Summary
Denna artikel beskriver en enkel PCR-baserad analys för att övervaka aktiviteten hos en aktiv linje-1 retrotransposon och mappa de Novo retrotranspositioner i en given arvsmassa. Med hjälp av MCF7 cellinjer, visar vi häri hur denna metod kan tillämpas för att upptäcka aktivitet av en linje-1 ligger på 22q 12.1.
Abstract
Långa interspersed nukleära element 1 (LINE-1s) är den enda familjen av rörliga genetiska element i det mänskliga genomet som kan röra sig självständigt. De gör det genom en process som kallas retroinförlivande vari de transkribera att bilda en mRNA mellanliggande som sedan infogas i genomet genom omvänd Transkription. Trots att vara tyst i normala celler, LINE-1s är mycket aktiva i olika epitelial tumörer. De Novo LINE-1 infogningar kan potentiellt köra tumorigenesis, och därför är det viktigt att systematiskt studera LINE-1 retroinförlivande i cancer. Av ~ 150 retroinförlivande-behöriga LINE-1s finns i den mänskliga arvsmassan, endast en handfull linje-1 loci, även kallad "hot" LINE-1s, står för majoriteten av de Novo Line-1 insättning i olika cancertyper. Vi har utvecklat en enkel polymeras kedjereaktion (PCR)-baserad metod för att övervaka retrotransponering aktivitet av dessa hot line-1s. Denna metod, baserad på långdistans invertering (LDI)-PCR, utnyttjar 3 ́ transduktion, en mekanism genom vilken en linje-1 mobiliserar sin kompletterande icke upprepande region, som senare kan användas för att identifiera de Novo LINE-1 3 ́ transduktionhändelser som härrör från en viss het linje-1.
Introduction
Långa interspersed nukleära element (LINE-1s) är en familj av rörliga genetiska element som kallas retrotransposons som självständigt kan flytta från en plats till en annan via en kopia och klistra mekanism som kallas retroinförlivande. Under evolutions tiden har det mänskliga genomet ackumulerat mer än 500 000 exemplar av linje 1 upprepar1. De flesta av de rad 1-exemplar som förekommer i arvsmassan är dock muterade och kan därför inte röra sig genom retroinförlivande. endast ~ 150 kopior har intakt kopia av DNA-sekvens som krävs för dem att flytta2. I normala somatiska celler begränsas rörligheten för dessa linje-1s av olika värd faktorer3. Dessa restriktioner är lättade i olika epitelial tumörer, orsakar LINE-1s att vara derepressed och resulterar i många de Novo infogningar i tumören Genome4. Några av dessa tumör-associerade de Novo infogningar har visat sig orsaka insertionsmutationer mutagenes i gener, därav drivande tumör progression5,6. Därför är det viktigt att kunna kartlägga nya införanden i tumörgenomet.
Befintliga metoder för att detektera de Novo Line-1 infogningar Använd (1) helgenomsekvensering metod4,7,8, där olika beräkningsalgoritmer används för att hitta de Novo Line-1 infogningar från WGS data, eller (2) nästa generations sekvensering som riktar sig till 3 ́ slutet av unga, potentiellt aktiva linje-1s9,10,11,12,13. Men att hitta nya infogningar bland flera tusen nästan identiska kopior med dessa metoder är långt ifrån trivialt, och utmaningen förvärras ytterligare av tumörheterogenitet och genomiska förändringar i samband med LINE-1 insättning4.
