Summary
Dieser Artikel beschreibt die Verwendung eines verankerten Multiplex-Polymerase-Kettenreaktions-basierten Bibliotheksvorbereitungskits, gefolgt von einer Sequenzierung der nächsten Generation, um onkogene Genfusionen in klinischen soliden Tumorproben zu bewerten. Es werden sowohl Die Nassbank- als auch die Datenanalyseschritte beschrieben.
Abstract
Genfusionen tragen häufig zum onkogenen Phänotyp vieler verschiedener Krebsarten bei. Darüber hinaus beeinflusst das Vorhandensein bestimmter Fusionen in Proben von Krebspatienten häufig direkt die Diagnose, Prognose und/oder Therapieauswahl. Infolgedessen ist der genaue Nachweis von Genfusionen für viele Krankheitstypen zu einem kritischen Bestandteil des klinischen Managements geworden. Bis vor kurzem wurde der klinische Genfusionsnachweis überwiegend durch den Einsatz von Single-Gen-Assays durchgeführt. Die ständig wachsende Liste von Genfusionen mit klinischer Bedeutung hat jedoch dazu führen, dass der Fusionsstatus mehrerer Gene gleichzeitig bewertet werden muss. NGS-basierte Tests der nächsten Generation haben diese Nachfrage durch die Fähigkeit, Nukleinsäure massiv parallel zu sequenzieren, erfüllt. Mehrere NGS-basierte Ansätze, die unterschiedliche Strategien für die Genzielanreicherung anwenden, stehen nun für den Einsatz in der klinischen Molekulardiagnostik zur Verfügung, die jeweils ihre eigenen Stärken und Schwächen haben. Dieser Artikel beschreibt die Verwendung von verankerter Multiplex-PCR (AMP)-basierte Zielanreicherung und Bibliotheksvorbereitung, gefolgt von NGS, um Genfusionen in klinischen soliden Tumorproben zu bewerten. AMP ist einzigartig unter Amplikon-basierten Anreicherungsansätzen, da es Genfusionen unabhängig von der Identität des Fusionspartners identifiziert. Hier sind sowohl die Nassbank- als auch die Datenanalyseschritte aufgeführt, die einen genauen Genfusionsnachweis aus klinischen Proben gewährleisten.
Introduction
Die Verschmelzung von zwei oder mehr Genen zu einer einzigen transkriptionellen Einheit kann als Ergebnis großflächiger chromosomaler Variationen auftreten, einschließlich Deletionen, Duplizierungen, Insertionen, Inversionen und Translokationen. Durch veränderte Transkriptionskontrolle und/oder veränderte funktionelle Eigenschaften des exprimierenden Genprodukts können diese Fusionsgene Krebszellen onkogene Eigenschaften verleihen1. In vielen Fällen sind Fusionsgene dafür bekannt, als primäre onkogene Treiber zu fungieren, indem sie die Zellproliferation und Überlebenswege direkt aktivieren.
Die klinische Relevanz von Genfusionen für Krebspatienten wurde erstmals durch die Entdeckung des Philadelphia-Chromosoms und des entsprechenden BCR-ABL1-Fusionsgens bei chronischer myelogenöser Leukämie (CML)2deutlich. Der kleine Molekülinhibitor Imatinib-Mesylat wurde speziell für dieses Fusionsgen entwickelt und zeigte eine bemerkenswerte Wirksamkeit bei BCR-ABL1-positivenCML-Patienten3. Die therapeutische Ausrichtung auf onkogene Genfusionen war auch bei soliden Tumoren erfolgreich, wobei die Hemmung von ALK- und ROS1-Fusionsgenen bei nicht-kleinzelligem Lungenkrebs als primäre Beispiele 4,5dient. Kürzlich wurde der NTRK-Hemmer Larotrectinib von der FDA für NTRK1/2/3 fusionspositive solide Tumoren zugelassen, unabhängig von der Krankheitsstelle6. Neben der Therapieauswahl spielt der Genfusionsnachweis auch eine Rolle in der Krankheitsdiagnose und -prognose. Dies ist besonders häufig bei verschiedenen Sarkom- und hämatologischen Malignitätssubtypen, die diagnostisch durch das Vorhandensein spezifischer Fusionen definiert werden und/oder für die das Vorhandensein einer Fusion direkt die Prognose7,8 , 9 , 10 , 11. Dies sind nur einige Beispiele für die klinische Anwendung der Genfusionserkennung für Krebspatienten.
