Summary
De karakterisering van circulerende tumorcellen (Ctc's) is een populair onderwerp in translationeel onderzoek. Dit protocol beschrijft een semiautomatische immunofluorescentie (IF)-test voor PD-L1-karakterisering en inventarisatie van Ctc's in niet-kleincellige longkanker (NSCLC)-patiënt monsters.
Abstract
Circulerende tumorcellen (Ctc's) afgeleid van de primaire tumor worden vergoten in de bloedbaan of lymfatisch systeem. Deze zeldzame cellen (1 − 10 cellen per mL bloed) rechtvaardigen een slechte prognose en zijn gecorreleerd met een kortere totale overleving in verschillende kankers (bijv. borst, prostaat en colorectale). Momenteel is het met anti-EpCAM gecoate, op magnetische kraal gebaseerde CTC-opnamesysteem de gouden standaard test die is goedgekeurd door de Amerikaanse Food and Drug Administration (FDA) voor het inventariseren van Ctc's in de bloedbaan. Deze test is gebaseerd op het gebruik van magnetische kralen bekleed met anti-EpCAM markers, die specifiek gericht zijn op epitheliale kankercellen. Veel studies hebben aangetoond dat EpCAM niet de optimale marker is voor CTC-detectie. Inderdaad, Ctc's zijn een heterogene subpopulatie van kankercellen en kunnen een epitheliale-naar-mesenchymale overgang ondergaan (EMT) in verband met gemetastaseerde proliferatie en invasie. Deze Ctc's zijn in staat om de expressie van celoppervlak epitheliale marker EpCAM verminderen, terwijl het verhogen van mesenchymale markers zoals vimentin. Om deze technische hindernis aan te pakken, zijn er andere isolatie methoden ontwikkeld op basis van fysische eigenschappen van Ctc's. Microfluïdische technologieën maken een etiket vrije benadering van CTC-verrijking van volledige bloedmonsters mogelijk. De spiraalvormige microfluïdische technologie maakt gebruik van de inertiële en Dean Sleep krachten met continue stroming in gebogen kanalen gegenereerd binnen een spiraal microfluïdische chip. De cellen worden gescheiden op basis van de verschillen in grootte en plasticiteit tussen normale bloedcellen en tumorale cellen. Dit protocol Details de verschillende stappen om de geprogrammeerde Death-ligand 1 (PD-L1) expressie van CTCs te karakteriseren, waarbij een spiraal microfluïdisch apparaat wordt gecombineerd met aanpasbare immunofluorescentie (IF) marker set.
Introduction
Tumor antigen-specifieke cytotoxische T-lymfocyten (Ctl's) spelen een cruciale rol in de reactie op kanker door middel van een proces dat bekend staat als kanker "immuun surveillance". Hun anti-tumor functies worden versterkt door immuun Checkpoint blokkade antilichamen zoals CTLA-4 remmers en PD-1/PD-L1-remmers. Bij niet-kleincellige longkanker (NSCLC) resulteren anti-PD-1/PD-L1 therapieën in responspercentages variërend van 0%-17% bij patiënten met PD-L1-negatieve tumoren en 36%-100% in degenen die PD-L1 uitdrukken. De robuuste responsen op PD-1/PD-L1-blokkade waargenomen bij melanoom en NSCLC worden aangetoond door het bewijs van een verbeterde algehele responsratio (RR), duurzame klinische voordelen en progressievrije overleving (PFS). Momenteel zijn anti-PD1 behandelingen de standaard van de zorg in de tweede-lijn NSCLC behandeling met nivolumab ongeacht PD-L1 expressie en met pembrolizumab bij patiënten die PD-L1 ≥ 1% uitdrukken. In de eerstelijnsbehandeling is de standaard van de zorg pembrolizumab alleen bij patiënten met nsclc die pd-L1 ≥ 50% uitdrukken en kunnen worden verhoogd met chemotherapie (Platin en Doublet medicijn afhankelijk van het histologische subtype)1,2.
Echter, een dergelijke benadering van het beheer van de patiënt is discable3, aangezien PD-L1 expressie in tumorcellen door immunohistochemie (IHC) is waarschijnlijk niet de meest ideale metgezel biomarker. Anderen zoals tumor mutatie last4 (TMB), microsatellietinstabiliteit (MSI) en/of microbiota zijn mogelijk interessant in deze setting, alleen of in combinatie. NSCLC staat bekend als heterogene tumoren, ofwel ruimtelijk (van een tumor site naar een andere) of tijdelijk (van diagnose tot herhaling). Patiënten met NSCLC zijn meestal kwetsbaar, en iteratieve invasieve weefsel biopsieën kunnen een probleem zijn. Inderdaad, re-biopsie tarief bij eerste progressie varieert van 46%-84% afhankelijk van de reeks, en succesvolle re-biopsie (betekenis met histologische en volledige moleculaire analyse) varieert van 33%-75%. Dit betekent dat 25%-67% van de patiënten geen uitgebreide re-biopsie-analyse kan ontvangen tijdens de eerste progressie5,6,7,8.
De komst van "Liquid biopsies" heeft dus veel enthousiasme gegenereerd in deze specifieke setting, omdat het cruciale herbeoordeling van moleculaire veranderingen tijdens ziekteprogressie mogelijk maakt door het onderzoeken van Circulerend vrij DNA (cfDNA) afgeleid van circulerende tumorcellen (Ctc's). Deze levende cellen worden vrijgelaten uit de tumor in de bloedbaan, waar ze vrij circuleren. Hoewel niet routinematig gebruikt, lijkt de analyse van Ctc's veelbelovend te zijn in het geval van moleculaire en fenotypische karakterisering, prognose en voorspellende betekenis bij longkanker (via Dnaseq, Rnaseq, Mirna en eiwitanalyse). Inderdaad, Ctc's haven waarschijnlijk fenotypische kenmerken van de actieve ziekte in plaats van de initiële markers (gedetecteerd op weefsel biopsieën bij de diagnose). Bovendien, Ctc's omzeilen het probleem van de ruimtelijke heterogeniteit van het tumorweefsel, die een cruciale kwestie in kleine biopsieën kan zijn. Bijgevolg kan PD-L1-expressie op Ctc's mogelijk licht werpen op de verschillen die voortvloeien uit het gebruik ervan als een voorspellende biomarker met behulp van tumorweefsel.
Onlangs is PD-L1 Expression getest in Ctc's van NSCLC. Bijna alle geteste patiënten9 waren PD-L1 positief, compliceren de interpretatie van het resultaat en het klinisch gebruik ervan. In totaal werden PD-L1-positieve Ctc's gedetecteerd in 69,4% van de monsters van gemiddeld 4,5 cellen/mL10. Na aanvang van de radiotherapie nam het aandeel PD-L1-positieve Ctc's significant toe, wat duidt op de upregulatie van PD-L1-expressie in reactie op straling11. Daarom kan PD-L1 CTCs-analyse worden gebruikt om dynamische veranderingen van de tumor en de immuunrespons te monitoren, die de respons op chemotherapie, straling en waarschijnlijke immunotherapie (IT)-behandelingen kunnen weerspiegelen.
Tot op heden zijn de ctcs-isolatie en de PD-L1-karakterisering afhankelijk van verschillende methoden, zoals anti-epcam gecoate, op magnetische kraal gebaseerde CTC-vastlegging, verrijkings vrije analyse en op maat gebaseerde12,13 CTC-opname testen. Ctc's werden echter alleen gedetecteerd bij 45%-65% van de patiënten met gemetastaseerde NSCLC, waardoor hun vermogen om informatie te verstrekken voor meer dan de helft van gemetastaseerde NSCLC-patiënten werd beperkt. Bovendien was de CTC-telling laag in de meeste van deze onderzoeken met behulp van op grootte gebaseerde benadering10. Bovendien, deze methode heeft geleid tot discrepanties zoals de detectie van CD45 (-)/DAPI (+) cellen met "cytomorphological patronen van maligniteit" in de bloedbaan van gezonde donoren. Deze zorgen wijzen op de noodzaak van een zeer gevoelige methode van CTC-verzameling in verband met immuun-fenotyping van atypische CD45 (-) cellen van gezond volbloed met behulp van extra kanker biomarkers (d.w.z. TTF1, Vimentin, EpCAM en CD44) in NSCLC.