Studier med dessa befintliga metoder visade att bara ett fåtal line-1s-konto för majoriteten av de Novo Line-1 infogningar observerats i tumörer7,8. Därför, för att besvara om en viss tumör prov visar LINE-1 aktivitet, räcker det att kartlägga retroinförlivande händelser som orsakats av denna handfull mycket aktiva linje-1 loci. I denna artikel beskriver vi en enkel polymeras kedjereaktion (PCR)-baserad metod14 som kan användas för att övervaka aktiviteten hos en viss linje-1 Locus i den första intron av TTC28 genen på 22q 12.1 som är mycket aktiv i kolorektal cancer 7 , 8. denna linje-1 Locus kommer att kallas TTC28-Line-1 i hela artikeln. Denna analys identifierar särskilt de Novo Line-1 retrotransponeringshändelser som mobiliserar icke-repetitiv sekvens på 3 ́ flanerande regionen av käll linjen-1 med en mekanism som kallas 3 ́ transduktion15. 3 ́ transduktion sker på grund av den svaga linjen-1 polyadenylation signal (PAS) som gör att transkriptionella maskiner att hoppa över den och att i stället avsluta transkription på de starkare PAS nedströms, vilket fångar den kompletterande icke-repetitiva sekvens ( hädanefter kallad "unik tagg") som sedan infogas i målplatsen vid sidan av linje-1-sekvensen. Philippe et al.16 visade nyligen att olika celltyper kan uttrycka olika linje-1 loci. Mot bakgrund av detta konstaterande, denna metod kan tillämpas för att övervaka aktiviteten av de mest uttalade linje-1 som mobiliserar sin unika tagg i cancertyp av intresse.
Det första steget i LDI-PCR är nedbrytning av genomiskt DNA med ett begränsnings enzym som genererar ett begränsnings fragment som innehåller linje 1 som analyseras (här, TTC28-Line-1) och dess unika etikett (figur 1). Smält DNA är sedan cirkulariserad av själv-ligation och PCR förstärks med omvänd primers ligger inom den unika taggen. På så sätt, den full-length källa linje-1 på dess "infödda" plats är alltid förstärks och vid sidan av det, avkomma linje-1 infogningar på olika mål loci innehåller den unika taggen kommer också att förstärkas (figur 1), vilket rapporterar retroaktiv införlivande av linje 1 i fråga.
Protocol
Denna forskning godkändes av den institutionella prövnings nämnden och etikkommittén vid Helsingfors universitetssjukhus. Ett undertecknat informerat samtycke erhölls från ämnet för det blodprov som användes för att demonstrera detta protokoll.
1. designa inversa primers och välja restriktionsenzymer (bioinformatik)
- Fastställa en rad-1-associerad unik tagg
- Ladda ner TTC28-Line-1 sekvens i fasta format från en linje-1 databas som L1Base17. L1base-ID för TTC28-Line-1 är 135.
- Inkludera 5 KB-sekvens med båda 5 ́-och 3-ändarna i linje-1-sekvensen och anteckna i en ordbehandlare.
Anmärkningar: här är linje-1 kompletterande sekvens kommenterade i brunt typsnitt, och linje-1 sekvens är i grått typsnitt (kompletterande fil). - Ange 1 KB sekvens nedströms av valda line-1s besläktat pas i en Pas förutsägelse verktyg som polyadq18 eller Dragon Polya spotter19 och kommentera alla polyadenylation signalen i denna 1 KB fönster.
Anmärkning: om det finns inga PAS i fönstret 1 KB, söka efter PAS i nästa 1 KB fönster nedströms. TTC28-line-1s egna svaga Pas är markerad i rosa och alla andra pas i 1 KB fönster nedströms är markerad i rött (kompletterande fil). - Kommentera sekvensen mellan slutet av rad-1: s besläktat Pas och de starkaste Pas nedströms som "unik tagg".
Obs: den "unika taggen" av TTC28-Line-1 är markerad i gult (kompletterande fil).
- Designa inverterade primers
- Designa omvända PCR-primers genom att ange sekvensen "Unique tag" i ett webbaserat primer-Formgivningsverktyg som primer 3 (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/) eller NCBIS primer-BLAST (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/). Eftersom primer-par designade av dessa verktyg möter varandra underlätta konventionell PCR, Använd funktionen Reverse-komplement för primerparet för att utföra omvänd PCR.
Anmärkning: eftersom linje-1-transduktioner är kraftigt trunkerade vid deras 5 ́ och storleken på den omvandliga regionen är mycket varierande, syftar till att hålla avståndet mellan de två inversa primers minimal, genom att ställa in PCR produkt längd parameter i NCBI primer-BLAST till Minsta. När det gäller flera utbetalande organen inom den unika taggen, designa flera primer par som motsvarar olika PASs. Design primers nära PAS, som linje-1 infogningar initiera från 3 ́slutet av RNA-intermediären och 5 ́ slutet är omväxlande trunkeras. Här tre primer par utformades, betonade i Teal och grönt, motsvarande tre starka polyadenylation signaler i den unika taggen TTC28 Line-1 (kompletterande fil).
