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Cancer Research

लंबी दूरी के व्युत्क्रम पीसीआर द्वारा हॉट लाइन-1s के रेट्रोट्रांसपोजिशन गतिविधि का पता लगाना

Published: July 27, 2019 doi: 10.3791/59880
Automatic Translation
1,2, 1,2
1Systems Oncology Research Program, University of Helsinki, 2Department of Biochemistry and Developmental Biology, Medicum, University of Helsinki

Summary

यह लेख एक सक्रिय लाइन-1 retrotransposon की गतिविधि पर नजर रखने के लिए और किसी दिए गए जीनोम में de नोवो retrotranspositions नक्शा करने के लिए एक सरल पीसीआर आधारित परख रूपरेखा. MCF7 सेल लाइन का उपयोग करके, हम यहाँ प्रदर्शित कैसे इस विधि एक लाइन-1 22Q12.1 पर स्थित की गतिविधि का पता लगाने के लिए लागू किया जा सकता है.

Abstract

लंबे अंतरालवाले नाभिकीय तत्व 1 (लाइन-1) मानव जीनोम में मोबाइल आनुवंशिक तत्वों का एकमात्र परिवार है जो स्वायत्त रूप से स्थानांतरित कर सकता है। वे ऐसा एक प्रक्रिया द्वारा करते हैं जिसे रेट्रोट्रांसपोजिशन कहा जाता है जिसमें वे एक एमआरएनए मध्यवर्ती बनाने के लिए प्रतिलेखन करते हैं जो परिणामस्वरूप रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन द्वारा जीनोम में डाला जाता है। सामान्य कोशिकाओं में चुप होने के बावजूद, लाइन-1s विभिन्न उपकला ट्यूमर में अत्यधिक सक्रिय हैं। डी नोवो लाइन-1 प्रविष्टि संभावित ट्यूमरजनन ड्राइव कर सकते हैं, और इसलिए यह व्यवस्थित रूप से कैंसर में लाइन-1 retrotransposition अध्ययन करने के लिए महत्वपूर्ण है। मानव जीनोम में मौजूद 150 रेट्रोट्रांसपोजिशन-सक्षम लाइन-1में से, केवल मुट्ठी भर लाइन-1 लोकी को "हॉट" लाइन-1 एस के रूप में भी जाना जाता है, जो विभिन्न प्रकार के कैंसर प्रकारों में अधिकांश डी नोवो लाइन-1 प्रविष्टि के लिए खाता है। हमने इन हॉट लाइन-1s की रेट्रोट्रांसपोजिशन गतिविधि पर नजर रखने के लिए एक सरल पॉलिमरेज चेन रिएक्शन (पीसीआर) आधारित विधि विकसित की है। लंबी दूरी की व्युत्क्रम (एलडीआई)-पीसीआर के आधार पर यह विधि 3 जेड ट्रांसडक्शन का लाभ लेती है, एक तंत्र जिसके द्वारा एक लाइन-1 अपने flanking गैर-पुनरावृत्ति क्षेत्र को जुटाती है, जिसका उपयोग बाद में डी नोवो लाइन-1 3 की पहचान करने के लिए किया जा सकता है एक विशेष गर्म लाइन-1 से स्टेमिंग.

Introduction

लंबे अंतरालवाले नाभिकीय तत्व (लाइन-1) मोबाइल आनुवंशिक तत्वों का एक परिवार है जिसे रेट्रोट्रांसपोसन कहा जाता है जो एक कॉपी-एंड-पेस्ट तंत्र के माध्यम से स्वतंत्र रूप से एक स्थान से दूसरे स्थान पर जा सकता है जिसे रेट्रोट्रांसपोजिशन कहा जाता है। विकास के समय में, मानव जीनोम लाइन-1 की 500,000 से अधिक प्रतियां जमा किया है1दोहराता है. हालांकि, जीनोम में मौजूद लाइन-1 प्रतियां के अधिकांश उत्परिवर्तित कर रहे हैं और इसलिए retrotransposition के माध्यम से स्थानांतरित नहीं कर सकते हैं; केवल $ 150 प्रतियां डीएनए अनुक्रम की अक्षत प्रति उन्हें2ले जाने के लिए आवश्यक है. सामान्य कायिक कोशिकाओं में इन लाइन-1 की गतिशीलता विभिन्न मेजबान कारकों3द्वारा प्रतिबंधित है। इन प्रतिबंधों को विभिन्न उपकला ट्यूमर में राहत दी जाती है, जिससे लाइन-1s को कम किया जा सकता है और जिसके परिणामस्वरूप ट्यूमर जीनोम4में कई डी नोवो प्रविष्टि होती है। इनमें से कुछ ट्यूमर-संबद्ध डी नोवो प्रविष्टि जीनों में सम्मिलित उत्तेजनन का कारण बनते हुए दिखाए गए हैं, इसलिए ट्यूमर की प्रगति5,6को चला रही है। इसलिए, यह ट्यूमर जीनोम में उपन्यास प्रविष्टि नक्शा करने में सक्षम होना महत्वपूर्ण है.