Daarom evalueerden we een spiraal microfluïdisch apparaat dat inertiële en Dean Sleep krachten gebruikt om cellen te scheiden op basis van grootte en plasticiteit door middel van een microfluïdische chip. De vorming van Dean Vortex stroomt in de microfluïdische chip resulteert in grotere Ctc's gelegen langs de binnenwand en kleinere immuuncellen langs de buitenste wand van de chip. Het verrijkingsproces wordt voltooid door de grotere cellen in de opvang uitlaat te sibellen als de verrijkte CTC-Fractie. Deze methode is bijzonder gevoelig en specifiek (detectie van ongeveer 1 CTC/mL volbloed)14 en kan worden geassocieerd met aangepaste immunofluorescentie (if) analyses. Deze instrumenten zullen het opzetten van een positieve drempel voor klinische interpretatie mogelijk maken. Zo wordt een workflow beschreven die biologen in staat stelt om ctc's met een hoge mate van terugwinning en specificiteit te isoleren en aspecten. Het protocol beschrijft het optimale gebruik van het spiraal microfluïdische apparaat om Ctc's te verzamelen, de geoptimaliseerde IF-testen die kunnen worden aangepast aan het type kanker, en het gebruik van gratis open-source software voor het meten en analyseren van celafbeeldingen om een semi-automatische de numatie van de cellen volgens fluorescerende kleuring. Bovendien kan multiplexen van de Microscoop worden uitgevoerd, afhankelijk van het aantal beschikbare fluorescerende filters/markers.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Monsters werden prospectief verzameld in het kader van de CIRCAN ("circulerende kanker") cohort in het universitair ziekenhuis van Lyon na schriftelijke toestemming van de patiënt. Deze studie werd geïntegreerd in de CIRCAN_ALL cohort. De studie CIRCAN_ALL werd erkend als niet-Interventioneel door de CPP Zuid-Oost IV gedateerd 04/11/2015 onder de referentie L15-188. Een gewijzigde versie werd erkend als niet-Interventioneel op 20/09/2016 onder referentie L16-160. De CIRCAN_ALL studie werd verklaard aan de correspondent voor IT en vrijheid van de Hospices civils de Lyon op 01/12/2015, onder de referentie 15-131. Bloedafname werd uitgevoerd wanneer artsen de vroegste indicatie van de progressie van de tumor waargenomen.
Opmerking: Gebruik alle reagentia en materialen die zijn beschreven in de tabel met materialen met de respectieve opslagcondities voor pre-analytische monstervoorbereiding en immunofluorescentietest. Het vervangen van reagentia en/of het wijzigen van opslagcondities kan resulteren in een suboptimale test prestaties.
1. ontsmetting van spiraal Microfluïdisch apparaat
Opmerking: Ontsmetting van het spiraalvormige microfluïdische apparaat is een vereiste om alle immunofluorescentie achtergrond die wordt gegenereerd door besmetting met bacteriën te verwijderen, de cytomorfologie van Ctc's te verkennen en ze te kunnen onderscheiden van normale immuuncellen. Het protocol is geoptimaliseerd voor bloedmonsters verzameld in K2EDTA buizen binnen 6 h na bloed bemonstering en verrijkt met behulp van de spiraal microfluïdische apparaat in schone omstandigheden. Het gebruik van deze test voor andere soorten monsters (andere biologische vloeistoffen) kan extra optimalisatie vereisen. Dit decontaminatieprotocol moet eenmaal per week worden uitgevoerd.
- Bereiding van de reagentia
- Bereiding van de verdunnings vloeistof buffer
- Steriliseer 20 mL verdunnings additief reagens met een spuit filter van 0,22 μm en voeg direct toe aan 1 L 1x fosfaatbuffer Saline (PBS) Ultra-zuivere kwaliteit (tabel van materialen).
- Sterilisatie van reagentia en het ingangs stro
- Steriliseren de RBC lysis buffer en resuspensie buffer (RSB; Tabel met materialen) met behulp van een 0,22 μm spuit filter en voorraad in een nieuwe polypropyleen conische buis van 50 mL voor elke oplossing.
- Steriliseer het ingangs stro door bij kamertemperatuur (RT) voor 1 uur in het All-Purpose reinigings reagens (tabel van de materialen) te inbroed. Breng het rietje over naar het reinigingsmiddel op basis van Bleach (tabel met materialen) en INBROED bij RT gedurende 1 uur.
- Spoel de invoer stro tweemaal met steriele PBS voor 1 uur per stuk en bewaar de gesteriliseerde invoer stro in een chirurgisch steriele zak (tabel met materialen).
- Bereiding van de verdunnings vloeistof buffer
- Het decontamineren van de spiraal microfluïdische inrichting
- Desinfectie met behulp van het multifunctionele reinigings reagens
- Koppel de fles dop van het verdunningsmiddel los van de verdunnings poort van het spiraalvormige microfluïdisch apparaat door de bruine schroef los te schroeven. Breng in een microbiologische veiligheidskast tot 250 mL multifunctionele reinigings reagens (tafel van de materialen) over in een nieuwe lege fles.
- Draai de fles dop en het stro van het verdunningsmiddel op de fles van 250 mL multifunctionele reinigings reagens onder een microbiologische veiligheidskast. Bevestig deze fles aan de verdunnings vloeistof poort van het spiraalvormige microfluïdisch apparaat door de bruine schroef terug te schroeven.
- Overdracht tot 100 mL bleekmiddel (1% eindconcentratie; Tabel met materialen) de afvalcontainer die in de run Kit wordt geleverd (Figuur 1A).
- Laad een nieuw steriel invoer stro op het spiraalvormige microfluïdische apparaat (Inhoudsopgave) in de ingangspoort. Laad een nieuwe centrifugebuis van 50 mL in de ingangspoort. Laad een nieuwe centrifugebuis van 50 mL in de uitgangspoort.
- Ga verder met de Prime van de spiraal microfluïdische apparaat door te klikken op Prime op de spiraal microfluïdische apparaat (3 min). Verwijder de ingangs buis nadat de Prime is voltooid.
- Breng tot 15 mL multifunctionele reinigings reagens aan op een nieuwe centrifugebuis van 50 mL met een serologische pipet onder een microbiologische veiligheidskast en bevestig de buis aan de ingangspoort van het spiraalvormige microfluïdisch apparaat.
- Controleer voordat u begint met lopen of de oplossing vrij is van overmatige luchtbellen. Als er bubbels aanwezig zijn, verwijder ze dan met een langzame aspiratie met een pipet.
- Laad een decontaminatie microfluïdische chip in het spiraalvormige microfluïdische apparaat. Run een programma 3 op de spiraal microfluïdische apparaat door te klikken op lopen en het selecteren van het programma 3 (31 min).
Opmerking: het programma 3 van het spiraalvormige microfluïdische apparaat maakt een snelle verrijking van Ctc's in 31 minuten mogelijk. - Ga verder met de reinigingsstap van het spiraalvormig microfluïdisch apparaat met behulp van het resterende volume van het multifunctionele reinigings reagens in de ingangs buis.
- Gooi de ingangs buis weg nadat de reinigingsstap is voltooid en laat de ingangs stro achter.