- Designa omvända PCR-primers genom att ange sekvensen "Unique tag" i ett webbaserat primer-Formgivningsverktyg som primer 3 (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/) eller NCBIS primer-BLAST (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/). Eftersom primer-par designade av dessa verktyg möter varandra underlätta konventionell PCR, Använd funktionen Reverse-komplement för primerparet för att utföra omvänd PCR.
- Välja restriktionsenzymer
- Smälta LINE-1 sekvens tillsammans med dess 5 KB uppströms och nedströms flanker i silico med hjälp av webbaserade verktyg som RestrictionMapper. Detta kommer att ge en omfattande lista över restriktionsenzymer som smälter denna region och genererar olika restriktionfragment.
- Välj restriktionsenzymer som skär de infödda Locus av linje-1 enligt följande: vid 5 ́-änden, antingen uppströms linjen-1 ́s 5 ́End eller långt 5 ́End of the LINE-1 själv, och vid 3 ́-änden, nedströms linjen-1s unika tagg.
Anmärkning: den valda restriktionsenzymen bör vara okänslig för DNA-metylering, bör värmeinactivatable, och bör generera staggerade "klibbiga" ändar som kompletterar varandra. För att demonstrera LDI-PCR används SACi Restriction-enzymet som KLIPPER av DNA på gagctc-platser, som belyses här i ljusgrön, (tilläggsfil). - Ta del av begränsningen fragment storlek som gjorts av valda restriktionsenzymer. Detta bör inte vara längre än 12 kB eftersom det inte kan vara effektivt förstärks av PCR.
2. göra cirkulära DNA-mallar för långdistans omvänd PCR
- DNA-extraktion och kvalitetsbedömning
- Extrahera genomiskt DNA från prover (tumör eller blod) med hjälp av kommersiellt tillgängliga DNA-extraktionssatser som kan extrahera god kvalitet, hög molekylvikt DNA som krävs för LDI-PCR enligt tillverkarens anvisningar. Alternativt kan hög molekylvikt DNA också extraheras genom fenol: kloroform20.
- Mät DNA-koncentrationen med hjälp av en fluorometer enligt tillverkarens anvisningar och kör 100 ng av DNA på 1% (w/v) aguppkom gel som innehåller etidiumbromid (0,5 μg/mL) i 1x Tris-acetat-EDTA (TAE) buffert vid 4,5 V/cm21 tillsammans med λ-HindIII DNA molekylvikt markörer för att kontrollera DNA-kvalitet och kvantitet.
- Smälta genomiskt DNA
- Gör en blandning av nedbrytnings reaktion (slutlig volym på 50 μL) genom att tillsätta 20 enheter SACI-restriktionsenzymer, 5 μl 10X reaktionsbuffert (tabell över material), 100 ng av DNA (upp till 44 μl) i ett 0,2 ml PCR-rör på is (1 μl begränsnings enzym från de flesta s tillräckligt för att helt smälta 100 ng av genomiskt DNA). Blanda lösningen genom att snärta röret, och centrifugera kort.
- Använd en termisk apparat för att Inkubera reaktionsblandningen vid 37 ° c i 1 h, följt av Värmeinaktivering vid 65 ° c i 5 min.
- Själv-ligating smält genomiskt DNA
- Till 50 μl digestionsblandning (efter steg 2.2.2), tillsätt 8 μl 10X T4 DNA ligasbuffert, 1 μl (5 enheter) av T4 DNA Ligase och 21 μl ultrarent vatten för att göra en slutlig reaktions volym på 80 μl. Blanda lösningen genom att snärta rören och centrifugera kort.
- Inkubera i en termisk cyklare vid 22 ° c i 10 minuter, och avsluta med ett värme inaktiverings steg vid 65 ° c i 10 minuter.
3. inverterad PCR med långdistans
- Bestämning av primerglödgningstemperatur med gradient PCR
- Ställ in en glödgningstemperaturgradient på (A-4) ° c, (A-2) ° c, A, (A + 2) ° c, (A + 4) ° c där A är den teoretiska glödgningstemperaturen för primerparet beräknat med hjälp av den kommersiella leverantörens webbaserade verktyg.
