Summary
Este trabajo describe un método robusto y sencillo para detectar y cuantificar el endocannabinoide 2-arachidonoylglycerol (2-AG) en C. elegans. Un estándar analítico deuterado nos preparó y utilizó para la cuantificación de 2-AG por dilución isotópica y cromatografía líquida-electrospray ionización-espectrometría de masas tándem (LC-ESI-MS/MS).
Abstract
Este trabajo presenta un método para preparar un estándar analítico para analizar 2-arachidonoyl glicerol (2-AG) cualitativa y cuantitativamente mediante cromatografía líquida-electrospray ionización-espectrometría de masas tándem (LC-ESI-MS/MS). Los endocannabinoides son mediadores de lípidos conservados que regulan múltiples procesos biológicos en una variedad de organismos. En C. elegans,2-AG se ha encontrado que poseen diferentes funciones, incluyendo la modulación de la formación de dauer y el metabolismo del colesterol. Este informe describe un método para superar las dificultades asociadas con los costos y la estabilidad de las normas deuteradas necesarias para la cuantificación de 2 AG. El procedimiento para la síntesis de la norma es simple y se puede realizar en cualquier laboratorio, sin necesidad de experiencia en síntesis orgánica o equipo especial. Además, se describe una modificación del método de Folch para extraer el estándar deuterated de la cultura C. elegans. Por último, se describe un método cuantitativo y analítico para detectar 2-AG utilizando el análogo 1-AG-d5 etiquetado isotópicamente estable, que proporciona resultados fiables en una ejecución cromatográfica rápida. El procedimiento es útil para estudiar las múltiples funciones de 2-AG en C. elegans mientras que también es aplicable a otros estudios de metabolitos en diferentes organismos.
Introduction
Los endocannabinoides regulan múltiples procesos biológicos en una variedad de organismos y se conservan mediadores de lípidos1. Los primeros endocannabinoides descubiertos y más bien caracterizados son anandamida (arachidonoylethanolamida, AEA) y 2-arachidonoyl glicerol (2-AG). Los endocannabinoides juegan muchos papeles críticos, incluyendo los involucrados en los sistemas de recompensa cerebral, así como la adicción a las drogas, memoria, estado de ánimo, y procesos metabólicos2. AEA y 2-AG sólo se sintetizan cuando es necesario y tienen una vida útil corta, y se degradan a través de la retoma de proteínas de transporte y la hidrólisis3.
El uso de modelos animales como Caenorhabditis elegans (C. elegans) se ha convertido en importante para estudiar la gran variedad de procesos biológicos incluyendo apoptosis, señalización celular, ciclo celular, polaridad celular, regulación genética, metabolismo, envejecimiento, y determinación del sexo4,5. Además, C. elegans es un excelente modelo para estudiar las funciones fisiológicas de los ácidos grasos poliinsaturados (PUFA). AEA se ha identificado en C. elegans y se reduce bajo restricción dietética6. Esta deficiencia extiende la vida útil del nematodo a través de un mecanismo de restricción dietética que puede ser suprimido por la suplementación con el endocannabinoide. Recientemente, se descubrió que 2-AG y AEA desempeñan un papel fundamental en la regulación del tráfico de colesterol en C. elegans7. Más importante aún, se determinó que la suplementación con 2-AG exógeno puede rescatar el arresto de Dauer, que es causado por el deterioro del tráfico de colesterol en Niemann-Pick tipo C1 C. elegans mutantes.
Para comprender mejor la relación de 2-AG con el tráfico de colesterol y otros procesos biológicos en el nematodo (es decir, señalización monoaminérgica, nocicepción y locomoción), es crucial estudiar este metabolito endógeno y cómo es afectados en determinadas condiciones ambientales y dietéticas8,9,10,11,12,13. Por lo tanto, es imperativo diseñar y optimizar un método para detectar y cuantificar las 2-AG endógenas en C. elegans que sea fácil de usar para científicos de diferentes campos, especialmente aquellos que estudian el comportamiento del nematodo en relación con esto Endocannabinoide.
En 2008, Lethonen y sus compañeros de trabajo lograron identificar 2-AG y AEA en C. elegans utilizando los métodos analíticos de LC-MS14. En 2011, lograron expandir esta técnica a otros endocannabinoides15. Trabajos más recientes han mostrado otros métodos analíticos que han tenido éxito en la detección y cuantificación de endocannabinoides en C. elegans,incluyendo espectrometría de masas y GC-MS16,17,18, y ha también se ha informado de que métodos analíticos similares pueden ampliarse a otros modelos19.