- Ontsmetting met behulp van het reinigingsmiddel op basis van bleekmiddel
- Koppel de multifunctionele reinigings reagensfles dop los van de verdunnings poort van het spiraalvormige microfluïdisch apparaat door de bruine schroef los te schroeven. Breng in een microbiologische veiligheidskast tot 250 mL op bleekmiddel gebaseerde reinigingsmiddelen (tabel metmaterialen) in een nieuwe lege fles (Figuur 1a).
- Schroef de multifunctionele reinigings reagensfles en het stro op de fles met het reinigingsmiddel op basis van bleekwater onder een microbiologische veiligheidskast. Bevestig deze fles aan de verdunnings vloeistof poort van het spiraalvormige microfluïdisch apparaat door de bruine schroef terug te schroeven.
- Breng tot 15 mL op bleekmiddel gebaseerde reinigingsmiddelen over in een nieuwe centrifugebuis-ingangs buis van 50 mL met behulp van een serologische pipet onder een microbiologische veiligheidskast. Laad de ingangs positie van de centrifugebuis van 50 mL. Laad een lege buis in de uitgangspositie.
- Voordat de uitvoering wordt uitgevoerd, controleert u of het monster vrij is van overmatige luchtbellen en indien aanwezig, verwijdert u de bubbels door ze langzaam met een pipet te aspireren.
- Voerprogramma 3 uit door op uitvoeren te klikken en het programma 3 (31 min)te selecteren. Ga na de run direct naar de reinigingsstap met behulp van het resterende volume bleekmiddel op basis van de reinigingsmiddelen in de ingangs buis.
- Gooi de invoer-en uitvoer buizen weg.
- Spoel het spiraalvormige microfluïdische apparaat af.
- Koppel de dop van de reinigingsmiddelen op basis van bleekmiddel los van de verdunnings poort van het spiraalvormige microfluïdisch apparaat door de bruine schroef los te schroeven. Breng in een microbiologische veiligheidskast het stro van de fles met het reinigingsmiddel op basis van bleekwater over in de nieuwe fles met de verdunnings vloeistof buffer. Schroef de fles op het spiraalvormige microfluïdische apparaat.
- Breng tot 15 mL gesteriliseerd water (tabel van materialen) over in een nieuwe 50 ml centrifugebuis ingangs buis met behulp van een serologische pipet onder een microbiologische veiligheidskast. Laad de ingangs positie van de centrifugebuis van 50 mL. Laad een lege buis in de uitgangspositie.
- Voordat de uitvoering wordt uitgevoerd, controleert u of het monster vrij is van overmatige luchtbellen en indien aanwezig, verwijdert u de bubbels door ze langzaam met een pipet te aspireren.
- Voerprogramma 3 uit door op uitvoeren te klikken en het programma 3 (31 min)te selecteren. Ga na de run direct naar de reinigingsstap met behulp van het resterende volume gesteriliseerd water in de ingangs buis.
- Gooi de invoer-en uitvoer buizen weg.
- Desinfectie met behulp van het multifunctionele reinigings reagens
2. onderhoud om de spiraal Microfluïdische apparaat bacterievrij te houden
Opmerking: Het routineonderhoud moet aan het eind van de dag worden uitgevoerd tijdens de laatste reinigingsstap.
- Breng tot 7 mL op bleekmiddel gebaseerde reinigingsmiddelen in de nieuwe centrifugebuis van 50 mL met behulp van een serologische pipet onder een microbiologische veiligheidskast. Schroef de reinigings buis op basis van bleekmiddel in de ingangspoort van het spiraalvormige microfluïdisch apparaat.
- Voordat de Clean run wordt verwerkt, controleert u of het invoer monster vrij is van overmatige luchtbellen en indien aanwezig, verwijdert u de bubbels door ze langzaam met een pipet te aspireren.
- Voer de Clean op het spiraalvormige microfluïdische apparaat.
3. pre-analytische verrijking van CTC bij bloedmonsters van patiënten
- Verzamel 7,5 mL bloed in de K2EDTA-buis en blijf onder zachte opwinding om celsedimentatie en stolling te voorkomen. Proces binnen 6 uur.
Opmerking: Als het bloed wordt opgevangen in een cel-vrij DNA bloed inzamelings buis met conserveringsmiddel, bewaren bij 4 °C tot de verwerking. Zorg ervoor dat het bloedmonster, de RBC lysis-buffer en de RBS-buffer zich op RT bevinden voordat u doorgaat met de stap verrijking. - Breng tot 7,5 mL volbloed over in een nieuwe centrifugebuis-ingangs buis van 50 mL met behulp van een serologische pipet onder een microbiologische veiligheidskast.
- Centrifugeer op 1.600 x g gedurende 10 minuten bij RT. Verzamel de plasma fractie met een pipet zonder de Buffy coat te verstoren. Vervang de plasma breuk door direct equivalent volume van PBS toe te voegen tot 7,5 mL.
- Voeg voorzichtig RBC lysisbuffer (tabel met materialen) toe aan het bloedmonster tot een eindvolume van 30 ml (voor een K2EDTA-buis) of 37,5 ml (voor een cel-vrij DNA-bloedopvangbuisje). Keer de bloedplaatjes buis 10x voorzichtig om en laat 10 minuten inbroelen bij RT.
Opmerking: Het bloedmonster verandert donkerder rood tijdens RBC lysis. Als er na 10 minuten geen verandering (van donkerrood en ondoorzichtig) wordt waargenomen, Inverteer dan de buis 3x en laat voor een ander maximum van 5 minuten staan. Laat het monster niet langer dan 15 minuten in de RBC lysisbuffer staan, omdat het de monster kwaliteit en de test prestaties in gevaar kan brengen. - Centrifugeer het gelyseerd bloedmonster gedurende 10 minuten bij RT met 500 x g , met centrifuge remmen (of de hoogste vertragings snelheid). Gebruik een Pasteur-pipet of serologische pipet om het supernatant voorzichtig te verwijderen totdat het volume het 4-5 mL-teken bereikt. Gebruik vervolgens de gefilterde micro pipettips om de resterende supernatant te verwijderen.
- Gebruik een P1000 micro pipet met een gefilterde tip om 1,0 mL RSB toe te voegen aan de wand van de ingangs buis van de centrifugebuis van 50 mL. Om te voorkomen dat er bubbels in de mix worden gebracht, moet u de celpellet hervatten door voorzichtig op en neer te pipetteren totdat het monster homogeen is.
- Voeg een extra 3 mL RSB toe aan de wand van de 50 mL centrifugebuis ingangs buis (totaal volume 4 mL). Vermijd het inbrengen van bubbels in de mix. Meng de celsuspensie zachtjes door voorzichtig op en neer te pipetteren.
Opmerking: In het onwaarschijnlijke geval dat regelmatig pipetteren niet in staat is om celklonten af te breken (gedefinieerd door zichtbaar te zijn of de pipetpunt te blokkeren), filtert u het monster door een celzeef van 40 μm om eventuele klontjes te verwijderen. Voeg 150 μL RSB toe aan het monster om volumeverlies door filtering te maken. Merk op dat deze methode spaarzaam moet worden gebruikt en alleen wanneer grote klonters worden waargenomen. - Voordat u doorgaat naar de verrijkings stap, Controleer of het monster vrij is van overmatige luchtbellen en indien aanwezig, verwijder de bellen en zorg dat u geen monsters wegneemt. Als er kleine bubbels aanwezig zijn, is het verwijderen ervan niet nodig.
- Verwerk het monster op het spiraalvormige microfluïdische apparaat.
4. verrijking van Ctc's van patiënt volbloed met het spiraalvormige Microfluïdische apparaat
- Laad een nieuwe spiraal microfluïdische chip. Laad twee lege centrifugebuizen van 50 mL in de ingangs-en uitgangspoorten.