Obs: termisk cyclers från vissa tillverkare kan inte tillåta inställning av temperaturgradienten manuellt. I så fall kan den automatiska övertoningsinställningen användas med ett temperaturintervall på (A-4) ° c till (A + 4) ° c. - Förbered en Mastermix för PCR genom att kombinera och blanda följande komponenter i ett 1,5 mL microcentrifugerör: 4 μL 5x reaktionsbuffert, 0,4 μL 10 mM dNTP, 5 μL 2 μM PCR-primer (framåt och bakåt, designad i steg 1.3.1) , 0,2 μL (0,1 U) DNA-polymeras per reaktion. Ställ in en reaktion för varje glödgnings temperatur i gradienten.
- För varje reaktion, alikvot 19 μL av Mastermixen i 0,2 mL PCR-rör och tillsätt 1 μL (1,25 ng) av cirkulär DNA-mall som framställs i avsnitt 2.
Anmärkning: Använd cirkulärt själv-ligated DNA som genereras från normalt blod-DNA som mall för att undvika att konsumera potentiellt dyrbara tumör-DNA för detta optimerings steg. - Kör gradient PCR program på en termisk apparat som beskrivs nedan: i) en cykel på 3 min vid 98 ° c (denaturering); II) 35 cykler av (10 s vid 98 ° c [denaturering], 20 s vid temperaturgradienten för [A-4] till [A + 4] ° c [glödgning] och 1 − 6 min [30 s per kilobase förväntad PCR-produkt] vid 72 ° c [förlängning]). III) en cykel på 10 min vid 72 ° c (slutlig förlängning).
- Kör 6 μL av PCR-produkten i 1% aguppstod gel21 beredd i 1x Tae buffert på 4,5 V/cm och analysera PCR-produkter som genereras vid olika glödgning temperaturer.
- Välj glödgningstemperaturen som ger en PCR-produkt som motsvarar den förväntade storleken.
- Ställ in en glödgningstemperaturgradient på (A-4) ° c, (A-2) ° c, A, (A + 2) ° c, (A + 4) ° c där A är den teoretiska glödgningstemperaturen för primerparet beräknat med hjälp av den kommersiella leverantörens webbaserade verktyg.
- Upptäcka de Novo Line-1 retroinförlivande aktivitet i tumörgenomet
- Utför LDI-PCR med det inverterade PCR-primerparet på cirkulära DNA-mallar genererade från tumörprover (avsnitt 2). Följ samma instruktioner som för gradient PCR (avsnitt 3,1), men denna gång ersätter temperaturgradienten med optimal glödgnings temperatur.
- Analysera PCR-produkterna genom aguppstod gel elektrofores som görs i steg 3.1.5. PCR-produkt av känd storlek eller "Native" PCR-produkt som motsvarar linje-1 vid dess infödda Locus bör vara synlig för varje reaktion. De Novo LINE-1 3-transduktion i tumörprovet som analyseras är detekterbart som PCR-produkter av olika storlekar, tillsammans med den ursprungliga PCR-produkten i agaros-gelen.
4. sekvensering av LDI-PCR-produkter för att avslöja identiteten på målplatser för linje-1 3-transduktion
- Utför en molekyl för lång läsning av alla PCR-amplikoner som genereras i varje LDI-PCR-reaktion för att identifiera mål integrations platserna för dessa LINE-1 3-transduktionshändelser.
Anmärkning: kloning och Sanger-sekvensering av LDI-PCR-produkter är också en möjlig, om än besvärlig, metod. - Justera läsningar som produceras av en molekyl lång Läs sekvensering plattformar till referensgenomet med hjälp av standard sekvens justering pipelines. Analysera de justerade läsningar som använder LDI-PCR-programvara14 för att identifiera de Novo Line-1-infogningar och dess målwebbplatser.