Los métodos analíticos previamente notificados utilizados para cuantificar 2-AG en muestras biológicas suelen implicar el uso de normas deuterated que se adquieren comercialmente y requieren disponibilidad para la compra20,21. Muchos estándares analíticos para la cuantificación LC-MS/MS de endocannabinoides están disponibles comercialmente de diferentes proveedores. Sin embargo, son caros, son sensibles y se oxidan con el tiempo, debido a la presencia de múltiples enlaces dobles. Las versiones más comunes de estas normas se basan en el ácido araquidónico octa-deuterated y son adecuadas para la cuantificación mediante dilución isótopo LC-MS/MS14,22. Además, la mayoría de estas normas se sustituyen en la posición 2 del glicerol, haciéndolos inestables en la mayoría de las condiciones, ya que son propensos a la migración de acilo19,23.
Para superar las dificultades asociadas con los costos y la estabilidad de estas normas deuteradas, se presenta un método conveniente y sencillo para preparar un estándar analítico basado en glicerol-d5. La secuencia para preparar la norma penta-deuterated requiere un procedimiento de tres pasos que da como resultado el estándar 1-AG-d5, que es estable y no se somete a migración de acil (el problema principal cuando se pretende sintetizar 2-monoacilglycerols).
El objetivo principal aquí es mostrar un método simple y reproducible para estudiar 2-AG en C. elegans, incluyendo la síntesis del estándar deuterated analítico, la preparación y extracción de las muestras de nematodos, y el análisis por LC-MS/MS (Figura 1 ). Este procedimiento sintético es alcanzable sin el sofisticado conocimiento de síntesis orgánica o equipo especial, por lo que es adecuado para científicos de diferentes campos que están estudiando el comportamiento de C. elegans bajo influencia endocannabinoide. El método también se puede expandir a otros modelos de estudio, por lo que es útil para diferentes objetivos. La norma, preparada como se ha informado aquí, se ha aplicado para desarrollar con éxito un método cromatográfico rápido y fiable que permita la detección y cuantificación efectivas de 2-AG de manera reproducible.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Preparación 1-AG-d5
NOTA: Para obtener 1-AG-d5 como estándar interno deuterated para ensayos de cuantificación, siga el protocolo como se detalla a continuación.
- Protección diferencial
- Para proteger únicamente los alcoholes primarios, primero agregue 38 mg de glicerol-d8 a un tubo de reacción de 10 ml utilizando una pipeta Pasteur y agregue un agitador magnético.
- Añadir 5 ml de diclorometano anhidro (DCM) utilizando una jeringa Hamilton de 5 ml, y llenar el tubo con N2 seco para producir una atmósfera inerte.
- Preparar un baño con un matraz Dewar poco profundo lleno de acetato de etilo destilado.
- Coloque el tubo de reacción herméticamente cerrado dentro del baño y enfríe lo agregando lentamente el líquido N2 al acetato de etilo hasta que el disolvente se congele.
ADVERTENCIA: El líquido hierve violentamente a temperatura ambiente (RT) y puede causar quemaduras graves al contactar con los ojos y la piel. - Añadir 54 mg de colidina anhidra utilizando una jeringa Hamilton.
ADVERTENCIA: Collidine es volátil y tiene un aroma muy fuerte y desagradable. - Añadir 70 mg de cloruro de tert-butildimethylsilyl y remover toda la solución durante 3 h a -78 oC en un agitador magnético.
- Después de 3 h, deje que la reacción se caliente en RT y siga revolviendo durante 12 h adicionales.
- Añadir 2 ml de salmuera para saciar la reacción.
- Extraer la solución 3x con 2 ml de diclorometano destilado utilizando un embudo separador, ahorrando el extracto orgánico cada vez.
- Combine los tres extractos orgánicos y séquelos sobre sulfato de sodio.
- Evaporar el diclorometano bajo presión reducida en un evaporador rotativo al vacío con cuidado para evitar proyecciones de disolvente.
- Purificar la mezcla bruta por cromatografía de columna utilizando gel de sílice como fase estacionaria y un 10% más de hexano/acetato de etilo, comenzando a partir de 100% hexano y terminando con 100% acetato de etilo.
- Combine las fracciones que contienen el producto y retire el disolvente bajo presión reducida en un evaporador rotativo al vacío para obtener el glicerol-d5 puro de 1-O,3-O-bis-(TBDMS) como líquido incoloro.