- Voer een priemgetal door te klikken op Prime op het spiraalvormige microfluïdische apparaat (3 min). Verwijder de invoer-en uitvoer buizen en laad het te verwerken monster in de ingangspoort.
- Laad een heldere 15 mL conische buis in de uitgangspoort om verrijkte Ctc's te verzamelen. run programma 3 door te klikken op rennen en het programma 3 (31 min)te selecteren.
- Ontlaad de uitgangs buis en centrifugeer bij 500 x g gedurende 10 min (versnelling: 9; vertraging: 5). Verwijder met een serologische Pipet van 5 ml supernatant die stopt bij de 2 ml markering op de conische 15 ml buis. Met een micro pipet verwijdert u de supernatant die stopt bij een teken van 100 μL op de conische buis van 15 mL. Verwerk het verrijkte monster rechtstreeks voor immunofluorescentie kleuring.
5. immunofluorescentie kleuring
- Opsommen op een Chambered dia met een hemocytometer-type raster het aantal cellen per mL. Verdun het verrijkte monster met 0,2% anti-bindende oplossing (tabel met materialen) tot een concentratie van 100.000 cellen/100 μL per cytospin.
- Bevochtig de contour van de monsterkamer met behulp van katoen (tabel met materialen) met 50 μL 0,2% anti-bindende oplossing. Plaats een poly lysine glas-Slide in de sample kamer en sluit.
- Jas een tip met 0,2% anti-bindende oplossing door Pipetteer op en neer 3x. Hervat het verrijkte monster en breng de celoplossing over in de monsterkamer. Centrifugeer met een speciale centrifuge (tabel met materialen) bij 400 rpm gedurende 4 min (acceleratie laag).
- Plaats een silicium-isolator rond het gebied van depositie. Laat de glazen schuif gedurende 2 minuten onder een microbiologische veiligheidskast drogen.
- Bereid de fixatie oplossing door 1 mL 16% Paraformaldehyde (PFA) te verdunen met 3 mL steriele PBS. Voeg 100 μL fixatie oplossing (4% PFA) per monster toe en inbroed gedurende 10 minuten bij RT. Verwijder de fixatie oplossing en voer drie spoelingen uit met 200 μL PBS en inbroed op RT elk gedurende 2 minuten.
Let op: Gebruik PFA onder een chemische veiligheidskast om inademing te voorkomen. - Bereid de verzadigings oplossing voor door verdunning van het foetaal runderserum (FBS) bij 5%, FC receptor (FcR) blokkerende reagens bij 5%, en boviene serumalbumine (BSA) bij 1% in steriele PBS (tabel van de materialen). Voeg een verzadigings oplossing van 100 μL per monster toe en inincubatie gedurende 30 minuten bij RT. Verwijder de verzadigings oplossing.
- Voeg 100 μL antilichaam oplossing per monster toe (CD45 antilichaam 1/20; PanCK antilichaam 1/500; PD-L1 antilichaam 1/200; QSP-verzadigings oplossing 100 μL) (tabel met materialen). Plaats de poly lysine glas-Slide in een 100 mm x 15 mm Petri schaaltje. Bevochtig een absorberend papier met 2 mL steriel water en sluit de Petri schaal met het deksel. Plaats bij 4 °C 's nachts en Bescherm tegen het licht.
- Verwijder de antilichaammix en voer 3 wasgewassen uit met 200 μL PBS die elke wasbeurt gedurende 2 minuten inbroed. Laat het monster 5 minuten drogen en Bescherm het tegen het licht. Plaats 10 μL montage oplossing (tabel van de materialen) op het gebied van depositie en afdekking met een Microscoop afdekplaat zonder een bubbel te maken. Sluit de dekslip af met nagellak.
6. acquisitie van immunofluorescentie beelden met een rechte fluorescerende Microscoop en bijbehorende software
- Gebruik een rechte fluorescerende Microscoop met een X/Y gemotoriseerd platform. Gebruik een 20x-doelstelling om 8-bits RGB TIFF-afbeeldingen te maken in vier kanalen die corresponderen met DNA-kleurstof (4 ', 6-diamidino-2-phénylindole [DAPI]), PanCK-kleurstof (fluorescein isothiocyanaten [FITC]), PD-L1 Dye (CY3) en CD45 Zet de Mercury-Lamp 15 minuten voor gebruik aan en pas de Microscoop en bijbehorende software aan de semi-geautomatiseerde shoot aan.
- Plaats de glazen schuif op het platform.
- Definieer in het menu acquisitie de vier kanalen en stel de belichtingstijd in (DAPI: 15 MS, FITC [PanCK]: 500 MS; CY3 [PD-L1]: 800 MS; CY5 [CD45]: 1.000 MS). Definieer de te scannen tegels. Klik op tegels. Definieer in Geavanceerd experimenthet gebied dat moet worden gescand.
- Pas de scherpstelling op het scherm aan. Klik op experiment starten.
- Exporteer TIF-bestanden van elk kanaal en noem het afbeeldingsbestand specifiek met deze informatie: Sample_NumberofTilesRegion_dye_NumberOfSubtiles. TIF (bijvoorbeeld Sample1_TR1_c1m01). Naam kleurstof als volgt: het DAPI-kanaal is C1, FITC-kanaal is C2, CY3 kanaal is C3 en CY5 kanaal is C4.
7. analyse van immunofluorescentie beelden met beeldanalyse software
- Download en installeer de gratis software voorbeeld analyse van de website van Broad Institute. Accepteer alle standaardwaarden tijdens de installatie. Open de software voorbeeld analyse en klik op bestand | Pijplijn uit bestand | Analysis_4channels_CTC. cppipe.
Opmerking: De pijplijn converteert RGB-kleur afbeeldingen naar grijswaarden, verwijdert artefacten door afbeeldingen glad te maken met een mediaan filter, identificeert kernen en cytoplasma, kwantificeert fluorescentie intensiteiten van elk kanaal en exporteert ze naar een Excel-bestand. - Bestanden in de bestandslijstneerzetten. Werk de metagegevens bij om de bestanden te groeperen op tegels.
Opmerking: Alle instructies voor het groeperen van afbeeldingen worden gespecificeerd in de software. Naam bestanden verschenen in de Namesandtypes module en bestanden worden gegroepeerd op basis van het nummer van de tegel en het kanaal per samples. - Klik op uitvoerinstellingen weergeven en geef een juiste standaarduitvoer op. Klik op afbeeldingen analyseren. Open het spreadsheetbestand dat overeenkomt met measure_intensity parameters.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De eerste vereiste was om ongecontamineerde (infectieuze agent-Free) collecties van Ctc's voor weefselkweek te verkrijgen en te voorkomen dat de achtergrond wordt gegenereerd. Het decontaminatie protocol zorgde voor reiniging van alle leidingen en pompen, en resulteerde in de verzameling van Ctc's met een goede herstelsnelheid zonder bacteriële besmetting. De verrijkte monsters werden vergeleken zonder en met de decontaminatieprotocol-workflow van het spiraalvormige microfluïdische apparaat. Om het decontaminatie protocol te valideren, werd de A549 cellijn gebruikt bij afwezigheid van volbloed en verrijkt rechtstreeks met behulp van het spiraalvormig microfluïdisch apparaat. Zonder de geoptimaliseerde decontaminatie protocol, hoge bacteriële besmetting werd waargenomen in de weefselcultuur van verrijkte A549 cellijn na slechts 24 h, die de dood en cytomorphological veranderingen in eukaryote cellen veroorzaakt (Figuur 1B).
In tegenstelling, na het reinigings protocol, werden levende A549 cellen verkregen door te groeien in 2D-cultuur na 10 h van weefselcultuur en media verwijdering en in 3D-omstandigheden (Figuur 1B), evenals patiënt monsters (Figuur 1C). De potentiële CTC worden geïdentificeerd met een rood kruis (Figuur 1C).