Representative Results
I händelse av TTC28-Line-1, det finns mer än ett Pas inom en 1 KB fönster nedströms dess besläktat Pas, därav regionen mellan TTC28-Line-1 Pas och starkaste Pas vid 811 BP nedströms ansågs vara den unika taggen för TTC28-Line-1. Tre inverterade PCR primer-par utformades vid denna unika tagg som motsvarar olika PASs nuvarande14. Vi valde ut tre restriktionsenzymer: (i) NSIi som klipper 5 ́ uppströms TTC28-Line-1 och 3 ́ utanför den unika taggen, och (II) SACi och (III) PSTi som klipper 5 ́ inom linjen-1 i dess långt 5 ́ ände och 3 ́ utanför den unika taggen. Dessa genererar restriktionfragment av 10 288 BP, 5 699 BP och 6 305 BP respektive.
För att demonstrera denna metod utförde vi LDI-PCR på DNA som extraherades från MCF7 cellinjer. Denna bröstcancer cellinjer har tidigare rapporterats att visa TTC28-Line-1 aktivitet16. För enkelhetens skull gjorde vi en cirkulär DNA-mall med ett begränsnings enzym, SACi, av tre och utförde en LDI-PCR med ett primer-par av tre (tabell 1) för att detektera de Novo Line-1-införanden som härrör från TTC28- LINE-1.
God kvalitet på DNA som utvinns ur MCF7 cellinjer säkerställdes av agaros gel elektrofores (figur 2). Intakt hög molekylvikt DNA visar att genomiskt DNA är av optimal kvalitet för denna analys. Om ett utstryk syns i stället, detta indikerar dålig kvalitet på den extraherade DNA, vilket i sin tur kommer att hämma nedströms förfaranden.
Figur 3 visar ett representativt resultat av en gradient PCR experiment, som syftar till att fastställa den optimala glödgning temperatur TTC28-Line-1 omvänd primer par. Blod genomisk DNA smälts med SACjag, följt av själv-ligation att bilda en cirkulär DNA-mall, användes för denna reaktion. En mycket specifik PCR-produkt av förväntad storlek (5 649 BP) vid 62, 64 och 66 ° c visar att den optimala glödgningstemperaturen för detta primerpar ligger inom intervallet 62 − 66 ° c.
Vi genererade en cirkulär DNA-mall genom att smälta MCF7 genomiskt DNA med SACi begränsning enzym följt av själv-ligation. Figur 4 visar att TTC28-Line-1 3-TRANSDUKTION sker i MCF7 cellinjer: de Novo -INFOGNINGAR kan upptäckas som LDI-PCR-produkter av varierande storlek tillsammans med en ursprunglig PCR-produkt av kända storlekar (5 649 BP). För att identifiera genomiska koordinater för de Novo -målplatserna kan PCR-amplikoner sekvenseras (se protokoll avsnitt 4).
Figur 1 : Översikt över LDI-PCR för att detektera linje-1 3 ́ transduktion. En cirkulär DNA-mall genereras av första smälta (I) det med ett begränsnings enzym och själv-ligating (II) det. Detta steg följs av inverterad PCR (III) med inverterade PCR-primers riktade till den unika taggen för linje-1 av intresse (sekvens mellan LINE-1s egna svagare PAS, i rosa och starkare PAS nedströms, i rött). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Kvalitetsbedömning av extraherat DNA. 100 ng av DNA som utvinns ur MCF7 cellinjer och blod från en normal individ, som kommer att användas som kontrollprov, kördes tillsammans med 1 μL och 2 μL λ DNA/HindIII-markör märkt som M. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Gradient PCR för att fastställa optimal glödgnings temperatur för INVERTERADE PCR-primers (tabell 1). LDI-PCR med inverterade primer-par vid glödgnings temperatur mellan 56 och 66 ° c visar en distinkt PCR-produkt vid 62 − 66 ° c. Grön pil anger den valda glödgningstemperaturen för framtida experiment. Cirkulär DNA-mall som genereras genom att smälta blodet genomiskt DNA från en normal individ med SACjag följt av själv-ligation användes för detta optimerings steg. M, markör (1 KB plus DNA-stege). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 : LDI-PCR för att identifiera linje-1 3-transduktion som härrör från TTC28 -Line-1. Cirkulära DNA-mallar som genereras genom att smälta MCF7 och blod (från normal individ) genomiskt DNA med SACjag följt av själv-ligation förstärkallades av inverterade primers i optimal glödgnings temperatur. "Native" PCR-produkt, märkt med asterisk, av förväntad storlek (5 649 BP) upptäcktes i både MCF7 DNA och normala blod-DNA, medan MCF7 också producerat ytterligare PCR-produkter av varierande storlek, vilket indikerar de Novo Line-1 retroinförlivande. M, markör (1 KB DNA-stege). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Namn på primer | Sekvens (5 ́ → 3 ́) |
| L1_001 (rev) | TTCACTAAGCATGTATGTGGAAAAC |
| L1_002 (FWD) | CCCAAAATATACCCAATTACTGGCA |
Tabell 1: INVERTERAT PCR-primer-par som utformats för den unika taggen TTC28 -Line-1 fjorton .