मौजूदा तरीकों de नोवो लाइन-1 प्रविष्टि का उपयोग करें (1) पूरे जीनोम अनुक्रमण दृष्टिकोण4,7,8, जहां विभिन्न कम्प्यूटेशनल एल्गोरिदम de नोवो लाइन-1 प्रविष्टि खोजने के लिए उपयोग किया जाता है का पता लगाने के लिए WGS डेटा से, या (2) अगली पीढ़ी के अनुक्रमण कि लक्ष्य 3 युवा के अंत, संभावित रूप से सक्रिय लाइन-1s9,10,11,12,13. हालांकि, इन तरीकों के साथ कई हजार पास-पहचान प्रतियों के बीच उपन्यास प्रविष्टि खोजने तुच्छ से दूर है, और चुनौती आगे ट्यूमर विषमता और लाइन-1 प्रविष्टि4के साथ जुड़े जीनोमिक परिवर्तन से बढ़ रहा है.

इन मौजूदा विधियों का उपयोग करते हुए किए गए अध्ययनों से पता चला है कि ट्यूमर7,8में पाई जाने वाली अधिकांश डी नोवो लाइन-1 प्रविष्टि के लिए केवल कुछ लाइन-1 खाते हैं . इसलिए, जवाब देने के लिए या नहीं एक विशेष ट्यूमर नमूना लाइन-1 गतिविधि प्रदर्शित करता है, यह अत्यधिक सक्रिय लाइन-1 loci के इस मुट्ठी भर की वजह से retrotransposition घटनाओं को मैप करने के लिए suffices. इस लेख में, हम एक साधारण पॉलिमरेज चेन रिएक्शन (पीसीआर) आधारित विधि14 का वर्णन करते हैं जिसका उपयोग 22क्12.1 पर टीटीसी28 जीन के पहले इनट्रॉन में एक विशेष LINE-1 टिड्डी की गतिविधि पर नजर रखने के लिए किया जा सकता है जो कोलोरेक्टल कैंसर में अत्यधिक सक्रिय है 7 , 8. इस लाइन-1 टिड्डी को पूरे लेख में टीटीसी28-लाइन-1के रूप में संदर्भित किया जाएगा। यह परख विशेष रूप से डे नोवो लाइन-1 रेट्रोट्रांसक्शन घटनाओं की पहचान करती है जो स्रोत LINE-1 के 3 ] पार्श्व क्षेत्र पर 3 ] ट्रांसडक्शन15नामक तंत्र द्वारा गैर-पुनरावर्ती अनुक्रम को जुटाती है। 3 transduction कमजोर लाइन-1 polyadenylation संकेत (पीएएस) है कि यह छोड़ करने के लिए और इसके बजाय मजबूत PAS बहाव पर प्रतिलेखन समाप्त करने के लिए कारण बनता है, इस प्रकार flanking गैर दोहराव अनुक्रम पर कब्जा करने के कारण होता है ( इसके बाद से "अद्वितीय टैग" के रूप में संदर्भित किया जाता है, जिसे फिर लाइन-1 अनुक्रम के साथ लक्ष्य स्थान में डाला जाता है। फिलिप एट अल16 हाल ही में पता चला है कि विभिन्न सेल प्रकार अलग लाइन-1 loci व्यक्त कर सकते हैं. इस खोज के प्रकाश में, इस विधि के लिए सबसे अधिक व्यक्त लाइन-1 है कि ब्याज के कैंसर के प्रकार में अपने अद्वितीय टैग जुटाने की गतिविधि पर नजर रखने के लिए लागू किया जा सकता है.

LDI-पीसीआर में पहला कदम एक प्रतिबंध एंजाइम है कि लाइन-1 परख जा रहा है युक्त एक प्रतिबंध टुकड़ा उत्पन्न करता है के साथ जीनोमिक डीएनए के पाचन है (यहाँ, TTC28-LINE-1) और अपनी अनूठी टैग (चित्रा.पा.) पाचन डीएनए तो स्वयं के द्वारा परिपत्र है-लिगेशन और पीसीआर अद्वितीय टैग के भीतर स्थित व्युत्क्रम प्राइमर का उपयोग कर प्रवर्धित. ऐसा करने से, अपने "देशी" स्थान पर पूर्ण लंबाई स्रोत लाइन-1 हमेशा प्रवर्धित होता है और इसके साथ, अद्वितीय टैग युक्त अलग-अलग लक्ष्य लोसी पर वंश लाइन-1 प्रविष्टि भी प्रवर्धित हो जाएगा (चित्र1), इस प्रकार रिपोर्टिंग प्रश्न में लाइन-1 की retrotransposition गतिविधि.

Protocol

इस शोध को हेलसिंकी विश्वविद्यालय अस्पताल की संस्थागत समीक्षा बोर्ड और आचार समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था। इस प्रोटोकॉल को प्रदर्शित करने के लिए उपयोग किए गए रक्त नमूने के लिए विषय से हस्ताक्षरित सूचित सहमति प्राप्त की गई थी।

1. व्युत्क्रम प्राइमर डिजाइनिंग और प्रतिबंध एंजाइमों का चयन (बायोइन्फोर्टिक्स)