In Figuur 2 wordt de volledige workflow voor immunofluorescentie fenotyping van verrijkte ctc's uit volbloed samengevat. Het bestaat uit vier belangrijke stappen: volledige bloedafname, CTC-verrijking, immunofluorescentie (IF)-assay en beeldanalyse met behulp van software. Eerder, de herstelsnelheid van de spiraal microfluïdische apparaat is aangepakt14. Met behulp van fluorescerende nabootsen ctcs (MCTC), dit herstelpercentage werd vastgesteld op 1,3 ctcs/ml volbloed14.
Het huidige werk richtte zich op het opzetten van de optimale voorwaarden voor IF-analyse van verrijkte Ctc's en downstreamvisualisatie (Figuur 2). Ten eerste, om de specificiteit van het PD-L1 antilichaam te testen, werden twee cellijnen gebruikt: (1) PC3 High-positive-PD-L1 cellline en (2) SW620 low-positief-PD-L1 cellijn. De cellen werden vervolgens verrijkt met het spiraalvormige microfluïdische apparaat en geanalyseerd door IF. Alle cellen waren bevlekt met de tumor anti-PanCK marker, witte bloedcel anti-CD45 marker, anti-PD-L1 (nuttig bij longkanker), en DAPI (Nuclear Dye). Witte bloedcellen werden geïdentificeerd als positief voor DAPI en CD45, terwijl kankercellen werden geïdentificeerd als positief voor DAPI en PanCK en negatief voor CD45. De PC3 High-PD-L1-positieve cellijn was positief gekleurd voor PD-L1, terwijl een lagere PD-L1 expressie werd gedetecteerd in de SW620 low-PD-L1-negatieve cellijn.
Vervolgens werden de volgende vergeleken: de (i) vloeistof als kleurings test, (II) kleuring van Ctc's die rechtstreeks op poly lysine gecoate dia's zijn afgezet, en (III) als kleuring van Ctc's na cytospin op dia's met poly lysine gecoate. Er werd duidelijk opgemerkt dat het herstelpercentage van Ctc's afhankelijk was van het type protocol dat werd gebruikt (Figuur 3A). In de vloeistof als kleurings test was de terugwinnings snelheid slechts 10% voor het aantal spiked mCTC de laagste. Dit lage herstelpercentage geeft een probleem voor de meeste patiënten met gemetastaseerde NSCLC, omdat het de mogelijkheid van deze tests aanzienlijk beperkt om de weinige Ctc's te isoleren en fenotypische informatie te verstrekken. De tweede en derde secties die worden beschreven (directe afzetting van mCTC of CTC op dia's met poly lysine coating zonder en met cytopsin) hadden systematisch een herstelpercentage van meer dan 60% (Figuur 3A).
Figuur 3 B toont representatieve beelden van deze als assays met behulp van volledige bloedmonsters van dezelfde patiënt, hetzij met behulp van de vloeistof als kleurings test of als kleurings test op poly lysine gecoate dia's met cytospin. De opsomming van kernen was duidelijk verschillend tussen de twee assays (Figuur 3B). De nucleaire DAPI-kleuring verschafte de opsomming van de totale cellen in het monster en de kleuring van de biomarker stelde de nadruk van de groene PanCK-positieve cellen, oranje in de PD-L1-positieve cellen, en rood in de CD45 residuele witte cellen (Figuur 3 B).
Vervolgens, om cytologisch differentiëren witte bloedcellen uit tumorele cellen, de vorm van de Nucleus moet worden gevisualiseerd, omdat het kenmerkend is voor het celtype. Figuur 3 C demonstreert de contouren van de kernen die wazig en morfologie zijn die ongebruikelijk is bij afwezigheid van de cytospin-stap. Het geoptimaliseerde protocol omvatte aldus cytospinnen van verrijkt Ctc's op dia's met poly lysine coating gevolgd door 4% Paraformaldehyde (PFA) fixatie, voor het bewaren van de glaasjes vóór als kleuring. Dit geoptimaliseerde protocol had vergelijkbare herstel percentages als de afzetting van mCTC rechtstreeks op poly lysine gecoate dia's (Figuur 3A), zelfs wanneer zeer weinig cellen werden toegevoegd. Aangezien deze extra stap het behoud van de nucleaire morfologie (Figuur 3C) mogelijk maakt, werden granulocyten geïdentificeerd met hun nuclei met meerdere lobben, evenals tumorele cellen (geëtiketteerd met een rood kruis in de Nucleus) met hun nucleaire afwijkingen, maligniteiten patronen, en grotere grootte in vergelijking met witte bloedcellen.
Na optimalisatie van het IF-protocol werd een proof-of-concept uitgevoerd met volbloed van gemetastaseerde patiënten. Monsters werden prospectief verzameld in het kader van het CIRCAN-routine cohort in het universitair ziekenhuis van Lyon. Bloedafname werd meestal uitgevoerd wanneer artsen de vroegste indicatie van de progressie van de tumor waargenomen. Alle tumor gevallen waren histologisch of cytologisch bevestigd op FFPE biopsie specimens tijdens de initiële diagnose. Hier werden CTCs-analyses op progressie uitgevoerd door onderzoekers die geen toegang hadden tot of voorafgaande kennis van klinische gegevens. Gedetailleerde pre-analytische overwegingen zijn eerder gepubliceerd15.
In Figuur 4, tabel 1en tabel 2worden verschillende bevindingen van Patiëntenmonsters gepresenteerd. De CD45 (+), PanCK (-), PD-L1 (-) profiel vertegenwoordigt de immuuncellen. De residuele telling van witte bloedcellen bleek sterk variabel en afhankelijk van het gehele bloedmonster. Het bereik in dit kleine pilot cohort was 648-11000 witte CD45 (+) cellen (Figuur 5A). Bijgevolg werd onmiddellijk na CTC-verrijking een opsomming van de verzamelde cellen opgenomen om de cellulaire dichtheid op het cytospin-gebied aan te passen met een dichtheid van 100.000-cellen/cytospin (zie rubriek 6). Deze ingeschakelde prestaties van verschillende cytospins per patiënt en optimalisatie van de microscopische observatie voorhand matige inventarisatie en gebruik van beeldanalyse software pipeline.
In Figuur 4A-C, tabel 1en tabel 2worden typische gevallen gerapporteerd waarin de resterende aantallen witte bloedcellen zeer verschillend waren:
i) het eerste profiel is de CD45 (-), PanCK (+) en PD-L1 (+), weergegeven in Figuur 4A . Vaak is de grootte van de cellen superieur aan 13 μm in diameter en de Nucleus morfologie is onregelmatig, wat een cytomorfologisch patroon van maligniteit vertegenwoordigt. Deze populatie is waarschijnlijk samengesteld uit CTC.
II) het tweede profiel is de CD45 (-), PanCK (-) en PD-L1 (+). Zoals reeds gemeld, Express niet alle Ctc's de PanCK biomarker (Figuur 4A).
III) het derde profiel is de CD45 (-), PanCK (+) en PD-L1 (-). Zoals reeds gemeld, uiten niet alle Ctc's de PD-L1 biomarker.
IV) het vierde profiel is de CD45 (+), PanCK (+) en PD-L1 (+), weergegeven in Figuur 4B. Het vertegenwoordigt de atypische geactiveerde immuuncellen in het hele bloed van de patiënt. Deze populatie is beschreven in verschillende publicaties16,17,18 en vertegenwoordigt ongeveer 5% van de totale cellen na verrijking. De aanwezigheid van deze populatie kan de snelheid van vals-positieve Ctc's in een monster verhogen als de intensiteit van het CD45 signaal te laag is en de morfologie van de Nucleus niet goed bewaard is. Dit benadrukt sterk de noodzaak van het uitvoeren van aanvullende tumorele biomarkerkleuring, zoals Vimentine en/of Epcam in deze immunofluorescentietest.