Kompletterande fil. Vänligen klicka här för att ladda ner denna fil.
Discussion
Här beskriver vi en metod som kan användas för att identifiera de Novo Line-1 infogningar som härrör från någon aktiv linje-1 av intresse. Vi har optimerat denna metod för en mycket aktiv linje-1, som ligger på 22q 12.1, och tidigare visat att det är mycket känsliga för att upptäcka sub-klonala införanden i kolorektal cancer14.
Framgången för LDI-PCR beror på kvaliteten på genomiskt DNA. Därför har vi inkluderat ett ytterligare kvalitetskontroll steg för att se till att högmolekylära DNA är närvarande i början av protokollet (steg 2.1.2). Vi rekommenderar att du lagrar genomiskt DNA vid-20 ° c för långtidsförvaring och för att förbereda alikvoter för att undvika cykler av frysning och upptinning. Att använda genomiskt DNA från blod eller patientmatchad normal vävnad rekommenderas starkt för att skilja om det upptäckta retroinförlivandet av linje 1 är en köns cells eller en somatisk händelse. Eftersom snitt platser för restriktionsenzymer är stokastiska i arvsmassan, är det möjligt att en särskild de Novo Line-1 insättnings plats inte kan hysa några snitt platser för det begränsnings enzym som används i dess närhet. Därför att öka sannolikheten för att upptäcka majoriteten av de Novo Line-1 införanden i tumör DNA, mer än ett begränsnings enzym bör användas i separata reaktioner för att generera olika bibliotek av cirkulär DNA-mall. Dessutom, om den unika taggen för linje-1 av intresse har mer än en PAS, sedan använda primer par intill varje PAS förbättrar chanserna att upptäcka kraftigt stympade transduktioner.
Även om eleganta metoder för genomomfattande detektion av de Novo Line-1 infogningar finns, kan de vara överväldigande om syftet är att söka retroinförlivande kompetensen hos en viss linje-1 i ett specifikt cellulära sammanhang. För detta ändamål, LDI-PCR kan vara en billig och enkel men robust metod för att visualisera LINE-1 retroinförlivande händelser. Inriktningsmetoden som används i den här metoden liknar TS-ATLAS22. LDI-PCR undviker dock att använda länkare oligonukleotides och kan förstärka både 5 ́ och 3 ́ korsningar av de Novo Line-1 insättning samtidigt. Information om både 5 ́ och 3 ' korsningar av linje-1 insättning, målplatsen för integration, polyA svans och mål-platsmodifieringar, som alla är kännetecken för LINE-1 retroinförlivande, kan erhållas genom att koppla LDI-PCR med enmolekyl långlästa sekvenseringstekniker. Långa läsningar genereras således innehålla den infogade LINE-1 sekvens, dess unika tagg och målsekvenser i en enda läsa, kringgå svårigheter att kartlägga korta läsningar i repetitiva regionen.