  1. लाइन-1 संबद्ध अद्वितीय टैग का निर्धारण
    1. TTC28-LINE-1 अनुक्रम FASTA स्वरूप में एक लाइन-1 डेटाबेस जैसे L1Base17से डाउनलोड करें। TTC28-LINE-1 के लिए L1base ID 135 है।
    2. लाइन-1 अनुक्रम के 5 ] और 3 ] सिरों को पार्श्व करने वाले 5 केबी अनुक्रम शामिल करें और इसे वर्ड प्रोसेसर में एनोटेट करें।
      नोट: यहाँ लाइन-1 flanking अनुक्रम भूरे रंग फ़ॉन्ट में एनोटेट कियाजाता है, और लाइन-1 अनुक्रम ग्रे फ़ॉन्ट (पूरक फ़ाइल) में है।
    3. इस तरह के polyadQ 18 या ड्रैगन PolyA स्पॉटर 19 के रूप में एक PAS भविष्यवाणी उपकरण में चयनित लाइन-1 के cognate PAS के नीचे 1 kb अनुक्रम दर्ज करें और इस 1 kb विंडो में सभी polyadenylation संकेत एनोटेट।
      नोट: यदि 1 kb विंडो में कोई PAS नहीं है, तो अगले 1 kb विंडो डाउनस्ट्रीम में PAS के लिए खोज करें। TTC28-LINE-1 के अपने कमजोर PAS गुलाबी में प्रकाश डाला है और अन्य सभी PAS 1 केबी विंडो बहाव में लाल (पूरक फ़ाइल) में प्रकाश डाला है.
    4. LINE-1 के cognate PAS के अंत और "अद्वितीय टैग" के रूप में सबसे मजबूत PAS बहाव के बीच अनुक्रम एनोटेट करें।
      नोट: TTC28-LINE-1 की "अद्वितीय टैग"पीले रंग में प्रकाश डाला है (पूरक फ़ाइल).।
  2. व्युत्क्रम प्राइमर डिजाइन करना
    1. प्राइमर 3 (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/) या NCBI के प्राइमर-ब्लाट (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/) जैसे वेब-आधारित प्राइमर-डिजाइनिंग टूल में "अद्वितीय टैग" अनुक्रम दर्ज करके व्युत्क्रम PCR प्राइमर डिज़ाइन करें। इन उपकरणों द्वारा डिजाइन प्राइमर जोड़े पारंपरिक पीसीआर की सुविधा एक दूसरे का सामना करने के बाद से, उलटा पीसीआर प्रदर्शन करने के लिए प्राइमर जोड़ी के लिए रिवर्स-पूरक समारोह का उपयोग करें।
      नोट: के रूप में लाइन-1 transductions भारी उनके 5 ] अंत में काट रहे हैं और ट्रांसड्यूस क्षेत्र के आकार अत्यधिक चर है, दो व्युत्क्रम प्राइमर के बीच की दूरी कम से कम रखने के उद्देश्य, NCBI प्राइमर-ब्लास्ट में "पीसीआर उत्पाद लंबाई" पैरामीटर की स्थापना करके न्यूनतम. अद्वितीय टैग के भीतर कई PAS के मामले में, कई प्राइमर जोड़े है कि विभिन्न PAS के अनुरूप डिजाइन. PAS के करीब डिज़ाइन प्राइमर, के रूप में LINE-1 insertions आरएनए मध्यवर्ती के 3 $end से आरंभ और 5 $ अंत variably छोटा है. यहाँ तीन प्राइमर जोड़े डिजाइन किए गए थे, चायल और हरे रंग में प्रकाश डाला, TTC28 लाइन-1 (पूरकफ़ाइल)के अद्वितीय टैग में तीन मजबूत polyadenylation संकेतों के अनुरूप.
  3. प्रतिबंध एंजाइमों का चयन
    1. LINE-1 अनुक्रम को अपने 5 केबी अपस्ट्रीम और डाउनस्ट्रीम पार्श्वों के साथ सिलिको में प्रतिबंध-मापर जैसे वेब-आधारित उपकरण का उपयोग करके डाइजेस्ट करें। यह प्रतिबंध एंजाइमों कि इस क्षेत्र को पचा, विभिन्न प्रतिबंध टुकड़े पैदा की एक व्यापक सूची दे देंगे.
    2. प्रतिबंध एंजाइमों का चयन करें जो LINE-1 के मूल स्थान को निम्नानुसार काटते हैं: 5$end पर, या तो LINE-1 के 5$end या लाइन-1 के 5$end के ऊपर, और 3 के अंत में, LINE-1 के अद्वितीय टैग के डाउनस्ट्रीम।
      नोट: चयनित प्रतिबंध एंजाइम डीएनए मिथाइलेशन के प्रति असंवेदनशील होना चाहिए, गर्मी-निष्क्रिय होना चाहिए, और एक दूसरे के पूरक हैं कि विषम "स्टिकी" समाप्त होता है उत्पन्न करना चाहिए. आदेश में LDI-पीसीआर प्रदर्शित करने के लिए, सैकमैं प्रतिबंध एंजाइम है किGAGCTC साइटों पर डीएनए में कटौती, हल्के हरे रंग में यहाँ पर प्रकाश डाला, प्रयोग किया जाता है (पूरक फ़ाइल).
    3. चयनित प्रतिबंध एंजाइमों द्वारा किए गए प्रतिबंध टुकड़ा आकार का ध्यान रखना. यह 12 kb से अधिक नहीं होना चाहिए क्योंकि यह पीसीआर द्वारा कुशलतापूर्वक प्रवर्धित नहीं किया जा सकता है।