(v) ten slotte omvat het laatste profiel de niet-gelabelde cellen CD45 (-), PanCK (-) en PD-L1 (-), gemarkeerd in Figuur 4C. De Nucleus in deze populatie vertoont vaak cytomorfologische patronen van maligniteiten, en de grootte is meer dan 13 μm in diameter. Het percentage van deze cellen in de monsters is zeer variabel volgens de patiënt volbloed. Dit benadrukt de noodzaak om complementaire tumorele biomarkers te gebruiken om het tumorele patroon van deze celsubpopulatie te bevestigen.
In tabel 1 en tabel 2 werd het aantal cellen van 16 monsters gerapporteerd door gevorderde GEMETASTASEERDE nsclc-patiënten. De cellen werden geclassificeerd volgens de uitdrukking van de biomarkers. Er werd een hoge variabiliteit waargenomen bij de verkregen subpopulaties. Zoals reeds gemeld in onafhankelijke studies, werden CD45 (-), PanCK (+) en PD-L1 (+) profielen gevonden in de meeste samples. Aangezien de CTC-populatie echter zeer heterogeen is, patiënt monsters bevatten ook CD45 (-), PanCK (-) en PD-L1 (+) subpopulaties, de CD45 (-), PanCK (+) en PD-L1 (-) subpopulaties en niet-gelabelde cellen CD45 (-), PanCK (-) en PD-L1 (-) subpopulaties. Het niveau van de resterende witte bloedcellen was zeer variabel onder geanalyseerde monsters.
Om de celopsomming te vergemakkelijken, werd een pilot pipeline opgezet met behulp van de Image Analysis software voor een geautomatiseerde analyse van de immunofluorescentie beelden. De werkstroom wordt beschreven in afbeelding 5. In dit geval is het belangrijk om hoge kwaliteit immunofluorescentie beelden te verwerven in termen van contrast en fluorescentie intensiteit. Afhankelijk van de capaciteit van de cluster berekening van de hardware, kan de pijplijn voorbeeld analyse worden toegepast op de volledige samengevoegde afbeelding van de cytospin of op een representatief gebied van de cytospin.
Hier, gebaseerd op de Microscoop, een semi-automatische scan van de cytospin (X/Y; de Z focus is niet inbegrepen) gebied gegenereerd 150-200 samengevoegde afbeeldingen. Deze afbeeldingen kunnen samen worden samengevoegd en direct worden geanalyseerd met behulp van de pijplijn voorbeeld analyse. Niettemin is deze procedure tijd-en berekenings cluster resource verbruikt, een belangrijke beperking voor het routine gebruik in laboratoria. Daarom werd, op basis van eerdere ervaring op het gebied van cellulaire hematologie, besloten om representatieve gebieden van elk monster te analyseren na controle onder een Microscoop dat de verdeling van cellen homogeen was op het gehele gebied van de cytospin. Vervolgens werd 25% van de totale oppervlakte van de cytospin (rond 40 tegels) gescand met de florescentie Microscoop om 40 x 4 onafhankelijke beelden te genereren. Het samengevoegde bestand werd opgesplitst per kanaal en er werden automatisch beeldbestanden gegenereerd met de Microscoop-software (zie hoofdstuk 7; Figuur 5 A). deze bestanden werden geïmporteerd in een beeldanalyse pijpleiding voor analyse volgens de beschreven parameters (zie sectie 8; Figuur 5 A).
In Figuur 5Bidentificeerden we handmatig een representatieve afbeelding met vier ctc's [CD45 (-), panck (+) en pd-L1 (+)] onder 77 immuuncellen [CD45 (+), panck (-) en pd-L1 (-)]. Figuur 5 B illustreert hoe de software voorbeeld analyse het aantal cellen op basis van de DAPI-kleuring heeft geïdentificeerd en geïnventariseerd. Ook wordt geïllustreerd hoe de analyse software voor afbeeldingen de secundaire objecten heeft geteld. Ten slotte werden fluorescentie intensiteiten voor elke fluorescerende kanalen gerapporteerd voor alle voorwerpen die in de beelden werden gerapporteerd.
De achtergrond is berekend en vertegenwoordigd door de negatieve cellen in het voorbeeld. De niet-geactiveerde immuuncellen hebben bijvoorbeeld een lage fluorescentie intensiteit en zijn in staat om de achtergrond van de PanCK-en PD-L1-kleuring te meten. Het fluorescerende signaal werd positief bevonden als de intensiteit van de fluorescentie die van de achtergrond met twee vouwen overschreed (gebaseerd op de analyse van vier onafhankelijke patiënt monsters). Wat betreft CD45 kleuring, aangezien het uitdrukkings niveau van CD45 zeer variabel is in de subpopulaties van de witte bloedcellen, werd de drempel van positiviteit zo laag mogelijk vastgesteld. Het was gebaseerd op de analyse van beelden van 10 gezond volbloed gekleurd met het CD45 antilichaam. De pilot-analyse (n = 4) toonde concordantie tussen handmatige opsomming en beeldanalyse software opsomming (tabel 2). Elke cel op de cytospin wordt geïdentificeerd door beeldanalyse software en stelt biologen in staat om de cel te volgen en handmatig de resultaten te bevestigen, indien nodig.
Figuur 1 : Overzicht van de workflow voor ontsmetting van spiraalvormig microfluïdisch apparaat instrument. A) drie belangrijke stappen in het decontaminatieproces (Zie Protocol), ter illustratie van de lokalisatie van de in-en uitgangen van het instrument. B) representatieve afbeeldingen van A549 cellijn verrijking voor en na decontaminatie van het instrument. De impact van de aanwezigheid van een infectieuze agens op de levensvatbaarheid en morfologie van verzamelde cellen wordt getoond. In de aanwezigheid van bacteriën, celmorfologie en levensvatbaarheid werd gewijzigd. Schaalbalk = 20 μm. (C) 3D-celcultuur van verrijkte patiënt monsters van Long-, prostaat-en borstkanker. Het Rode Kruis komt overeen met atypische cellen. Schaalbalk = 20 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2 : Overzicht van de workflow van immunofluorescentie analyse van volbloed bemonstering tot analyse van de fluorescentie beelden. De belangrijkste stappen worden als volgt weergegeven: bloedafname voor volbloed, CTC-inzameling met spiraalvormig microfluïdisch apparaat, immunofluorescentietest en beeldanalyse software. De keuze voor biomarker werd gedreven door een betere identificatie van de verschillende populaties cellen waarneembaar op de cytospin-glijbaan (CD45 voor immuuncellen, PanCK en PD-L1 voor longkanker cellen). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3 : Herstelpercentage van drie onafhankelijke kleurings protocollen. A) vergelijking van de terugvorderings graad van mCTCs van vloeibare kleuring, directe kleuring van de cel die op poly lysine gecoate dia's is afgezet en celkleuring na cytospin op dia's met poly lysine coating. B) representatieve beelden van patiënt monsters die met vloeistof worden verwerkt als protocol en direct-immunokleurings protocol met de cytospinstep. Cellen werden bevlekt met CD45 monoklonaal antilichaam (kloon HI30) Alexa Fluor 647; PanCK monoklonaal antilichaam (Clone AE1/AE3) Alexa Fluor 488; 4 ', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI). Schaalbalk = 20 μm.C) representatieve afbeeldingen van DAPI-kleuring van celverrijking met en zonder de cytospin-stap. De morfologie en grootte van de kernen werden getoond met behulp van DAPI-kleuring. Rode Kruis markeert cellen met afwijkingen in de Nucleus in het rechter beeld. In de linker afbeelding is de afbeelding vaag, omdat cellen zich niet op hetzelfde niveau bevinden (x-, y-en z-assen). Schaalbalk = 10 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4 : Identificatie van celprofielen. A) representatieve beelden van patiënten met verschillende CTC-profielen. De fluorescentie kanalen worden afzonderlijk weergegeven. De samengevoegde afbeeldingen worden links weergegeven. Ze zijn gekleurd met CD45 monoklonaal antilichaam (kloon HI30) Alexa Fluor 647; PanCK monoklonaal antilichaam (Clone AE1/AE3) Alexa Fluor 488; PDL-1 monoklonaal antilichaam (kloon 29E2A3) phycoerythrin; 4 ', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI); pijlen wijzen naar atypische cellen. B) representatieve beelden van immunokleuring van twee patiënt monsters met atypische witte bloedcel profielen. Cellen werden bevlekt met CD45 monoklonaal antilichaam (kloon HI30) Alexa Fluor 647; PanCK monoklonaal antilichaam (Clone AE1/AE3) Alexa Fluor 488; PDL-1 monoklonaal antilichaam (kloon 29E2A3) phycoerythrin; 4 ', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI). De afbeelding benadrukt de aanwezigheid van immuuncellen gekleurd met CD45 (+), PanCK (+), en PD-L1 (+). (C) de afbeelding markeert de aanwezigheid van niet-gelabelde cellen (CD45 (-), panck (-) en pd-L1 (-). Schaalbalk = 10 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5 : Overzicht van de analyse van de fluorescerende beelden. (A) de belangrijkste stappen worden beschreven: microscopie scannen, het kanaal splitsen op basis van de fluorescentie, en het importeren van bestanden in beeldanalyse software. (B) beschrijving van de drie verschillende stappen voor de workflow van de beeldanalyse software. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Tabel 1: handmatige inventarisatie van patiënt celverrijking. Opsomming van cellen op basis van DAPI-kleuring. Opsomming van andere objecten op basis van FITC, PE en CY5 kleuring.