- Esterificación
- Añadir 10 mg de la 1-O,3-O-bis(TBDMS)-glicerol-d5 (previamente sintetizado) a un tubo de reacción de 10 ml utilizando una pipeta Pasteur y añadir un agitador magnético.
- Agregue 2 ml de diclorometano anhidro con una jeringa Hamilton de 5 ml y llene el tubo con N2 seco para producir una atmósfera inerte.
- Enfríe la solución a 0 oC con un baño de hielo.
- Añadir 36 mg de ácido araquidónico utilizando una micropipeta ajustable de varios volúmenes y remover.
- Añadir 15 mg de 4-dimetilaminopiridina y remover.
- Añadir 15 mg de N,N'-diisopropylcarbodiimide utilizando un micropipeta ajustable de varios volúmenes y remover.
- Dejar que la mezcla reaccione a 0oC durante 3 h.
- Después de 3 h, deje que la reacción se caliente en RT y siga revolviendo durante 12 h adicionales.
- Añadir 2 ml de agua para saciar la reacción.
- Extraiga la solución orgánica 3x con 2 ml de diclorometano destilado (DCM) utilizando un embudo separador.
- Coloque los tres extractos orgánicos en el mismo tubo y séquelos sobre sulfato de sodio.
- Evaporar el diclorometano bajo presión reducida en un evaporador rotativo al vacío con cuidado para evitar proyecciones de disolvente.
- Purificar la mezcla bruta por cromatografía de columna utilizando gel de sílice como fase estacionaria y un 10% más de hexano / acetato de etilo, comenzando a partir de 100% hexano y terminando con 50% de hexano/50% acetato de etilo.
- Combine las fracciones que contienen el producto y retire el disolvente bajo presión reducida en un evaporador rotativo al vacío para obtener el 1-O, 3-O-bis(TBDMS)-2-AG-d5 puro puro.
- Desprotección
- Añadir 15 mg de la 1-O,3-O-bis(TBDMS)-2-AG-d5 (previamente sintetizado) a un tubo de reacción de 10 ml utilizando una pipeta Pasteur y añadir un agitador magnético.
- Agregue 2 ml de THF anhidro con una jeringa Hamilton de 5 ml y llene el tubo con N2 seco para producir una atmósfera inerte.
- Enfríe la solución a 0 oC con un baño de hielo.
- Añadir 150 l con gota de 1 M de solución de fluoruro de tetrabutilammonio en THF utilizando una jeringa de Hamilton.
- Dejar que la reacción sea caliente a RT y revuelva durante 1 h.
- Después de 1 h, añadir 2 ml de agua para saciar la reacción.
- Extraiga la solución 3x con 2 ml de diclorometano destilado utilizando un embudo separador.
- Combine los tres extractos orgánicos y séquelos sobre sulfato de sodio.
- Evaporar el diclorometano bajo presión reducida en un evaporador rotativo al vacío para obtener el 1-AG-d5 puro como un líquido amarillento.
- Supervise todas las reacciones mediante cromatografía de capa fina realizada en gel de sílice 60 F254 hojas de aluminio pre-revestidas. Visualice las bandas bajo una lámpara UV de 254 nm después de manchar con una solución etanólica de 4-anisaldehído.
2. Preparación de stock estándar y soluciones de medición
- Disolver 1 mg de la norma interna 1-AG-d5 en 1 ml de ACN y sonicar durante 1 min para obtener la solución estándar de 1.000 ppm.
- Para preparar la solución de 1.000 ppb utilizada para la cuantificación en gusanos, primero prepare una solución de 10 ppm: tome 10 ml de la solución en stock utilizando una jeringa de Hamilton y diluya a un volumen final de 1 ml añadiendo 990 ml de ACN.
- Tomar 100 ml de la solución producida en el paso 2.2 utilizando una jeringa de Hamilton, y diluirla a un volumen final de 1 ml añadiendo 900 ml de ACN para obtener la solución de 1.000 ppb utilizada para la cuantificación.
- Sonicar durante 1 min entre cada paso para asegurar la solubilización completa. Almacene las soluciones a -78 oC para mantener las concentraciones y la integridad de las normas. Después de utilizar la solución estándar, fluya un poco de nitrógeno antes de cerrar el vial para evitar la oxidación.
3. Crecimiento y mantenimiento de C. elegans
NOTA: Siembre las placas de agar de medio de crecimiento de nematodos (NGM) con E. coli OP50 y propague los gusanos en estas placas.
