化免疫细胞具有低荧光强度,能够测量PanCK和PD-L1染色的背景。如果荧光强度超过背景的荧光强度两倍(基于对四个独立患者样本的分析),荧光信号被视为阳性。关于CD45染色,由于CD45的表达水平在白细胞亚群中是高度可变的,因此正感阈值被设定为尽可能低。它基于对10个健康全血与CD45抗体染色的图像的分析。试验分析 (n = 4) 显示了手动枚举和图像分析软件枚举之间的一致性(表 2)。细胞针上的每个细胞都由图像分析软件进行识别,使生物学家能够跟踪细胞并在需要时手动确认结果。
图 1: 净化工作流程概述螺旋微流体装置仪器。(A) 净化过程包括的三个主要步骤(见协议),说明仪器输入和输出的本地化。(B) 仪器净化前后A549细胞系富集的代表性图像。显示了感染剂的存在对收集细胞的生存能力和形态的影响。在细菌的存在,细胞形态和生存能力被修改。刻度条 = 20 μm . (C) 肺、前列腺癌和乳腺癌的丰富患者样本的三维细胞培养。红十字对应于非典型细胞。比例尺 = 20 μm。请点击此处查看此图的较大版本。
图 2:从全血采样到荧光图像分析的免疫荧光分析工作流程概述。主要步骤如下:全血采血、螺旋微流体装置的CTC采集、免疫荧光测定和图像分析软件。生物标志物的选择是由更好地识别细胞针幻灯片上可观察到的各种细胞群(CD45用于免疫细胞,PanCK和PD-L1用于肺癌细胞)所推动的。请点击此处查看此图的较大版本。
图 3:三种独立染色协议的回收率。(A) 多酶涂层幻灯片上细胞皮平后的mCTC回收率比较,从液体染色、沉积在多酶涂层幻灯片上的细胞直接染色和细胞染色的比较。(B) 通过液体IF协议处理的患者样本和与细胞针刺直接免疫染色协议处理的患者样本的代表性图像。细胞被CD45单克隆抗体(克隆HI30)AlexaFluor 647染色;PanCK单克隆抗体(克隆AE1/AE3)亚历克萨氟488;4',6-二米迪米诺-2-ph_nylindole (DAPI)。刻度条 = 20 μm. (C) 带细胞浓缩的 DAPI 染色的代表性图像,带和无细胞针步。使用DAPI染色显示原子核的形态和大小。红十字突出显示右侧图像中细胞核异常的细胞。在左侧图像中,图像是模糊的,因为单元格不在同一级别(x-、y-和 z 轴)。比例尺 = 10 μm。请点击此处查看此图的较大版本。
图 4:识别细胞配置文件。(A) 具有不同CTC特征的患者的代表性图像.荧光通道单独显示。合并的图像显示在左侧。它们沾有CD45单克隆抗体(克隆HI30)Alexa氟647;PanCK单克隆抗体(克隆AE1/AE3)亚历克萨氟488;PDL-1单克隆抗体(克隆29E2A3)肾上腺素;4',6-二米迪米诺-2-ph_nylindole(DAPI);箭头指向非典型单元格。(B) 两个患者样本具有非典型白细胞特征的免疫染色的代表性图像。细胞被CD45单克隆抗体(克隆HI30)AlexaFluor 647染色;PanCK单克隆抗体(克隆AE1/AE3)亚历克萨氟488;PDL-1单克隆抗体(克隆29E2A3)肾上腺素;4',6-二米迪米诺-2-ph_nylindole (DAPI)。该图突出显示了沾有 CD45(+)、PanCK(+)和 PD-L1(+)的免疫细胞的存在。(C) 图像突出显示未标记的单元格 (CD45(-)、PanCK(-) 和 PD-L1(-)。比例尺 = 10 μm。请点击此处查看此图的较大版本。
图 5:荧光图像分析概述。(A) 主要步骤描述:显微镜扫描,根据荧光分路,并将文件导入图像分析软件。(B) 图像分析软件工作流程的三个不同步骤的描述。请点击此处查看此图的较大版本。
表1:人工列举患者细胞富集。基于DAPI染色的细胞的枚举。基于 FITC、PE 和 CY5 染色的其他对象进行枚举。
表 2:图像分析软件患者细胞富集的枚举.基于DAPI染色的细胞的枚举。基于 FITC、PE 和 CY5 染色的其他对象进行枚举。手动计数和图像分析软件枚举的比较。
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Discussion
本研究提出了两个主要观点,第一点涉及将其转移到临床应用的工作流程的性能,第二点关于分析所获得的荧光图像的主观性降低。
在细胞富集后,通过CTC无标签微流体系统(螺旋微流体装置),使用可定制的IF测定,初步确定了CTC枚举的可执行和优化的工作流程。利用这一工作流程,一项试验性研究证实,来自转移性NSCLC患者的所有样本都含有非典型细胞,这些细胞都是CD45(-)。它们也可以标有 PanCK 和/或 PD-L1 生物标志物;但是,它们也可能对所有测试的生物标志物完全阴性 [CD45(-)、PanCK(-) 和 PD-L1(-)],如 S19 样本(表2)所示。]这突出表明,需要额外的生物标志物来对CTC亚种群进行标注。因此,建议添加上皮-中生代生物标志物,如EpCAM、维门丁和N-卡德林;癌症干细胞的标记物,包括CD44和CD133;和特定的肿瘤标记物,包括用于肺腺癌的TTF1。
在试验研究中,非典型细胞的范围为[40;>400],全血为3.5 mL。对于80%的患者样本,非典型细胞计数超过50。事实上,在细胞学19,20,21样品从内肠子超声波指南跨支气管针吸入或CT引导跨胸穿刺,PD-L1分析是适合在大多数样品,但阈值为+100肿瘤细胞通常被承认产生统计和临床解释的价值。然而,在血液CTCs的具体情况中,应该注意的是,空间肿瘤异质性问题与小型现场肿瘤样本相反。