Aufgrund der entscheidenden Rolle bei der klinischen Entscheidungsfindung ist der genaue Genfusionsnachweis aus klinischen Proben von entscheidender Bedeutung. Zahlreiche Techniken wurden in klinischen Laboratorien für Fusions- oder chromosomale Umlagerungsanalysen eingesetzt, darunter: zytogenetische Techniken, Reverse-Transkriptionspolymerase-Kettenreaktion (RT-PCR), Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH), Immunhistochemie (IHC) und 5'/3' Expressionsungleichgewichtsanalyse (unter anderem)12,13,14,15. Derzeit hat die schnell wachsende Liste von umsetzbaren Genfusionen bei Krebs dazu geführt, dass der Fusionsstatus mehrerer Gene gleichzeitig bewertet werden muss. Folglich werden einige traditionelle Techniken, die nur ein oder wenige Gene gleichzeitig abfragen können, zu ineffizienten Ansätzen, insbesondere wenn man bedenkt, dass klinische Tumorproben oft sehr endlich sind und nicht auf mehrere Assays aufgeteilt werden können. Die Sequenzierung der nächsten Generation (NGS) ist jedoch eine Analyseplattform, die sich gut für Multi-Gen-Tests eignet, und NGS-basierte Assays sind in klinischen molekulardiagnostischen Laboratorien üblich geworden.
Derzeit verwendete NGS-Assays für die Fusions-/Rearrangement-Erkennung variieren in Bezug auf das verwendete Eingabematerial, die für die Bibliotheksvorbereitung und Zielanreicherung eingesetzten Chemikalien und die Anzahl der Gene, die im Rahmen eines Tests abgefragt werden. NGS-Assays können auf RNA oder DNA (oder beidem) basieren, die aus der Probe extrahiert werden. Obwohl die RNA-basierte Analyse durch die Tendenz klinischer Proben behindert wird, stark degradierte RNA zu enthalten, umgeht sie die Notwendigkeit, große und oft sich wiederholende Introns zu sequenzieren, die das Ziel von DNA-basierten Fusionstests sind, sich aber für NGS als schwierig erwiesen haben. Datenanalyse16. Zielanreicherungsstrategien für RNA-basierte NGS-Assays lassen sich weitgehend in hybride Erfassung oder ampliconvermittelte Ansätze unterteilen. Während beide Strategien erfolgreich für die Fusionserkennung eingesetzt wurden, enthält jede von ihnen Vorteile gegenüber den anderen17,18. Hybride Erfassungsassays führen in der Regel zu komplexeren Bibliotheken und reduziertem Allelic-Aussetzer, während ampliconbasierte Assays im Allgemeinen weniger Input erfordern und zu weniger Off-Target-Sequenzierung19führen. Die primäre Einschränkung der traditionellen Amplikon-basierten Anreicherung ist jedoch vielleicht die Notwendigkeit von Primern für alle bekannten Fusionspartner. Dies ist problematisch, da viele klinisch wichtige Gene bekanntermaßen mit Dutzenden von verschiedenen Partnern verschmelzen, und selbst wenn das Primerdesign den Nachweis aller bekannten Partner erlaubt, blieben neuartige Fusionsereignisse unentdeckt. Eine kürzlich beschriebene Technik, die als verankerte Multiplex-PCR (kurz AMP) bezeichnet wird, behebt diese Einschränkung20. In AMP wird ein "halbfunktioneller" NGS-Adapter zu cDNA-Fragmenten ligiert, die aus Input-RNA abgeleitet werden. Die Zielanreicherung wird durch Verstärkung zwischen genspezifischen Primern und einem Primer am Adapter erreicht. Daher sollten alle Fusionen zu Genen von Interesse nachgewiesen werden, selbst wenn ein neuartiger Fusionspartner beteiligt ist (siehe Abbildung 1). Dieser Artikel beschreibt die Verwendung des ArcherDx FusionPlex Solid Tumor Kits, eines NGS-basierten Assays, der AMP für die Zielanreicherung und Bibliotheksvorbereitung verwendet, zum Nachweis onkogener Genfusionen in soliden Tumorproben (siehe Ergänzende Tabelle 1 für vollständige Genliste). Das Wet-Bench-Protokoll und die Datenanalysewurden in einem CLIA-zertifizierten Labor (Clinical Laboratory Improvement Amendments) streng validiert.