- Mezclar 3 g de NaCl con 17 g de agar.
- Añadir 2,5 g de peptona, luego añadir 975 mL de H2O.
- Autoclave durante 50 min, luego enfríe el matraz a 55 oC.
- Mezclar lo siguiente: 1 mL de 1 M CaCl2, 1 mL de 1 M MgSO4, 25 mL de 1 M KH2PO4 tampón (todos los cuales han sido previamente autoclavedos), y 1 mL de colesterol 5 mg/ml en etanol.
- Mientras mantiene un ambiente estéril, dispensar la solución NGM en placas Petri de 60 mm, llenando las placas a dos tercios de su volumen. Conservar las placas a 4oC.
- Raya el cultivo bacteriano de E. coli de una culata de glicerol de -80 oC en la placa de agar LB. Dejar crecer en el plato durante la noche a 37oC.
- Recoger una sola colonia para inocular 100 ml de LB líquido durante la noche a 37 oC con agitación.
NOTA: No es necesario comprobar el D.O. porque esta cepa puede alcanzar la fase estacionaria durante este tiempo. - Retire las placas NGM almacenadas, retire las tapas de la campana de flujo laminar y déjelas abiertas para permitir la evaporación del exceso de humedad de las placas.
- Una vez que las placas se secan, utilice una pipeta Pasteur para añadir 100 éL de OP50 E. coli al centro de la placa sin esparcerse.
- Dejar el césped OP50 E. coli para crecer durante la noche en RT o a 37 oC durante 8 h.
- Añadir el número deseado de embriones de gusano obtenidos mediante tratamiento con hipoclorito o "blanqueo" (Sección 4).
NOTA: Enfríe las placas a RT antes de la adición de gusanos.
4. Técnica de blanqueo para sincronizar cultivos De C elegans
- Semillas y gusanos trozos en placas NGM de 6 cm.
- Deje los gusanos creciendo durante 2-3 días para obtener un número suficiente de huevos y adultos gravid en el plato.
- Una vez que haya suficientes huevos/adultos, vierta 5 ml de M9 en el plato.
- Transfiera los gusanos a un tubo centrífugo de 15 ml utilizando una pipeta de vidrio.
- Centrifugar el tubo durante 2 min a 2.000 x g y peletizar los gusanos.
- Succionada la mayor parte del M9, evitando la perturbación del pellet de gusano.
- Añadir 3 ml de solución de blanqueo (2:1:1 relación de NaOH:NaOCl:H2O).
- Invierta suavemente para mezclar la solución durante 5 minutos o hasta que disminuya el número de gusanos adultos intactos.
ADVERTENCIA: No lejía durante más de 5 min. - Centrifugar durante 1 min a 2.000 x g y succionar la mayor parte de la solución de blanqueo sin alterar el pellet de gusano.
- Añadir 15 mL de M9 y mezclar bien.
- Centrífuga de nuevo a 2000 x g durante 1 min.
- Succionar la mayor parte del M9 sin molestar el pellet de gusano.
- Repita los pasos 4.10-4.12 una o dos veces más.
- Añadir 5 mL de M9 fresco y agitar.
- Deje que los huevos eclosionen durante la noche con un suave balanceo.
5. Preparación de la muestra de gusano
- Deje que los embriones N2 obtenidos por el procedimiento de blanqueo eclosionen durante la noche en tampón M9 (5 ml en un tubo centrífugo de 15 ml) a 20 oC.
- Cosecha los L1 sincronizados centrifugando el tubo durante 2 min a 2.000 x g.
- Lave los gusanos con el búfer M9 1x, luego cuantifique el número de gusanos L1 vivos.
- Semilla de aproximadamente 10.000 gusanos en placas NGM (10 cm de diámetro) con 1 ml de OP50 E. coli (previamente secado).
- Incubar las placas durante 48 h a 20oC hasta que los gusanos lleguen a la etapa L4.
- Cosecha los gusanos usando un tampón M9 frío en un tubo centrífugo de 15 ml, lávalos 1x, luego transfiéralos a un tubo de 1,5 ml.
- Peletar los gusanos por centrifugación a 2.000 x g durante 1 min, eliminar la mayor parte del sobrenadante, sumergir los tubos en nitrógeno líquido y almacenar a -80 oC.
6. Extracción de lípidos
- Descongelar aproximadamente 100 ml de gránulos de gusano congelados pertenecientes a N2 sobre hielo, añadir 1,3 ml de metanol y sonicar la muestra durante 4 min.