第二点是避免处理程序对免疫荧光图像分析的影响。建立了荧光图像图像分析软件,以标准化细胞枚举,为这些样本提供统计数据。这一自动化过程突出表明,需要强大的计算簇来分析同一样本中包含的所有细胞。此外,IF 染色的质量必须在同一平面上(以避免使用共聚焦系统),并且必须校准细胞针上的细胞密度,以使图像分析软件能够分别识别幻灯片上的所有细胞。最后,结果没有验证一组患者的临床结果,但这一点应该在另一项专门研究中加以处理。
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Disclosures
让-菲利普·奥雷尔和凯瑟琳·魏奇·李是生物科技公司的员工,该公司生产本文中使用的仪器。其他作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了阿斯利康(英国伦敦)、生物研究所(新加坡)和癌症联盟(法国萨奥内和卢瓦尔)的研究资助。作者感谢阿斯利康和生物科技公司的财政支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) | Ozyme | BLE 422801 | Storage conditions: +4 °C |
| BD Facs Clean – 5 L | BD Biosciences | 340345 | Bleach-based cleaning agent. Storage conditions: Room temperature |
| Bleach 1% Cleaning Solution 100 mL | Biolidics | CBB-F016012 | Bleach. Storage conditions: Room temperature |
| Bovine Serum Albumin (BSA) 7.5% | Sigma | A8412 | Storage conditions: +4 °C |
| CD45 monoclonal antibody (clone HI30) Alexa Fluor 647 | BioLegend | BLE304020 | Storage conditions: +4 °C |
| CellProfiler Software | Broad Institute | Image Analysis Software | |
| Centrifuge device | Hettich | 4706 | Storage conditions: Room temperature |
| Centrifuge tube 50 mL | Corning | 430-829 | Storage conditions: Room temperature |
| Centrifuge Tube 15 mL | Biolidics | CBB-F001004-25 | Storage conditions: Room temperature |
| ClearCell FX-1 System | Biolidics | CBB-F011002 | Spiral microfluidic device. Storage conditions: Room temperature |
| Coulter Clenz Cleaning Agent – 5 L | Beckman Coulter | 8448222 | All-purpose cleaning reagent. Storage conditions: Room temperature |
| CTChip FR1S | Biolidics | CBB-FR001002 | Microfluidic chip. Storage conditions: Room temperature |
| Cytospin 4 | ThermoFisher | A78300003 | Storage conditions: Room temperature |
| Diluent Additive Reagent – 20 mL | Biolidics | CBB-F016009 | Storage conditions: +4 °C |
| EZ Cytofunnels | ThermoFisher | A78710003 | Sample chamber with cotton. Storage conditions: Room temperature |
| FcR blocking Agent | Miltenyi Biotec | 130-059-901 | Storage conditions: +4 °C |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Gibco | 10270-106 | Storage conditions: +4 °C |
| Fluoromount | Sigma | F4680 | Mounting solution. Storage conditions: Room temperature |