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Protocol
1. Bibliotheksvorbereitung und -sequenzierung
- Allgemeine Assay-Überlegungen und Pre-Assay-Schritte
- Assay-Läufe bestehen in der Regel aus sieben klinischen Proben und einer positiven Kontrolle (obwohl die Anzahl der Proben pro Bibliotheksvorbereitungslauf bei Bedarf angepasst werden kann). Verwenden Sie eine positiv-kontroll, die mindestens mehrere Genfusionen enthält (die die Assay-Ziele), die von einem Hersteller bestätigt wurden und/oder durch eine orthogonale Methodik bestätigt wurden. Eine Nicht-Vorlagenkontrolle (NTC) muss als zusätzliche Probe in jedem Testlauf enthalten sein, wird aber nur durch die cDNA-Synthese des zweiten Strangs und die Qualitätskontrolle vor der Sequenzierung (Pre-Seq QC; um keine cDNA-Synthese zu gewährleisten) durchgeführt. Verwenden Sie Probenverdünnungsmittel (10 mM Tris HCl pH 8.0) für den NTC.
- Führen Sie die gesamte Nukleinsäure (TNA) Extraktion von formalinfixiertem Paraffin-eingebettetem (FFPE) Gewebe durch.
- Quantifizieren Sie die RNA-Komponente der TNA mit einem fluorometrischen Assay.
HINWEIS: Verhindern Sie den RNA-Abbau in den Proben, indem Sie Frost-Tau-Zyklen begrenzen, aufgetaute Nukleinsäure bei niedriger Temperatur (gekühlter Block, Eis oder Alternative) halten und eine Kontamination der RNase verhindern (Handschuhe tragen, mit einem RNase-Dekontaminatorspray).
- Zufällige Grundierung
HINWEIS: Der gewünschte Input für den Test ist 200 ng RNA (basierend auf fluorometrischer Quantifizierung der TNA). Niedrigere Eingänge können verwendet werden, wenn 200 ng nicht erreicht werden können. Wenn das Beispiel nach der Sequenzierung von QC fehlschlägt, kann eine Wiederholung mit höherer Eingabe zu akzeptablen QC-Metriken führen.- TNA in 10 mM Tris HCl pH 8.0 verdünnen, um die gewünschte RNA-Konzentration zu erreichen. Für jede Probe 20 l der Verdünnung in die zufälligen Grundierbandrohre (in vorgekühlten Aluminiumblock gelegt) übertragen und durch Pipettieren 6-8-mal nach oben und unten mischen. Drehen Sie kurz nach unten und übertragen Sie das gesamte Volumen auf eine 96 Well PCR Platte und versiegeln Sie mit RT-Folie.
- Platte in Thermocycler-Block einlegen, Abdeckung mit Kompressionspad und Deckel schließen. Bei 65 °C für 5 min (beheizter Deckel) inkubieren.
- Entfernen Sie die Platte vom Thermocycler und legen Sie sie 2 min auf Eis.
- Erste Strang-cDNA-Synthese
- Übertragen Sie das gesamte Volumen des zufälligen Grundierprodukts in die ersten Strangreagenzbandrohre (in vorgekühlten Aluminiumblock gelegt). Mischen Sie durch Pipettieren nach oben und unten 6-8 mal. Kurz nach unten drehen, ganzes Volumen auf eine 96-Well-PCR-Platte übertragen und mit RT-Folie abdichten.
- Platte in Thermocycler-Block einlegen, Abdeckung mit Kompressionspad und Deckel schließen. Thermocycler-Programm laufen: 25 °C 10 min, 42 °C 30 min, 80 °C 20 min, 4 °C halten (beheizter Deckel).
- Zweite Strang-cDNA-Synthese
- Erstellen Sie in einem neuen Satz von PCR-Streifenrohren eine Verdünnung des ersten Strangprodukts um 1:10, indem Sie dem 9-L-Nuklease-freien Wasser 1 l des ersten Strangprodukts hinzufügen. Stellen Sie die Verdünnung beiseite, um im Pre-Seq QC-Test verwendet zu werden.
- Fügen Sie dem verbleibenden Produkt des ersten Strangs 21 L nukleasefreies Wasser hinzu. Übertragen Sie 40 l des ersten Strangprodukts und nukleasefreies Wasser auf das zweite Strangreagenzbandrohr (in vorgekühltem Aluminiumblock platziert). Mischen Sie durch Pipettieren nach oben und unten 6-8 mal. Nach unten drehen, ganzes Volumen auf eine 96-Well-PCR-Platte übertragen und mit RT-Folie abdichten.