Det finns två stora begränsningar för att använda LDI-PCR för detektion av linje 1-aktivitet. Den första är inneboende i PCR: det kan bara tillförlitligt förstärka fragment upp till 10 kB i storlek. Detta bör övervägas vid val av begränsnings enzym (er), eftersom det ursprungliga fragmentet inte bör överskrida denna gräns. För det andra kan denna metod bara upptäcka retrotransponering händelser som mobiliserar linje-1s 3 ́ kompletterande region med 3 ́ transduktioner. Därför kommer aktiviteten hos de linje-1s som inte uppvisar 3 ́ transduktion inte att upptäckas med den här metoden. Dessutom, trots att de förstärks av LDI-PCR, kan vissa retrotransponeringshändelser i rad 1 som (a) genererar ett PCR-mål av liknande storlek som den "infödda" platsen eller andra retrotranspositioner eller (b) är sällsynta eller subklonala, inte upptäckas av aguppstod gel Elektrofores. Sådana händelser med retroinförlivande i linje 1 kan fångas upp genom sekvensering av LDI-PCR-produkten med hjälp av en enda molekyl med lång läsning av sekvenseringstekniker14.
Arbetsflödet som beskrivs här kan enkelt ändras för att upptäcka aktiviteten hos andra "heta" LINE-1s genom att använda ett lämpligt begränsnings enzym och genom att designa inverterade primers som riktar sig mot dessa linje-1s. Förutom detektion av linje 1-medierad 3 ́ transduktion kan denna metod anpassas för att detektera mindre frekventa linje 1-medierade 5-transduktioner23. Liknande metod har använts för att identifiera integration platsen för LINE-1 reportrar i cell-baserade analyser24 och proviral integration platser i cancer25. Förutom LINE-1 infogningar, kan denna metod också utnyttjas för att upptäcka andra genomiska avvikelser, såsom DNA-omordningar, där information om omorganiseringar-benägna regionen redan finns26.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi vill tacka alla våra medförfattare i artikeln där denna metod först beskrevs14, särskilt Tatiana Cajuso, Kimmo Palin, Outi Kilpivaara och ESA Pitkänen för värdefulla diskussioner och samtidigt utveckla metoden. L.K. finansieras av Finlands Akademi (bidrags nummer 25996, 292789, 306026 och 314394), Sigrid Juselius-stiftelsen och finska cancer fonden. B.P. är mottagare av Helsingfors universitets forsknings Stiftelses doktorandtjänst, ett Finlands cancer samhälles disputations stipendium och ett forskarstipendium från Ida Montinin Säätiö. Vi tackar också Teemu Masalin (Helsingfors universitet) och kul Shrestha från L.K. forskargrupp för att assistera oss med videoproduktion.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 Kb DNA Ladder | New England Biolabs | N3232L | |
| 10 mM dNTP | ThermoFisher Scientific | 18427013 | |
| Acetic acid | ThermoFisher Scientific | 64-19-7 | Used to make TAE buffer |
| Agarose | BioNordika | BN-50004 | |
| Blood sample (frozen) | Blood sample from a healthy individual for control PCR | ||
| ChemiDoc XRS+ System | Bio-rad | 1708265 | |
| DNA Gel Loading Dye (6X) | ThermoFisher Scientific | R0611 | |
| DNeasy Blood & Tissue Kits | Qiagen | 69504 | |
| Ethidium Bromide | Bio-rad | 161-0433 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | ThermoFisher Scientific | 25102-12-9 | Used to make TAE buffer |
| FastDigest buffer | ThermoFisher Scientific | B64 | |
| FastDigest SacI | ThermoFisher Scientific | FD1133 | |
| Generuler 1 Kb plus DNA Ladder | ThermoFisher Scientific | SM1331 | |
| Generuler Lambda DNA/HindIII Marker, 2 | ThermoFisher Scientific | SM0103 | |
| Mini-Sub Cell GT Cell | Bio-rad | 1704406 | |
| Phusion Green Hot Start II High-Fidelity DNA Polymerase | ThermoFisher Scientific | F537L | |
| PowerPac Basic Power Supply | Bio-rad | 1645050 | |
| Quantus Fluorometer | Promega | E6150 | |
| T4 DNA Ligase | ThermoFisher Scientific | EL0011 | |
| Tear-A-Way 96/8, 96 Well PCR Plate | 4titude | 4ti-0750/TA | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | ThermoFisher Scientific | 77-86-1 | Used to make TAE buffer |
| Veriti Thermal Cycler | Applied Bioscience | 4375786 |
References
- Lander, E. S., et al. Initial sequencing and analysis of the human genome. Nature. 409 (6822), 860-921 (2001).