- Añadir 2,6 ml de cloroformo y 1,3 ml de 0,5 M KCl/0,08 M H3PO4 a una proporción final de 1:2:1, 1.000 ppb del estándar interno 1-AG-d5,e hidroxitolueno butilado como agente antioxidante a una concentración final de 50 g/ml.
- Vortex las muestras durante 1 min y sonicar en un baño de agua ultrasónico durante 15 minutos en hielo.
- Vortex las muestras 2x durante 1 min y centrífuga durante 10 min a 2.000 x g para inducir la separación de fase.
- Recoger la fase inferior y recogerla en un tubo limpio, secarla con nitrógeno y resuspender el residuo sólido en 100 oL de ACN.
7. Análisis endocannabinoide por HPLC-MS/MS
- Utilice cromatografía líquida junto con un espectrómetro de masas triple cuadrúpolo ESI para detectar y cuantificar 2-AG a partir de muestras de nematodos.
- Utilice la siguiente relación para HPLC de fase inversa: de 0,0-0,5 min H2O:ACN (40:60), 0,5-6,5 min H2O:ACN (40:60) a (25:75), 6 .5-7.5 min H2O:ACN (25:75), 7.5-8.0 min H2O:ACN (25:75) a (40:60), 8.0-12.0 min H2O: ACN (40:60).
- Mantenga la temperatura de la columna a 40 oC y ajuste la temperatura de la bandeja del muestreador automático a 10 oC.
- Establezca las siguientes condiciones de ionización: modo de iones positivos; gas de secado (N2) temperatura a 300 oC; caudal de gas de secado a 10 L/min; presión del nebulizador a 10 UA; y gorra. tensión de 4 kV.
- Para la detección de analitos, utilice MRM con las siguientes transiciones: 379,2 m/z a 289,2 m/z para 2-AG; y 384,2 m/z a 289,2 m/z para 1-AG-d5.
8. Cuantificación endocannabinoide en gusanos
- Utilice la norma interna deuteada 1-AG-d5 y calcule las relaciones de área pico del analito según la norma interna.
- Utilice las siguientes transiciones: 384,2 m/z a 287,2 m/z para 2-AG; y 379,2 m/z a 287,2 m/z para 1-AG-d5.
- Calcular la concentración del 2-AG endógeno comparando con las relaciones de área pico de la norma deuterada utilizando el valor de concentración de la norma.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Un análogo etiquetado isotópicamente fue sintetizado con éxito a partir de d8-glicerol y ácido araquidónico disponibles comercialmente utilizando un método sintético de 3 pasos(Figura 2, Figura 3). Estos pasos son sencillos y no requieren equipos sofisticados, condiciones especialmente controladas o costosos reactivos. Por lo tanto, este método es robusto y puede extenderse con éxito para sintetizar monoacilglicéridos que contienen diferentes ácidos grasos.
1-AG-d5 se caracterizó estructuralmente mediante espectroscopia magnética nuclear. 1 H MrM mostró el característico multiplelario a 5,44 ppm a 4,93 ppm, que se integra para los ocho protones de vinilo de la cadena de aracidonoilo y triplete a 2,40 ppm, correspondiente a los dos protones de la posición alfa al grupo carbonilo. En 2D NMR, también es posible ver un múltiplo de 2,9 ppm a 2,7 ppm asignable a las cinco deuterio de la porción de glicerol.
El 1-AG-d5 sintetizado químicamente fue utilizado como un estándar interno en muestras de C. elegans. El estándar se añadió a las muestras antes de la extracción y luego se extrajo con los lípidos endógenos, utilizando un método sencillo adaptado de Folch24. Este método modificado proporciona un alto valor de recuperación del estándar, como se muestra en la cuantificación HPLC.
El método se optimizó utilizando las transiciones 1) 384,2 m/z a 287,2 m/z para 2-AG y 2) 379,2 m/z a 287,2 m/z para 1-AG-d5, en las que se pierden las moléculas de glicerol(Figura 4). Los límites de detección (LOD) y cuantificación (LOQ) se calcularon para el estándar utilizando una curva de calibración, lo que dio como resultado valores de 5 ppb y 16,6 ppb, respectivamente. El tiempo de retención para el estándar fue de 6,8 min.
2-AG endógena de las muestras de C. elegans se detectó y cuantificó con éxito mediante dilución isotópica con el 1-AG-d5 sintetizado químicamente utilizando HPLC-MS/MS(Figura 5).