2. लंबी दूरी की व्युत्क्रम पीसीआर के लिए परिपत्र डीएनए टेम्पलेट्स बनाना

  1. डीएनए निष्कर्षण और गुणवत्ता मूल्यांकन
    1. नमूने से जीनोमिक डीएनए निकालें (ट्यूमर या रक्त) व्यावसायिक रूप से उपलब्ध डीएनए निष्कर्षण किट है कि अच्छी गुणवत्ता निकालने कर सकते हैं का उपयोग कर, उच्च आणविक वजन डीएनए LDI-पीसीआर के लिए आवश्यक निर्माता के निर्देशों के अनुसार. वैकल्पिक रूप से, उच्च आणविक वजन डीएनए भी फिनोल द्वारा निकाला जा सकता है: क्लोरोफॉर्म20.
    2. निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक fluorometer का उपयोग कर डीएनए एकाग्रता को मापने, और 1% पर डीएनए के 100 एनजी चलाने (w/v) agarose जेल युक्त इथिडियम ब्रोमाइड (0.5 डिग्री ग्राम/एमएल) में 1x Tris-acetate-EDTA (TAE) बफर पर 4.5 V/ डीएनए आणविक वजन मार्करों डीएनए की गुणवत्ता और मात्रा की जांच करने के लिए।
  2. पाचन जीनोमिक डीएनए
    1. एक पाचन प्रतिक्रिया मिश्रण (50 डिग्री सेल्सियस की अंतिम मात्रा) जोड़कर 20 इकाइयों Sacमैं प्रतिबंध एंजाइम, 10x प्रतिक्रिया बफर के 5 $L (सामग्रीकीतालिका), डीएनए के 100 एनजी (अप करने के लिए 44 डिग्री सेल्सियस) बर्फ पर एक 0.2 एमएल पीसीआर ट्यूब में (1 सबसे मैं निर्माताओं से प्रतिबंध एंजाइम के $L पूरी तरह से जीनोमिक डीएनए के 100 एनजी पचाने के लिए पर्याप्त है). ट्यूब flicking द्वारा समाधान मिक्स, और संक्षेप में अपकेंद्रित्र.
    2. 1 h के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर प्रतिक्रिया मिश्रण को इनक्यूबेट करने के लिए एक थर्मल साइकिलर का उपयोग करें, जिसके बाद 5 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर गर्मी निष्क्रियता होती है।
  3. पाचन जीनोमिक डीएनए स्व-लिगाटिंग
    1. 50 डिग्री सेल्सियस पाचन मिश्रण (चरण 2.2.2 के बाद), 10x T4 डीएनए लिगाज़ बफर के 8 डिग्री एल, टी 4 डीएनए लिगाज़ के 1 $L (5 इकाइयों) और अल्ट्राप्यूर पानी के 21 डिग्री एल को जोड़ने के लिए 80 डिग्री सेल्सियस की अंतिम प्रतिक्रिया मात्रा बनाने के लिए। ट्यूब flicking द्वारा समाधान मिक्स , और अपकेंद्रण संक्षेप में.
    2. 10 मिनट के लिए 22 डिग्री सेल्सियस पर एक थर्मल साइकिल में इनक्यूबेट, 10 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर एक गर्मी निष्क्रियता कदम के साथ समाप्त।

3. लंबी दूरी की व्युत्क्रम पीसीआर

  1. ग्रेडिएंट पीसीआर द्वारा प्राइमर अनीलिंग तापमान का निर्धारण
    1. (A-4) $C, (A-2)]C, A, (A+2) डिग्री सेल्सियस, (A+4) ]C का एक अनीलन तापमान ग्रेडिएंट सेट करें, जहाँ A,/A+4) ]C, वाणिज्यिक विक्रेता के वेब-आधारित उपकरण का उपयोग करके परिकलित प्राइमर युग्म का सैद्धांतिक अनीलन तापमान है.
      नोट: कुछ निर्माताओं से थर्मल cyclers मैन्युअल रूप से तापमान ढाल की स्थापना की अनुमति नहीं हो सकता है. उस स्थिति में, स्वचालित ग्रेडिएंट सेटिंग का उपयोग (A-4) के तापमान श्रेणी से (A-4) र्ब् में (A+4) र्ब् में किया जा सकता है।
    2. एक 1.5 एमएल microcentrifuge ट्यूब में निम्नलिखित घटकों के संयोजन और मिश्रण द्वारा पीसीआर के लिए एक मास्टर मिश्रण तैयार: 5x प्रतिक्रिया बफर के 4 $L, 10 एमएम डीएनटीपी के 0.4 $L, 2 डिग्री एम पीसीआर प्राइमर के 5 डिग्री एल (आगे और रिवर्स, चरण 1.3.1 में डिजाइन) 0ण्2 र्0ल (0ण्1 उ) प्रति अभिक्रिया प्रति डीएनए बहुलककाओं का। ग्रेडिएंट में प्रत्येक अनीलन तापमान के लिए एक अभिक्रिया सेट कीजिए।
    3. प्रत्येक प्रतिक्रिया के लिए, 0.2 एमएल पीसीआर ट्यूबों में मास्टर मिश्रण के अलिकूँत 19 डिग्री सेल्सियस और खंड 2 में किए गए परिपत्र डीएनए टेम्पलेट के 1 डिग्री एल (1.25 एनजी) जोड़ें।
      नोट: इस अनुकूलन कदम के लिए संभावित कीमती ट्यूमर डीएनए लेने से बचने के लिए इतनी के रूप में टेम्पलेट के रूप में सामान्य रक्त डीएनए से उत्पन्न परिपत्र आत्म-लीटेड डीएनए का प्रयोग करें।
    4. नीचे वर्णित के रूप में एक थर्मल साइकिलर पर ढाल पीसीआर कार्यक्रम चलाने: (i) 98 डिग्री सेल्सियस (denaturation) पर 3 मिनट का एक चक्र; (ii) 35 चक्र (10 s पर 98 डिग्री [denaturation], 20 s के तापमान ढाल पर [A-4] करने के लिए [A+4] [Anealing] और 1 [30 s प्रति किलोआधार अपेक्षित PCR उत्पाद] पर 72 डिग्री [विस्तार]); (iii) 72 डिग्री सेल्सियस (अंतिम विस्तार) पर 10 मिनट का एक चक्र।
    5. 1% agarose जेल21 में पीसीआर उत्पाद के 6 $L चलाने के लिए 4.5 V/cm पर 1x TAE बफर में तैयार और विभिन्न अनीलन तापमान पर मिले पीसीआर उत्पादों का विश्लेषण।
    6. अपेक्षित आकार से मेल खाती है जो किसी PCR उत्पाद पैदावार annealing तापमान का चयन करें।
  2. ट्यूमर जीनोम में डे नोवो लाइन-1 रेट्रोट्रांसपोजिशन गतिविधि का पता लगाना
    1. ट्यूमर के नमूने से उत्पन्न परिपत्र डीएनए टेम्पलेट्स पर व्युत्क्रम पीसीआर प्राइमर जोड़ी का उपयोग कर LDI-पीसीआर प्रदर्शन (अनुभाग 2). ग्रेडिएंट PCR (अनुभाग 3.1) के लिए के रूप में एक ही निर्देशों का पालन करें, लेकिन इस बार इष्टतम annealing तापमान के साथ तापमान ढाल की जगह.
    2. चरण 3.1.5 में किया के रूप में agarose जेल electrophoresis द्वारा पीसीआर उत्पादों का विश्लेषण करें। ज्ञात आकार के PCR उत्पाद या "देशी" PCR उत्पाद अपने मूल टिड्डी पर लाइन-1 के लिए इसी प्रत्येक प्रतिक्रिया के लिए दिखाई जानी चाहिए. डी नोवो लाइन-1 3 - ट्यूमर नमूना परख में transduction विभिन्न आकारों के पीसीआर उत्पादों के रूप में पता लगाने योग्य है, agarose जेल में देशी पीसीआर उत्पाद के साथ.