Tabel 2: Software voorbeeld analyse opsomming van patiënt celverrijking . Opsomming van cellen op basis van DAPI-kleuring. Opsomming van andere objecten op basis van FITC, PE en CY5 kleuring. Vergelijking van handmatige telling en beeldanalyse software opsomming.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Twee belangrijke punten zijn in de huidige studie aan de orde gesteld, de eerste met betrekking tot de prestaties van de workflow voor de overdracht ervan naar klinische toepassingen, en de tweede over de afname van subjectiviteit voor de analyse van de verkregen fluorescentie beelden.
Een performante en geoptimaliseerde workflow voor CTC-inventarisatie werd aanvankelijk bepaald met aanpasbare IF-assay na celverrijking via een CTC-label vrij microfluïdisch systeem (spiraal microfluïdisch apparaat). Met behulp van deze workflow bevestigde een pilot studie dat alle monsters van gemetastaseerde NSCLC-patiënten atypische cellen bevatten, die allemaal CD45 (-) waren. Ze kunnen ook worden gelabeld met PanCK en/of PD-L1 biomarkers; ze kunnen echter ook volledig negatief zijn voor alle geteste biomarkers [CD45 (-), PanCK (-), en PD-L1 (-) zoals waargenomen in het S19-monster (tabel 2)]. Dit benadrukt sterk de noodzaak van extra biomarkers voor fenotyping CTC-subpopulaties. Daarom is voorgesteld om epitheel-mesenchymale biomarkers zoals EpCAM, Vimentin en N-Cadherin toe te voegen; markers van kanker stamcellen met inbegrip van CD44 en CD133; en specifieke tumormarkers met inbegrip van TTF1 voor Long adenocarcinoom.
In het pilot-onderzoek was het bereik van atypische cellen [40; > 400] van 3,5 mL volbloed. Voor 80% van de Patiëntenmonsters was de atypische celtelling meer dan 50. Inderdaad, in cytologische19,20,21 monsters van Endo bronchiale Ultra Sonic gids trans bronchiale naald aspiratie of CT-geleide trans-thoracale puncties, PD-L1-analyse is geschikt voor de meeste van de monsters, maar een drempel van ≥ 100 tumorcellen wordt vaak toegelaten tot het produceren van een statistische en klinische interpretatie van de waarde. Echter, in het specifieke geval van bloed Ctc's, opgemerkt moet worden dat de kwestie van ruimtelijke tumor heterogeniteit wordt omzeild door tegenstelling tot kleine on-site tumormonsters.
Het tweede punt was om de impact van de handler op de analyse van immunofluorescentie beelden te voorkomen. Beeldanalyse software van fluorescerende beelden werd zo ingesteld om de celopsomming te standaardiseren en statistische gegevens te verstrekken voor deze samples. Dit geautomatiseerde proces benadrukte de noodzaak van krachtige berekenings clusters voor de analyse van alle cellen in hetzelfde voorbeeld. Bovendien moet de kwaliteit van de IF-kleuring in hetzelfde vlak liggen (om gebruik van confocale systemen te voorkomen) en de dichtheid van cellen op de cytospin moeten worden gekalibreerd om de beeldanalyse software in staat te stellen alle cellen afzonderlijk op de dia te herkennen. Ten slotte werden de resultaten niet gevalideerd met betrekking tot klinische uitkomsten in een cohort van patiënten, maar dit punt moet worden aangepakt in een andere speciale studie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Jean-Philippe Aurel en Kathryn Weiqi Li zijn medewerkers van Biolidics Company die in dit artikel gebruikte instrumenten produceert. De andere auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door onderzoeksbeurzen van AstraZeneca (Londen, Verenigd Koninkrijk), Biolidics (Singapore) en de Ligue contre le Cancer (Saone et Loire, Frankrijk). De auteurs bedanken AstraZeneca en Biolidics bedrijven voor hun financiële steun.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) | Ozyme | BLE 422801 | Storage conditions: +4 °C |
| BD Facs Clean – 5 L | BD Biosciences | 340345 | Bleach-based cleaning agent. Storage conditions: Room temperature |
| Bleach 1% Cleaning Solution 100 mL | Biolidics | CBB-F016012 | Bleach. Storage conditions: Room temperature |
| Bovine Serum Albumin (BSA) 7.5% | Sigma | A8412 | Storage conditions: +4 °C |
| CD45 monoclonal antibody (clone HI30) Alexa Fluor 647 | BioLegend | BLE304020 | Storage conditions: +4 °C |
| CellProfiler Software | Broad Institute | Image Analysis Software | |
| Centrifuge device | Hettich | 4706 | Storage conditions: Room temperature |
| Centrifuge tube 50 mL | Corning | 430-829 | Storage conditions: Room temperature |
| Centrifuge Tube 15 mL | Biolidics | CBB-F001004-25 | Storage conditions: Room temperature |
| ClearCell FX-1 System | Biolidics | CBB-F011002 | Spiral microfluidic device. Storage conditions: Room temperature |
| Coulter Clenz Cleaning Agent – 5 L | Beckman Coulter | 8448222 | All-purpose cleaning reagent. Storage conditions: Room temperature |
| CTChip FR1S | Biolidics | CBB-FR001002 | Microfluidic chip. Storage conditions: Room temperature |
| Cytospin 4 | ThermoFisher | A78300003 | Storage conditions: Room temperature |
| Diluent Additive Reagent – 20 mL | Biolidics | CBB-F016009 | Storage conditions: +4 °C |
| EZ Cytofunnels | ThermoFisher | A78710003 | Sample chamber with cotton. Storage conditions: Room temperature |
| FcR blocking Agent | Miltenyi Biotec | 130-059-901 | Storage conditions: +4 °C |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Gibco | 10270-106 | Storage conditions: +4 °C |
| Fluoromount | Sigma | F4680 | Mounting solution. Storage conditions: Room temperature |
| Fungizone - 50 mg | Bristol-Myers-Squibb | 90129TB29 | Anti-fungal reagent. Storage conditions: +4 °C |
| FX1 Input Straw with lock cap | Biolidics | CBB-F013005 | Straw. Storage conditions: Room temperature |
| KovaSlide | Dutscher | 50126 | Chambered slide. Storage conditions: Room temperature |
| PanCK monoclonal antibody (clone AE1/AE3) Alexa Fluor 488 | ThermoFisher | 53-9003-80 | Storage conditions: +4 °C |
| Paraformaldehyde 16% | ThermoFisher | 11490570 | Fixation solution. Storage conditions: +4 °C |
| PD-L1 monoclonal antibody (clone 29E2A3) - Phycoerythrin | BioLegend | BLE329706 | Storage conditions: +4 °C |