- Platte in Thermocycler-Block einlegen, Abdeckung mit Kompressionspad und Deckel schließen. Thermocycler-Programm laufen: 16 °C 60 min, 75 °C 20 min, 4 °C halten (beheizter Deckel).
HINWEIS: Dies ist ein akzeptabler Haltepunkt. Die Platte kann bei -20 °C gelagert werden.
- Pre-Seq QC
HINWEIS: Dieser Qualitätskontrolltest (QC) wird in erster Linie zur Überprüfung der cDNA-Synthese aus dem NTC verwendet. Die Daten können jedoch auch bei der Fehlerbehebung durch Assay informativ sein. Wenn eine Stichprobe z. B. einen guten Pre-Seq QC-Wert, aber schlechte Assay-Metriken (siehe unten) hat, kann dies ein Hinweis auf ein Problem im Testlauf sein, was eine Wiederholung erforderlich macht.- Führen Sie jedes Beispiel und den NTC in dupliziert aus. Auch in der Pre-Seq QC laufen eine Reaktion NTC, die Nuklease freies Wasser ist (auch in dupliziert laufen). Zu jedem anwendbaren Brunnen einer optischen 96-Wellplatte fügen Sie 5 l des Assay-Master-Mix, 1 l 10x VCP-Primer und 4 l der 1:10-Verdünnung des ersten Strangprodukts, das in Schritt 1.4.1 erstellt wurde, hinzu.
- Versiegeln Sie die Platte mit RT-Folie, drehen Sie sie aus und laden Sie sie in ein quantitatives PCR-Instrument (qPCR). Laufen Sie das Programm: Vorverstärker: 1 Zyklus 95 °C 20 s, Verstärker: 35 Zyklen 95 °C 3 s (4,4 °C/s Rampenrate) bei 60 °C 30 s (2,2 °C/s Rampenrate).
- Bestätigen Sie das Fehlen eines Zyklusschwellenwerts (Ct) sowohl für den Test-NTC als auch für den Reaktions-NTC.
HINWEIS: Wenn im Test-NTC kein Ct beobachtet wird, wird es im Test nicht mehr vorgetragen. Die Beobachtung eines Ct-Wertes in der Reaktion NTC erfordert eine Wiederholung des Pre-Seq QC-Assays. Die Beobachtung eines Ct im Test-NTC deutet darauf hin, dass die Probenkontamination zu einem bestimmten Zeitpunkt vor dem Test erfolgen kann, so dass der gesamte Assay (alle Proben) von vorn begonnen werden muss. Der Pre-Seq QC Ct-Wert für eine geeignete Qualitätsprobe sollte unter 30 liegen (niedrigere Ct-Werte korrelieren mit mehr Produkt und damit höherwertiger RNA). Werte über 30 sind keine absoluten Fehlerindikatoren, und diese Stichprobe sollte im Test fortgesetzt werden. Alle aus solchen Proben gewonnenen Daten sollten jedoch sorgfältig überprüft werden, insbesondere in Fällen, für die keine Fusion aufgerufen wird.
- Endreparatur und Perlenreinigung
- Übertragen Sie 40 l des zweiten Strangprodukts in das Endreparatur-Reagenzbandrohr (in vorgekühlten Aluminiumblock) platziert. Mischen Sie durch Pipettieren nach oben und unten 6 x 8 mal, drehen Sie sich nach unten und legen Sie in Thermocycler-Block (halten Sie den beheizten Deckel offen) und führen Sie das Thermocycler-Programm: 25 °C 30 min, 4 °C halten.
- Reinigende Perlen von 4 °C entfernen und auf Raumtemperatur ausbessern lassen. Machen Sie genug 70% Ethanol, um während der gesamten Bibliothekvorbereitung zu halten. Wirbelperlen weit vor Gebrauch und Pipetten 100 l in die entsprechende Anzahl von Brunnen einer U-Bodenplatte.
HINWEIS: Für alle 8 Proben, die ausgeführt werden, werden 20 ml 70% Ethanol benötigt. - Fügen Sie das gesamte Volumen des Endreparaturprodukts zu den Perlen hinzu. Pipetten Sie 6-8 mal nach oben und unten, um bei Raumtemperatur für 5 min zu mischen und zu brüten, gefolgt von einer 5-min-Inkubation auf dem Magneten.
- Entfernen und entsorgen Sie den Überstand und führen Sie zwei 200 l 70% Ethanol-Washes mit 30-s-Inkubationen durch. Nach der letzten Wäsche alle 70% Ethanol entfernen und die Luft für 5 min trocknen lassen.