Dado que las concentraciones originales de las normas deuteadas en las muestras 1 y 3 eran cada una de 1.000 ppb cada una, a partir de la relación de área máxima fue posible calcular la concentración endógena de 2-AG a 340 ppb para la muestra 1 y 360 ppm para la muestra 3, produciendo un promedio de 350 ppm ( Tabla 1).
Figura 1: Resumen de síntesis, muestreo de gusanos y cuantificación. Para lograr una cuantificación exitosa del 2-AG endógeno, fue necesario sintetizar su análogo deuterated utilizando una secuencia de tres pasos. Posteriormente, se añadió a las muestras de gusano, se extrajo y se analizó por HPLC-MS/MS. Utilizado como estándar interno, el sintético de 1-AG-d5 fue la herramienta utilizada para cuantificar el metabolito endógeno. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Esquema sintético para la obtención de 1-AG-d5. Se obtuvo una masa de 10 mg del análogo deuterated utilizando el método de tres pasos que implica 1) protección del glicerol-d8, 2) acilación con ácido araquidónico, y 3) desprotección. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Estructura química del análogo 2-AG etiquetado isotópicamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Fragmentaciones seleccionadas para la cuantificación de 1-AG-d5 y 2-AG. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Cromatogramas HPLC para 1-AG-d5 y 1-AG como estándares puros y estándares internos en una muestra de gusano. Era posible analizar los tiempos de retención y ver que 1) el gusano parece no tener 1-AG endógeno y 2) sólo tendría 2-AG, pero el estándar 1-AG-d5 todavía funcionará como un buen estándar analítico para la cuantificación por dilución isotópica. Las transiciones utilizadas fueron: 384,2 m/z a 287,2 m/z para 2-AG, y 379,2 m/z a 287,2 m/z para 1-AG-d5. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| 1-AG-d5 | 2-AG | Relación (2-AG/1-AG-d5) | |
| Muestra 1 | 71964.74 | 210616.08 | 0.34 |
| Muestra 3 | 74311.36 | 205648.43 | 0.36 |
Tabla 1: Ratios de área pico para el estándar deuterated y endógeno 2-AG. Las proporciones se calcularon como cociente entre las zonas máximas de 2-AG y 1-AG-d5, respectivamente, para dos muestras aisladas, ambas con estándar deuteado añadido antes de la extracción.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Los endocannabinoides son una clase de lípidos que se han implicado en la regulación de la formación de dauer en C. elegans7. Más específicamente, la síntesis de ácidos grasos poliinsaturados (PUF) es importante para el tráfico de colesterol y el desarrollo reproductivo de gusanos. Aquí se revela que 2-AG, un ácido araquidónico que contiene endocannabinoide, es responsable de restitución de la larva dauer a su ciclo normal en gusanos que han deteriorado el metabolismo del colesterol7.
Dada la importancia recientemente descubierta de 2-AG en la mejora del tráfico de colesterol y otros procesos biológicos y lo poco que se sabe acerca de cómo los lípidos influyen en este proceso, es necesario un método de detección confiable para este endocannabinoide. El desarrollo exitoso de este método sintético simple y robusto para obtener el analógico deuterated 1-AG-d5 es un paso clave en este protocolo.
La mayoría de los métodos notificados para cuantificar monoacilglycerols implican el uso de normas analíticas disponibles comercialmente, que suelen ser costosas e inestables en condiciones de almacenamiento regular. Esto los hace inconvenientes para los investigadores que requieren grandes cantidades de estándares y nuevas existencias. También son inalcanzables para los laboratorios de menor presupuesto. Sin embargo, este método supera este obstáculo proponiendo la síntesis de la norma utilizando materiales de partida más accesibles.
También es notable que, contrariamente a otros métodos notificados (que utilizan normas analíticas deuteadas de monoacilglicerols sustituidos en 2 sustituyedos que sufren acil-migración en muchas condiciones, por lo que se ven dos picos cromatográficos y afectan a la cuantificación mediante dilución isotópica25), este método utiliza eficientemente un estándar analítico deuterated 1 sustituido, que es un único isómero y no se somete a una migración de acilo.
El método sintético es sencillo y no requiere condiciones sofisticadas, por lo que es ideal para cualquier laboratorio que tenga un equipo mínimo, presupuesto y acceso a reactivos. También es una técnica simple que puede ser utilizada por cualquier científico que trabaje en el campo, sin necesidad de una formación especial en síntesis orgánica. La preparación de la muestra de gusano es el método convencional, sin más complicaciones. Por último, el método de extracción de lípidos para obtener las muestras finales es una modificación del protocolo24 de Folch que permite una mejor recuperación de los valores, ya que no requiere purificación de columna cromatográfica.