| Petri Dish | Dutscher | 632180 | Storage conditions: Room temperature |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Ozyme | BE17-512F | Storage conditions: +4 °C |
| Phosphate Buffered Saline Ultra Pure Grade 1x – 1 L | 1st Base Laboratory | BUF-2040-1X1L | Storage conditions: Room temperature |
| Pluronic F-68 10% | Gibco | 24040-032 | Anti-binding solution. Storage conditions: Room temperature |
| Polylysine slides | ThermoFisher | J2800AMNZ | Storage conditions: Room temperature |
| Polypropylene Conical Tube 50 mL | Falcon | 352098 | Storage conditions: Room temperature |
| RBC Lysis Buffer – 100 mL | G Biosciences | 786-649 | Storage conditions: +4 °C |
| RBC Lysis Buffer – 250 mL | G Biosciences | 786-650 | Storage conditions: +4 °C |
| Resuspension Buffer (RSB) | Biolidics | CBB-F016003 | Storage conditions: +4 °C |
| Shandon Cytopsin4 centrifuge | ThermoFisher | A78300003 | Dedicated centrifuge. Storage conditions: Room temperature |
| Silicon Isolator | Grace bio-Labs | 664270 | Storage conditions: Room temperature |
| Sterile Deionized Water – 100 mL | 1st Base Laboratory | CUS-4100-100ml | Storage conditions: Room temperature |
| Straight Fluorescent microscope Axio Imager D1 | Zeiss | Storage conditions: Room temperature | |
| Surgical Sterile Bag | SPS Laboratoires | 98ULT01240 | Storage conditions: Room temperature |
| Syringe BD Discardit II 20 mL sterile | BD Biosciences | 300296 | Storage conditions: Room temperature |
| Syringe Filter 0.22 µm 33 mm sterile | ClearLine | 51732 | Storage conditions: Room temperature |
| Zen lite 2.3 Lite Software | Zeiss | Microscope associated software |
References
- Gandhi, L., et al. Pembrolizumab plus Chemotherapy in Metastatic Non-Small-Cell Lung Cancer. The New England Journal of Medicine. 378 (22), 2078-2092 (2018).
- Paz-Ares, L., et al. Pembrolizumab plus Chemotherapy for Squamous Non-Small-Cell Lung Cancer. The New England Journal of Medicine. 379 (21), 2040-2051 (2018).
- Langer, C. J., et al. Carboplatin and pemetrexed with or without pembrolizumab for advanced, non-squamous non-small-cell lung cancer: a randomised, phase 2 cohort of the open-label KEYNOTE-021 study. The Lancet Oncology. 17 (11), 1497-1508 (2016).
- Hellmann, M. D., et al. Tumor Mutational Burden and Efficacy of Nivolumab Monotherapy and in Combination with Ipilimumab in Small-Cell Lung Cancer. Cancer Cell. 33 (5), 853-861 (2018).
- Chouaid, C., et al. Feasibility and clinical impact of re-biopsy in advanced non small-cell lung cancer: a prospective multicenter study in a real-world setting (GFPC study 12-01). Lung cancer. 86 (2), Amsterdam, Netherlands. 170-173 (2014).
- Nosaki, K., et al. Re-biopsy status among non-small cell lung cancer patients in Japan: A retrospective study. Lung cancer. 101, Amsterdam, Netherlands. 1-8 (2016).
- Uozu, S., et al. Feasibility of tissue re-biopsy in non-small cell lung cancers resistant to previous epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor therapies. BMC Pulmonary Medicine. 17 (1), 175 (2017).
- Kim, T. O., et al. Feasibility of re-biopsy and EGFR mutation analysis in patients with non-small cell lung cancer. Thoracic Cancer. 9 (7), 856-864 (2018).
- Nicolazzo, C., et al. Monitoring PD-L1 positive circulating tumor cells in non-small cell lung cancer patients treated with the PD-1 inhibitor Nivolumab. Scientific Reports. 6, 31726 (2016).
- Guibert, N., et al. PD-L1 expression in circulating tumor cells of advanced non-small cell lung cancer patients treated with nivolumab. Lung cancer. 120, Amsterdam, Netherlands. 108-112 (2018).
- Wang, Y., et al. PD-L1 Expression in Circulating Tumor Cells Increases during Radio(chemo)therapy and Indicates Poor Prognosis in Non-small Cell Lung Cancer. Scientific Reports. 9 (1), 566 (2019).
- Hao, S. -J., Wan, Y., Xia, Y. -Q., Zou, X., Zheng, S. -Y. Size-based separation methods of circulating tumor cells. Advanced Drug Delivery Reviews. 125, 3-20 (2018).
- Williams, A., Balic, M., Datar, R., Cote, R. Size-based enrichment technologies for CTC detection and characterization. Recent results in cancer research. Fortschritte der Krebsforschung. Progres dans les recherches sur le cancer. 195, 87-95 (2012).
- Garcia, J., et al. Profiling of Circulating Tumor DNA (ctDNA) in Plasma of non-small cell lung cancer (NSCLC) patients, Monitoring of EGFR p.T790M mutated allelic fraction using BEAMing Companion Assay and Evaluation in future application in mimicking Circulating Tumors Cells (mCTC). Cancer Medicine. , Forthcoming (2019).
- Garcia, J., et al. Evaluation of pre-analytical conditions and comparison of the performance of several digital PCR assays for the detection of major EGFR mutations in circulating DNA from non-small cell lung cancers: the CIRCAN_0 study. Oncotarget. 8 (50), 87980-87996 (2017).
- Lustberg, M. B., et al. Heterogeneous atypical cell populations are present in blood of metastatic breast cancer patients. Breast Cancer Research. 16 (2), 23 (2014).
- Ilie, M., et al. "Sentinel" circulating tumor cells allow early diagnosis of lung cancer in patients with chronic obstructive pulmonary disease. PLoS ONE. 9 (10), 111597 (2014).
- Khoo, B. L., et al. Clinical validation of an ultra high-throughput spiral microfluidics for the detection and enrichment of viable circulating tumor cells. PLoS ONE. 9 (7), 99409 (2014).
- Heymann, J. J., et al. PD-L1 expression in non-small cell lung carcinoma: Comparison among cytology, small biopsy, and surgical resection specimens. Cancer Cytopathology. 125 (12), 896-907 (2017).
- Biswas, A., et al. Clinical performance of endobronchial ultrasound-guided transbronchial needle aspiration for assessing programmed death ligand-1 expression in nonsmall cell lung cancer. Diagnostic Cytopathology. 46 (5), 378-383 (2018).
- Buttner, R., et al. Programmed Death-Ligand 1 Immunohistochemistry Testing: A Review of Analytical Assays and Clinical Implementation in Non-Small-Cell Lung Cancer. Journal of Clinical Oncology: Official Journal of the American Society of Clinical Oncology. 35 (34), 3867-3876 (2017).