4. लाइन-1 3 के लिए लक्ष्य साइटों की पहचान प्रकट करने के लिए LDI-पीसीआर उत्पादों को अलग करना

  1. इन LINE-1 3 ] ट्रांसडक्शन घटनाओं के लक्ष्य एकीकरण साइटों की पहचान करने के लिए प्रत्येक LDI-PCR प्रतिक्रिया में उत्पन्न सभी PCR amplicons के एकल अणु लंबे समय से पढ़ा अनुक्रमण प्रदर्शन.
    नोट: LDI-पीसीआर उत्पादों की क्लोनिंग और Sanger अनुक्रमण भी एक संभव है, हालांकि बोझिल, दृष्टिकोण.
  2. मानक अनुक्रम संरेखण पाइपलाइनों का उपयोग कर संदर्भ जीनोम के लिए एकल अणु लंबे समय से पढ़ा अनुक्रमण प्लेटफार्मों द्वारा उत्पादित पढ़ता संरेखित करें। de नोवो LINE-1 सम्मिलन और उसके लक्ष्य साइट्स की पहचान करने के लिए LDI-PCR सॉफ़्टवेयर14 का उपयोग करके संरेखित पढ़ता का विश्लेषण करें.

Representative Results

TTC28-LINE-1 के मामले में, वहाँ एक से अधिक PAS है 1 kb खिड़की के भीतर अपने cognate PAS के बहाव, इसलिए TTC28-LINE-1 PAS और 811 बीपी डाउनस्ट्रीम पर सबसे मजबूत PAS के बीच क्षेत्र TTC28-LINE-1 के लिए अद्वितीय टैग के रूप में माना जाता था. तीन व्युत्क्रम पीसीआर प्राइमर जोड़े इस अनूठे टैग पर डिजाइन किए गए थे जो वर्तमान14विभिन्न PAS के अनुरूप थे . हमने तीन प्रतिबंध एंजाइमों का चयन किया है: (i) NsiI जो अद्वितीय टैग के बाहर TTC28-LINE-1 और 3 के ऊपर 5] में कटौती करता है, और (ii) सैकI और (iii) PstI कि लाइन-1 के भीतर 5 $ को अपने दूर 5 अंत में काट देता है, और 3 ] अद्वितीय टैग के बाहर। ये क्रमशः 10,288 बीपी, 5,699 बीपी, और 6,305 बीपी के प्रतिबंध टुकड़े उत्पन्न करते हैं।

इस विधि को प्रदर्शित करने के लिए, हमने MCF7 सेल लाइन से निकाले गए डीएनए पर LDI-पीसीआर का प्रदर्शन किया। इस स्तन कैंसर सेल लाइन पहले TTC28-LINE-1 गतिविधि16प्रदर्शित करने के लिए सूचित किया गया है. सादगी के लिए, हम एक प्रतिबंध एंजाइम का उपयोग कर एक परिपत्र डीएनए टेम्पलेट बनाया, Sacमैं, तीन में से एक LDI-PCR प्रदर्शन किया तीन में से एक प्राइमर जोड़ी का उपयोग कर (तालिका 1) de नोवो लाइन-1 प्रविष्टि TTC28से स्टेमका पता लगाने के लिए - लाइन-1.