- Vom Magnet entrübe entfernen und Perlen in 22 l von 10 mM Tris HCl pH 8.0 wieder aufhängen. Inkubieren Sie den Magneten für 3 min, gefolgt von einer 2-min Inkubation auf dem Magneten. Fahren Sie sofort mit Ligationsschritt 1 fort.
- Ligationsschritt 1 und Perlenreinigung
- 20 l von der Endreparatur-Perlenreinigungsplatte (mit Vorsicht, das Perlenpellet nicht zu stören) in die Ligationsschritt 1-Bandrohre (in vorgekühlten Aluminiumblock) übertragen. Mischen Sie durch Pipettieren nach oben und unten 6-8-mal, drehen Sie nach unten und übertragen Sie das gesamte Volumen in eine 96 Well PCR-Platte.
- Einschubplatte in Thermocycler-Block, Abdeckung mit Kompressionspad und Verschlussdeckel. Thermocycler-Programm laufen: 37 °C 15 min, 4 °C halten (beheizter Deckel).
- Reinigende Perlen von 4 °C entfernen und auf Raumtemperatur ausbessern lassen. Wirbelperlen weit vor Gebrauch und Pipetten 50 l in die entsprechende Anzahl von Brunnen einer U-Bodenplatte.
- Fügen Sie das gesamte Volumen des Ligation s Schritt 1 Produktes zu den Perlen hinzu. Pipetten Sie 6-8 mal nach oben und unten, um bei Raumtemperatur für 5 min zu mischen und zu brüten, gefolgt von einer 5-min-Inkubation auf dem Magneten.
- Entfernen und entsorgen Sie den Überstand und führen Sie zwei 200 l 70% Ethanol-Washes mit 30-s-Inkubationen durch. Nach der letzten Wäsche alle 70% Ethanol entfernen und die Luft für 5 min trocknen lassen.
- Vom Magnet entrübe entfernen und Perlen in 42 l von 10 mM Tris HCl pH 8.0 wieder aufhängen. Inkubieren Sie den Magneten für 3 min, gefolgt von einer 2-min Inkubation auf dem Magneten. Fahren Sie sofort mit Ligationsschritt 2 fort.
- Ligationsschritt 2 und Perlenreinigung
- Entfernen Sie molekulare Barcode (MBC) Adapterband-Reagenzien aus 4 °C Lagerung. Die richtige Nummerierung des MBC-Adapterstreifens ist von entscheidender Bedeutung, da an dieser Stelle beispielspezifische Indizes hinzugefügt werden. Positionieren Sie die Rohre horizontal mit den Scharnieren nach hinten und beschriften Sie die Rohre mit einem permanenten Marker 1, 2, 3... von links nach rechts. Es ist auch wichtig, die beispielspezifischen Indizes zu Sequenzierungszwecken aufzuzeichnen (sie müssen in das Sequenzer-Arbeitsblatt eingegeben werden).
- Übertragen Sie 40 l von der Ligationsstufe 1 Perlenreinigungsplatte (wobei darauf geachtet wird, das Perlenpellet nicht zu stören) auf die MBC-Adapterbandrohre (in vorgekühlten Aluminiumblock gelegt). Mischen Sie durch Pipettieren nach oben und unten 6-8 mal.
- Drehen Sie nach unten und übertragen Sie das gesamte Volumen auf die LigationSchritt 2 Reagenzbandrohre (auch in vorgekühlten Aluminiumblock platziert). Mischen Sie durch Pipettieren nach oben und unten 6-8 mal, drehen Sie nach unten und legen Sie in Thermocycler-Block. Mit dem beheizten Deckel läuft das Thermocycler-Programm: 22 °C 5 min, 4 °C halten.
HINWEIS: Dies ist ein sicherer Haltepunkt und Proben können bei -20 °C gelagert werden. - Entfernen Sie Ligationsreinigungsperlen aus der Lagerung von 4 °C und lassen Sie sie auf Raumtemperatur ausdemieren. Bereiten Sie 1 ml frische 5 mM NaOH vor.
- Wirbel die Ligation Bereinigungsperlen und fügen Sie 50 L zu einem neuen Satz von PCR-Streifenröhren. 1 min auf dem Magneten inkubieren. Nach der 1-min Inkubation überstandes Überstand entfernen und entsorgen. Entfernen Sie Diebrohre vom Magneten und setzen Sie sie in 50 l Ligationsreinigungspuffer wieder auf, indem Sie 6-8-mal nach oben und unten pfeifen.