El paso crítico es asegurar que la preparación de la muestra y la extracción de lípidos se realizan adecuadamente para lograr una recuperación buena y detectable de la norma. También es importante para 1) producir soluciones de stock fresco mensualmente para mantener las condiciones de la norma y 2) comprobar por RMN-espectroscopia o LC-MS que el estándar sigue siendo puro y no ha sufrido oxidación o degradación. La única limitación de esta técnica se basa en su expansión a otros estudios que pueden tener concentraciones endógenas de 2 AG inferiores a la LOQ presentada. En este caso, el método debe modificarse para garantizar que la concentración se encuentre entre los límites.
En caso de fallo durante el protocolo en el que 1) no hay señal cromatográfica visible de la norma o 2) el valor de recuperación del estándar después de la extracción es inferior al esperado, se recomienda repetir la preparación de la muestra y la extracción de lípidos. Dado que la ruta sintética implica la síntesis de un bloque de construcción de glicerol deuterated protegido que finalmente se aciló con ácido araquidónico en el último paso, este método se puede ampliar a la síntesis de estándares deuterated de otros monoacilglycerols, diacilglicerols, fosfolípidos, y metabolitos relacionados estructuralmente.
En resumen, este nuevo procedimiento describe un método sencillo y reproducible para detectar y cuantificar 2-AG, que ayudará a abordar algunas de las preguntas sin respuesta sobre el papel de este endocannabinoide en C. elegans.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los autores no declaran conflictos de intereses.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por una beca de investigación de la Agencia Nacional de Promoción Científica Tecnológica y Tecnológica (ANPCyT, PICT 2014-3693). J.F.d.L., G.P., y B.H.C. son becarios de CONICET. D.D.M. y G.R.L. son miembros de la Carrera de Investigación de CONICET. Estamos agradecidos a Gonzalo Lamberto (INMET) por el análisis de LC-MS/MS y la discusión útil. Ramiro Ortega y María Soledad Casasola han realizado rodajes y ediciones en coche desde la Dirección de Comunicación de la Ciencia, Facultad de Ciencia y Políticas Internacionales, Universidad Nacional de Rosario en Rosario, Argentina.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-dimethylaminopyridine | Sigma-Aldrich | 107700 | reagent grade, 99% |
| antioxidant BHT | Sigma-Aldrich | W21805 | |
| Arachidonic acid | Sigma-Aldrich | 10931 | |
| Glycerol-d8 | Sigma-Aldrich | 447498 | |
| Mass detector Triple Quadrupole | Thermo Scientific | TSQ Quantum Access Max | |
| N,N’-diisopropylcarbodiimide | Sigma-Aldrich | D125407 | |
| NMR spectrometer | Bruker | Avance II 300 MHz | |
| reversed-phase HPLC column | Thermo Fisher | 25003-052130 | C18 Hypersil-GOLD (50 x 2.1 mm) |
| tert-Butyldimethylsilyl chloride | Sigma-Aldrich | 190500 | reagent grade, 97% |
| tetrabutylammonium fluoride | Sigma-Aldrich | 216143 | 1.0M in THF |
| UHPLC System | Thermo Scientific | Ultimate 3000 RSLC Dionex | |
| worm strain N2 Bristol | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) |
References
- McPartland, J. M., Matias, I., Di Marzo, V., Glass, M.
- Le Foll, B., Goldberg, S. R. Cannabinoid CB1 receptor antagonists as promising new medications for drug dependence. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 312 (3), 875-883 (2005).
- Pesce, M., Esposito, G., Sarnelli, G. Endocannabinoids in the treatment of gastrointestinal inflammation and symptoms. Current Opinion in Pharmacology. 43, 81-86 (2018).
- Hulme, S. E., Whitesides, G. M. Chemistry and the worm: Caenorhabditis elegans as a platform for integrating chemical and biological research. Angewandte Chemie International Edition. 50 (21), 4774-4807 (2011).
- Aitlhadj, L., Stürzenbaum, S. R. Caenorhabditis elegans in regenerative medicine: a simple model for a complex discipline. Drug Discovery Today. 19 (6), 730-734 (2014).
- Lucanic, M., et al. N-acylethanolamine signalling mediates the effect of diet on lifespan in Caenorhabditis elegans. Nature. 473 (7346), 226-229 (2011).