MCF7 सेल लाइन से निकाले गए डीएनए की अच्छी गुणवत्ता agarose जेल इलेक्ट्रोफोरोसिस द्वारा सुनिश्चित किया गया था (चित्र 2) . बरकरार उच्च आणविक वजन डीएनए से पता चलता है कि जीनोमिक डीएनए इस परख के लिए इष्टतम गुणवत्ता का है. यदि इसके बजाय एक धब्बा दिखाई देता है, तो यह निकाले गए डीएनए की खराब गुणवत्ता को इंगित करता है, जो बदले में डाउनस्ट्रीम प्रक्रियाओं को बाधित करेगा।

चित्र 3 एक ढाल पीसीआर प्रयोग के एक प्रतिनिधि परिणाम से पता चलता है, TTC28-LINE-1 व्युत्क्रम प्राइमर जोड़ी के इष्टतम अनीलन तापमान का निर्धारण करने के उद्देश्य से. रक्त जीनोमिक डीएनए SacI के साथ पचा, एक परिपत्र डीएनए टेम्पलेट बनाने के लिए आत्म-लिगेशन के बाद, इस प्रतिक्रिया के लिए इस्तेमाल किया गया था। 62, 64 और 66 डिग्री सेल्सियस पर अपेक्षित आकार (5,649 बीपी) का एक अत्यधिक विशिष्ट पीसीआर उत्पाद यह दर्शाता है कि इस प्राइमर जोड़ी के लिए इष्टतम अनीलन तापमान 62 डिग्री सेल्सियस की सीमा के भीतर है।

हम Sacमैं प्रतिबंध एंजाइम आत्म-लिगेशन के बाद के साथ MCF7 जीनोमिक डीएनए पचाने के द्वारा एक परिपत्र डीएनए टेम्पलेट उत्पन्न. चित्र 4 से पता चलता है कि TTC28-LINE-1 3 - transduction MCF7 सेल लाइनों में होता है: de नोवो सम्मिलन ज्ञात आकार (5,649 bp) के एक देशी PCR उत्पाद के साथ अलग-अलग आकार के LDI-पीसीआर उत्पादों के रूप में पाया जा सकता है। डी नोवो लक्ष्य साइटों के जीनोमिक निर्देशांकों की पहचान करने के लिए, PCR amplicons अनुक्रम किया जा सकता है ( प्रोटोकॉल अनुभाग 4) देखें.

Figure 1
चित्र 1 : लाइन-1 3 का पता लगाने के लिए LDI-पीसीआर का अवलोकन 3 - transduction. एक परिपत्र डीएनए टेम्पलेट पहले पचाने (मैं) यह एक प्रतिबंध एंजाइम और स्वयं लिगिंग (द्वितीय) के साथ यह द्वारा उत्पन्न होता है. इस कदम के व्युत्क्रम पीसीआर (III) के साथ व्युत्क्रम पीसीआर प्राइमर ब्याज की लाइन-1 के अद्वितीय टैग करने के लिए लक्षित द्वारा पीछा किया जाता है (लाइन-1 के अपने कमजोर PAS के बीच अनुक्रम, गुलाबी में, और मजबूत PAS बहाव, लाल रंग में). कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2 : निकाले डीएनए की गुणवत्ता का आकलन. MCF7 सेल लाइन से निकाले गए डीएनए के 100 एनजी और एक सामान्य व्यक्ति से रक्त, जो एक नियंत्रण नमूने के रूप में इस्तेमाल किया जाएगा, 1 $L और 2 $L के साथ चला रहे थे $ डीएनए /

Figure 3
चित्र 3 : ढाल पीसीआर व्युत्क्रम पीसीआर प्राइमर (तालिका 1) के लिए इष्टतम अनीलन तापमान निर्धारित करने के लिए। एलडीआई-पीसीआर 56 से 66 डिग्री सेल्सियस तक के अनेलिंग तापमान पर व्युत्क्रम प्राइमर युग्मों का उपयोग करके 62 डिग्री सेल्सियस पर एक विशिष्ट पीसीआर उत्पाद दिखाता है। हरा तीर भविष्य के प्रयोगों के लिए चयनित अनीलन तापमान को इंगित करता है। साकमैं आत्म-लिगेशन के बाद के साथ एक सामान्य व्यक्ति से रक्त जीनोमिक डीएनए पचाने से उत्पन्न परिपत्र डीएनए टेम्पलेट इस अनुकूलन कदम के लिए इस्तेमाल किया गया था. एम, मार्कर (1 केबी प्लस डीएनए सीढ़ी). कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4 : एलडीआई-पीसीआर लाइन-1 3 की पहचान करने के लिए - transduction से स्टेमिंग टीटीसी28 -लाइन-1। परिपत्र डीएनए MCF7 और रक्त (सामान्य व्यक्ति से) Sacमैं के साथ जीनोमिक डीएनए के साथ जीनोमिक डीएनए द्वारा उत्पन्न टेम्पलेट्स इष्टतम अनीलन तापमान में व्युत्क्रम प्राइमर द्वारा परिलक्षित किया गया. "देशी" पीसीआर उत्पाद, तारांकन के साथ चिह्नित, अपेक्षित आकार (5,649 बीपी) दोनों MCF7 डीएनए और सामान्य रक्त डीएनए में पाया गया था, जबकि MCF7 भी अलग आकार के अतिरिक्त पीसीआर उत्पादों का उत्पादन किया, डे नोवो लाइन-1 retrotransposition का संकेत. एम, मार्कर (1 केबी डीएनए सीढ़ी). कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

प्राइमर नाम अनुक्रम (5 ] 3 ]
L1$001 (रेव) टीटीसीएक्टागकैटगटगगाआएसी
L1$002 (fwd) सीसीसीएएएएटीएटीकेएटीजीसीए

तालिका 1: उलटा पीसीआर प्राइमर जोड़ी के अद्वितीय टैग के लिए बनाया गया टीटीसी28 -लाइन-1 14 .