- Brouha, B., et al. Hot LINE-1s account for the bulk of retrotransposition in the human population. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (9), 5280-5285 (2003).
- Goodier, J. L.
- Lee, E., et al. Landscape of somatic retrotransposition in human cancers. Science. 337 (6097), 967-971 (2012).
- Miki, Y., et al. Disruption of the APC gene by a retrotransposal insertion of L1 sequence in a colon cancer. Cancer Research. 52 (3), 643-645 (1992).
- Scott, E. C., et al. A hot L1 retrotransposon evades somatic repression and initiates human colorectal cancer. Genome Research. 26 (6), 745-755 (2016).
- Pitkanen, E., et al. Frequent L1 retrotranspositions originating from TTC28 in colorectal cancer. Oncotarget. 5 (3), 853-859 (2014).
- Tubio, J. M., et al. Mobile DNA in cancer. Extensive transduction of nonrepetitive DNA mediated by L1 retrotransposition in cancer genomes. Science. 345 (6196), 1251343 (2014).
- Badge, R. M., Alisch, R. S., Moran, J. V. ATLAS: a system to selectively identify human-specific L1 insertions. American Journal of Human Genetics. 72 (4), 823-838 (2003).
- Rodic, N., et al. Retrotransposon insertions in the clonal evolution of pancreatic ductal adenocarcinoma. Nature Medicine. 21 (9), 1060-1064 (2015).
- Ewing, A. D., Kazazian, H. H. Jr High-throughput sequencing reveals extensive variation in human-specific L1 content in individual human genomes. Genome Research. 20 (9), 1262-1270 (2010).
- Sanchez-Luque, F. J., Richardson, S. R., Faulkner, G. J. Retrotransposon Capture Sequencing (RC-Seq): A Targeted, High-Throughput Approach to Resolve Somatic L1 Retrotransposition in Humans. Methods in Molecular Biology. 1400, 47-77 (2016).
- Zhao, B., et al. Somatic LINE-1 retrotransposition in cortical neurons and non-brain tissues of Rett patients and healthy individuals. PLOS Genetics. 15 (4), e1008043 (2019).
- Pradhan, B., et al. Detection of subclonal L1 transductions in colorectal cancer by long-distance inverse-PCR and Nanopore sequencing. Scientific Reports. 7 (1), 14521 (2017).
- Moran, J. V., DeBerardinis, R. J., Kazazian, H. H. Jr Exon shuffling by L1 retrotransposition. Science. 283 (5407), 1530-1534 (1999).
- Philippe, C., et al. Activation of individual L1 retrotransposon instances is restricted to cell-type dependent permissive loci. Elife. 5, (2016).
- Penzkofer, T., et al. L1Base 2: more retrotransposition-active LINE-1s, more mammalian genomes. Nucleic Acids Research. 45 (D1), D68-D73 (2017).
- Tabaska, J. E., Zhang, M. Q. Detection of polyadenylation signals in human DNA sequences. Gene. 231 (1-2), 77-86 (1999).
- Kalkatawi, M., et al. Dragon PolyA Spotter: predictor of poly(A) motifs within human genomic DNA sequences. Bioinformatics. 29 (11), 1484 (2013).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Purification of nucleic acids by extraction with phenol:chloroform. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), (2006).
- Green, M. R., Sambrook, J.
- Macfarlane, C. M., et al. Transduction-specific ATLAS reveals a cohort of highly active L1 retrotransposons in human populations. Human Mutation. 34 (7), 974-985 (2013).
- Beck, C. R., Garcia-Perez, J. L., Badge, R. M., Moran, J. V. LINE-1 elements in structural variation and disease. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 12, 187-215 (2011).
- Morrish, T. A., et al. DNA repair mediated by endonuclease-independent LINE-1 retrotransposition. Nature Genetics. 31 (2), 159-165 (2002).
- Li, J., et al. Leukaemia disease genes: large-scale cloning and pathway predictions. Nature Genetics. 23 (3), 348-353 (1999).
- Pradhan, B., et al. Detection and screening of chromosomal rearrangements in uterine leiomyomas by long-distance inverse PCR. Genes, Chromosomes and Cancer. 55 (3), 215-226 (2016).