- Galles, C., et al. Endocannabinoids in Caenorhabditis elegans are essential for the mobilization of cholesterol from internal reserves. Scientific Reports. 8 (1), 6398 (2018).
- Kurihara, J., et al. 2-Arachidonoylglycerol and Anandamide Oppositely Modulate Norepinephrine Release from the Rat Heart Sympathetic Nerves. The Japanese Journal of Pharmacology. 87 (1), 93-96 (2001).
- Harris, G., et al. Dissecting the Serotonergic Food Signal Stimulating Sensory-Mediated Aversive Behavior in C. elegans. PLoS ONE. 6 (7), e21897 (2011).
- Pastuhov, S. I., Matsumoto, K., Hisamoto, N. Endocannabinoid signaling regulates regenerative axon navigation in Caenorhabditis elegans via the GPCRs NPR-19 and NPR-32. Genes to Cells. 21 (7), 696-705 (2016).
- Oakes, M. D., Law, W. J., Clark, T. Cannabinoids Activate Monoaminergic Signaling to Modulate Key C. elegans Behaviors. Journal of Neuroscience. 37 (11), 2859-2869 (2017).
- Sofia, R. D., Nalepa, S. D., Harakal, J. J., Vassar, H. B. Anti-edema and analgesic properties of Δ9-tetrahydrocannabinol (THC). Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 186 (3), 646-655 (1973).
- Mills, H., et al. Monoamines and neuropeptides interact to inhibit aversive behaviour in Caenorhabditis elegans. The EMBO Journal. 31 (3), 667-678 (2012).
- Lehtonen, M., Reisner, K., Auriola, S., Wong, G., Callaway, J. C. Mass-spectrometric identification of anandamide and 2-arachidonoylglycerol in nematodes. Chemistry & Biodiversity. 5 (11), 2431-2441 (2008).
- Lehtonen, M., et al. Determination of endocannabinoids in nematodes and human brain tissue by liquid chromatography electrospray ionization tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 879 (11-12), 677-694 (2011).
- Aarnio, V., et al. Caenorhabditis Elegans Mutants Predict Regulation of Fatty Acids and Endocannabinoids by the CYP-35A Gene Family. Frontiers in Pharmacology. 2 (12), 12 (2011).
- Annibal, A., Karalay, Ö, Latza, C., Antebi, A. A novel EI-GC/MS method for the accurate quantification of anti-aging compound oleoylethanolamine in C. elegans. Analytical Methods. 10 (22), 2551-2559 (2018).
- Oakes, M., Law, W. J., Komuniecki, R. Cannabinoids Stimulate the TRP Channel-Dependent Release of Both Serotonin and Dopamine to Modulate Behavior in C. elegans. The Journal of Neuroscience. 39 (21), 4142-4152 (2019).
- Batugedara, H. M., et al. Helminth-Derived Endocannabinoids That Have Effects on Host Immunity Are Generated during Infection. Infection and Immunity. 86 (11), e00441 (2018).
- Zhang, M. Y., et al. Simultaneous determination of 2-arachidonoylglycerol, 1-arachidonoylglycerol and arachidonic acid in mouse brain tissue using liquid chromatography/tandem mass spectrometry. Journal of Mass Spectrometry. 45 (2), 167-177 (2010).
- Zoerner, A. A., et al. Simultaneous UPLC-MS/MS quantification of the endocannabinoids 2-arachidonoyl glycerol (2AG), 1-arachidonoyl glycerol (1AG), and anandamide in human plasma: Minimization of matrix-effects, 2AG/1AG isomerization and degradation by toluene solvent extraction. Journal of Chromatography B. 883-884, 161-171 (2012).
- Ivanov, I., Borchert, P., Hinz, B. A simple method for simultaneous determination of N-arachidonoylethanolamine, N-oleoylethanolamine, N-palmitoylethanolamine and 2-arachidonoylglycerol in human cells. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 407 (6), 1781-1787 (2015).
- Keereetaweep, J., Chapman, K. D. Lipidomic Analysis of Endocannabinoid Signaling: Targeted Metabolite Identification and Quantification. Neural Plasticity. , (2016).
- Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. Journal of Biological Chemistry. 226 (1), 497-509 (1957).
- Zoerner, A. A., et al. Quantification of endocannabinoids in biological systems by chromatography and mass spectrometry: a comprehensive review from an analytical and biological perspective. Biochimica et Biophysica Acta. 1811 (11), 706-723 (2011).