| Fungizone - 50 mg | Bristol-Myers-Squibb | 90129TB29 | Anti-fungal reagent. Storage conditions: +4 °C |
| FX1 Input Straw with lock cap | Biolidics | CBB-F013005 | Straw. Storage conditions: Room temperature |
| KovaSlide | Dutscher | 50126 | Chambered slide. Storage conditions: Room temperature |
| PanCK monoclonal antibody (clone AE1/AE3) Alexa Fluor 488 | ThermoFisher | 53-9003-80 | Storage conditions: +4 °C |
| Paraformaldehyde 16% | ThermoFisher | 11490570 | Fixation solution. Storage conditions: +4 °C |
| PD-L1 monoclonal antibody (clone 29E2A3) - Phycoerythrin | BioLegend | BLE329706 | Storage conditions: +4 °C |
| Petri Dish | Dutscher | 632180 | Storage conditions: Room temperature |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Ozyme | BE17-512F | Storage conditions: +4 °C |
| Phosphate Buffered Saline Ultra Pure Grade 1x – 1 L | 1st Base Laboratory | BUF-2040-1X1L | Storage conditions: Room temperature |
| Pluronic F-68 10% | Gibco | 24040-032 | Anti-binding solution. Storage conditions: Room temperature |
| Polylysine slides | ThermoFisher | J2800AMNZ | Storage conditions: Room temperature |
| Polypropylene Conical Tube 50 mL | Falcon | 352098 | Storage conditions: Room temperature |
| RBC Lysis Buffer – 100 mL | G Biosciences | 786-649 | Storage conditions: +4 °C |
| RBC Lysis Buffer – 250 mL | G Biosciences | 786-650 | Storage conditions: +4 °C |
| Resuspension Buffer (RSB) | Biolidics | CBB-F016003 | Storage conditions: +4 °C |
| Shandon Cytopsin4 centrifuge | ThermoFisher | A78300003 | Dedicated centrifuge. Storage conditions: Room temperature |
| Silicon Isolator | Grace bio-Labs | 664270 | Storage conditions: Room temperature |
| Sterile Deionized Water – 100 mL | 1st Base Laboratory | CUS-4100-100ml | Storage conditions: Room temperature |
| Straight Fluorescent microscope Axio Imager D1 | Zeiss | Storage conditions: Room temperature | |
| Surgical Sterile Bag | SPS Laboratoires | 98ULT01240 | Storage conditions: Room temperature |
| Syringe BD Discardit II 20 mL sterile | BD Biosciences | 300296 | Storage conditions: Room temperature |
| Syringe Filter 0.22 µm 33 mm sterile | ClearLine | 51732 | Storage conditions: Room temperature |
| Zen lite 2.3 Lite Software | Zeiss | Microscope associated software |
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