पूरक फ़ाइल. इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

Discussion

यहाँ हम एक विधि है कि de नोवो लाइन-1 प्रविष्टि ब्याज की किसी भी सक्रिय लाइन-1 से स्टेमकी पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है का वर्णन. हम एक अत्यधिक सक्रिय लाइन-1 के लिए इस विधि को अनुकूलित किया है, 22Q12.1 पर स्थित है, और पहले यह कोलोरेक्टल कैंसर14में उप क्लोनल प्रविष्टि का पता लगाने में अत्यधिक संवेदनशील होने का प्रदर्शन किया.

LDI-पीसीआर की सफलता जीनोमिक डीएनए की गुणवत्ता पर निर्भर करता है। इसलिए, हम एक अतिरिक्त गुणवत्ता नियंत्रण कदम शामिल है सुनिश्चित करने के लिए कि प्रोटोकॉल के शुरू में, उच्च आणविक वजन डीएनए मौजूद है (चरण 2.1.2). हम लंबी अवधि के भंडारण के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर जीनोमिक डीएनए भंडारण की सलाह देते हैं, और ठंड और thawing के चक्र से बचने के लिए alicots तैयार करने के लिए। रक्त या रोगी से मिलान सामान्य ऊतक से जीनोमिक डीएनए का उपयोग अत्यधिक एक germline या एक दैहिक घटना है कि क्या लाइन-1 retrotransposition का पता चला भेद करने के लिए सिफारिश की है। प्रतिबंध एंजाइमों के लिए कटौती साइटों जीनोम में stochastic हैं के बाद से, यह संभव है कि एक विशेष डी नोवो लाइन-1 प्रविष्टि साइट प्रतिबंध एंजाइम के लिए किसी भी कटौती साइटों बंदरगाह नहीं हो सकता है इसके आसपास के क्षेत्र में इस्तेमाल किया जा रहा है. इसलिए ट्यूमर डीएनए में डे नोवो लाइन-1 प्रविष्टि के बहुमत का पता लगाने की संभावना को बढ़ाने के लिए, एक से अधिक प्रतिबंध एंजाइम परिपत्र डीएनए टेम्पलेट के विभिन्न पुस्तकालयों उत्पन्न करने के लिए अलग प्रतिक्रियाओं में इस्तेमाल किया जाना चाहिए। इसके अलावा, अगर ब्याज की लाइन-1 की अनूठी टैग एक से अधिक PAS है, तो प्रत्येक PAS के निकट प्राइमर जोड़े का उपयोग कर भारी छोटा transductions का पता लगाने की संभावना में सुधार.

हालांकि डी नोवो लाइन-1 प्रविष्टि के जीनोम-वाइड डिटेक्शन के लिए सुरुचिपूर्ण तरीके मौजूद हैं, लेकिन यदि उद्देश्य एक विशिष्ट सेलुलर संदर्भ में एक विशेष लाइन-1 के रेट्रोट्रांसपोजिशन क्षमता की जांच करना है, तो वे भारी हो सकते हैं। इस उद्देश्य के लिए, LDI-पीसीआर लाइन-1 retrotransposition घटनाओं कल्पना करने के लिए एक सस्ती और सरल अभी तक मजबूत दृष्टिकोण हो सकता है. इस विधि में उपयोग किया गया लक्ष्यीकरण दृष्टिकोण TS-ATLAS22के समान है; हालांकि, LDI-PCR linker oligonucleotides का उपयोग करने से बचा जाता है और डी नोवो लाइन-1 प्रविष्टि के 5 ] और 3 जेड जंक्शनों को एक साथ बढ़ाना कर सकता है। लाइन-1 प्रविष्टि के 5 स और 3 जेड जंक्शनों, एकीकरण की लक्ष्य साइट, पॉलीए टेल और लक्ष्य-साइट संशोधनों के बारे में सूचना, जिनमें से सभी लाइन-1 रेट्रोट्रांसपोजिशन की पहचान हैं, एकल अणु के साथ एलडीआई-पीसीआर युग्मन द्वारा प्राप्त की जा सकती हैं। लंबे समय से पढ़ें अनुक्रमण प्रौद्योगिकियों. लंबे समय से इस प्रकार उत्पन्न पढ़ता डाला लाइन-1 अनुक्रम, अपने अद्वितीय टैग और एक एकल पढ़ने में लक्ष्य दृश्यों होते हैं, दोहराव क्षेत्र में कम पढ़ता मानचित्रण की कठिनाइयों को दरकिनार.

LINE-1 गतिविधि का पता लगाने के लिए LDI-PCR का उपयोग करने के लिए दो प्रमुख सीमाएँ हैं। पहले पीसीआर के लिए निहित है: यह केवल मज़बूती से आकार में 10 बीबी अप करने के लिए टुकड़े बढ़ाना कर सकते हैं. यह प्रतिबंध एंजाइम (ओं) का चयन करते समय विचार किया जाना चाहिए, के रूप में देशी टुकड़ा इस सीमा से अधिक नहीं होना चाहिए. दूसरे, यह विधि केवल प्रतिक्रमण की घटनाओं का पता लगा सकती है जो लाइन-1 के 3 क्षेत्र को 3 ज ट्रान्सक्वेशन द्वारा जुटाती हैं। इसलिए, उन LINE-1s की गतिविधि जो 3 - transduction का प्रदर्शन नहीं करते हैं, इस विधि का उपयोग करके पता नहीं लगाया जाएगा। इसके अतिरिक्त, LDI-PCR द्वारा प्रवर्धित होने के बावजूद, कुछ LINE-1 retrotransposition ईवेंट जो (a) समान आकार का PCR लक्ष्य "देशी" स्थान या अन्य retrotranspositions या (b) दुर्लभ या सबक्लोनल के रूप में जनरेट करते हैं, agarose जेल द्वारा नहीं पता लगाया जा सकता है वैद्युतकणसंचलन. इस तरह की लाइन-1 retrotransposition घटनाओं एकल अणु लंबे समय से पढ़ा अनुक्रमण प्रौद्योगिकियों14का उपयोग कर LDI-पीसीआर उत्पाद अनुक्रमण द्वारा कब्जा कर लिया जा सकता है।

यहाँ वर्णित वर्कफ़्लो आसानी से एक उपयुक्त प्रतिबंध एंजाइम का उपयोग करके और इन LINE-1s को लक्षित व्युत्क्रम प्राइमर डिजाइन करके अन्य "गर्म" LINE-1s की गतिविधि का पता लगाने के लिए संशोधित किया जा सकता है. लाइन-1 मध्यस्थता 3 ट्रांसडक्शन का पता लगाने के अलावा, इस विधि को कम बार लाइन-1मध्यस्थता 5 ] ट्रांसडक्ट 23 का पता लगाने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। इसी तरह की विधि सेल आधारित assays24 और कैंसर25में proviral एकीकरण साइटों में लाइन-1 पत्रकारों के एकीकरण साइट की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. लाइन-1 प्रविष्टि के अलावा, इस विधि का उपयोग अन्य जीनोमिक विपथनों का पता लगाने के लिए भी किया जा सकता है, जैसे कि डीएनए पुनर्व्यवस्था, जहां पुनर्व्यवस्था-प्रवण क्षेत्र के बारे में जानकारी पूर्व-अस्तित्व26है।

Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

हम लेख में हमारे सभी सह-लेखकों को धन्यवाद देना चाहूंगा जहां इस विधि को पहली बार14,विशेष रूप से तातियाना काजुसो, किमो Palin, Outi Kilpivaara और Esa Pitknen मूल्यवान विचार विमर्श के लिए वर्णित किया गया था, जबकि विधि विकसित करना. एल.के. फिनलैंड की अकादमी द्वारा वित्त पोषित है (संख्या 25996, 292789, 306026 और 314394), सिग्रिड Juselius फाउंडेशन, और फिनिश कैंसर सोसायटी. बी.पी. हेलसिंकी रिसर्च फाउंडेशन पीएचडी छात्रवृत्ति, एक फिनिश कैंसर सोसायटी शोध प्रबंध अनुदान के विश्वविद्यालय के प्राप्तकर्ता है, और Ida Montinin S [ti] से एक डॉक्टरेट अनुसंधान अनुदान. हम भी वीडियो उत्पादन के साथ हमें सहायता करने के लिए एल.के. के अनुसंधान समूह से Teemu Masalin (हेलसिंकी विश्वविद्यालय) और कुल श्रेष्ठ ामाल है.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 Kb DNA Ladder New England Biolabs N3232L
10 mM dNTP ThermoFisher Scientific 18427013
Acetic acid ThermoFisher Scientific 64-19-7 Used to make TAE buffer
Agarose BioNordika BN-50004
Blood sample (frozen) Blood sample from a healthy individual for control PCR
ChemiDoc XRS+ System Bio-rad 1708265
DNA Gel Loading Dye (6X) ThermoFisher Scientific R0611
DNeasy Blood & Tissue Kits Qiagen 69504
Ethidium Bromide Bio-rad 161-0433
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) ThermoFisher Scientific 25102-12-9 Used to make TAE buffer
FastDigest buffer ThermoFisher Scientific B64
FastDigest SacI ThermoFisher Scientific FD1133
Generuler 1 Kb plus DNA Ladder ThermoFisher Scientific SM1331
Generuler Lambda DNA/HindIII Marker, 2 ThermoFisher Scientific SM0103
Mini-Sub Cell GT Cell Bio-rad 1704406
Phusion Green Hot Start II High-Fidelity DNA Polymerase ThermoFisher Scientific F537L
PowerPac Basic Power Supply Bio-rad 1645050
Quantus Fluorometer Promega E6150
T4 DNA Ligase ThermoFisher Scientific EL0011
Tear-A-Way 96/8, 96 Well PCR Plate 4titude 4ti-0750/TA
Tris(hydroxymethyl)aminomethane ThermoFisher Scientific 77-86-1 Used to make TAE buffer
Veriti Thermal Cycler Applied Bioscience 4375786

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References

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कैंसर अनुसंधान अंक 149 पीसीआर व्युत्क्रम पीसीआर retrotransposons लाइन-1 retrotransposition संरचनात्मक भिन्नता कैंसर डीएनए मोबाइल डीएनए जीनोमिक्स
लंबी दूरी के व्युत्क्रम पीसीआर द्वारा हॉट लाइन-1s के रेट्रोट्रांसपोजिशन गतिविधि का पता लगाना
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Pradhan, B., Kauppi, L. Detection of Retrotransposition Activity of Hot LINE-1s by Long-Distance Inverse PCR. J. Vis. Exp. (149), e59880, doi:10.3791/59880 (2019).

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