- Übertragen Sie das gesamte Volumen des Ligation step 2 Produktes in die Ligationsreinigungsperlenstreifenrohre. Mischen Sie die Proben durch Wirbeln und inkubieren bei Raumtemperatur für 5 min. Mischen Sie erneut Proben durch Wirbeln und inkubieren Sie bei Raumtemperatur weitere 5 min. Nach der zweiten 5-min-Inkubation die Proben durch Wirbeln mischen, kurz nach unten drehen und 1 min auf dem Magneten inkubieren.
- Entfernen und verwerfen Sie Überstand. Fügen Sie 200 L Ligationsbereinigungspuffer und Wirbel hinzu, um sie erneut auszusetzen. Führen Sie eine schnelle Drehung und legen Sie auf dem Magneten für 1 min. Führen Sie eine zweite Wäsche mit dem Ligation Cleanup Puffer wieder.
- Nach den beiden Waschungen mit dem Ligationsreinigungspuffer führen Sie eine identische Wäsche mit Reinstwasser durch. Nach der Reinstwasserwäsche die Perlen in 20 l von 5 mM NaOH wieder aufhängen und auf eine 96-Well-PCR-Platte übertragen. Legen Sie die Platte in einen Thermocyclerblock mit einem Kompressionspad und führen Sie das Thermocycler-Programm aus: 75 °C 10 min, 4 °C halten (beheizter Deckel).
- Drehen Sie die PCR-Platte nach dem Abkühlen der Proben auf 4 °C nach unten. Legen Sie die Platte mindestens 3 min auf den Magneten und fahren Sie sofort zur ersten PCR fort.
- Erste PCR- und Perlenreinigung
- Entfernen Sie die ersten PCR-Reagenzstreifenrohre aus 4 °C Lagerung und legen Sie sie in einen vorgekühlten Aluminiumblock. Entfernen Sie außerdem die GSP1-Grundierungen von -20 °C und lassen Sie sie auf Raumtemperatur ausdemieren.
- Fügen Sie jedem Bohrwert der ersten PCR-Reagenzbandröhren 2 L der GSP1-Grundierungen hinzu. Übertragen Sie 18 l des Ligation 2-Reinigungsprodukts auf die ersten PCR-Reagenzbandrohre und mischen Sie sie durch Pipettieren von 6 bis 8 Mal nach oben und unten.
- Drehen Sie nach unten und übertragen Sie auf eine 96 Well PCR Platte. Legen Sie die Platte in einen Thermocyclerblock mit einem Kompressionspad und führen Sie das Thermocycler-Programm: 95 °C 3 min, 15 Zyklen 95 °C 30 s bei 65 °C 5 min (100% Rampenrate), 72 °C 3 min, 4 °C halten (beheizter Deckel).
HINWEIS: Dies ist ein sicherer Haltepunkt und Proben können bei 4 °C über Nacht oder bei -20 °C für die Langzeitlagerung gelagert werden. - Reinigende Perlen von 4 °C entfernen und auf Raumtemperatur ausbessern lassen. Wirbelperlen weit vor Gebrauch und Pipetten 24 l in die entsprechende Anzahl von Brunnen einer U-Bodenplatte.
- Übertragen Sie 20 l des ersten PCR-Produkts auf die 24 L Perlen. 6-8 Mal nach oben und unten, um 5 min bei Raumtemperatur zu mischen und zu brüten, gefolgt von einer 2-min-Inkubation auf dem Magneten.
- Entfernen und entsorgen Sie den Überstand und führen Sie zwei 200 l 70% Ethanol-Washes mit 30-s-Inkubationen durch. Nach der letzten Wäsche alle 70% Ethanol entfernen und die Luft für 2 min trocknen lassen.
- Entfernen Sie die Perlen in 24 l von 10 mM Tris HCl pH 8.0 vom Magneten und hängen Sie sie wieder auf. Inkubieren Sie den Magneten für 3 min, gefolgt von einer 2-min Inkubation auf dem Magneten. Fahren Sie sofort mit der zweiten PCR fort.
- Zweite PCR- und Perlenreinigung
- Entfernen Sie die zweiten PCR-Reagenzstreifenrohre aus 4 °C und legen Sie sie in einen vorgekühlten Aluminiumblock. Die richtige Nummerierung der zweiten PCR-Streifenrohre ist von entscheidender Bedeutung, da an dieser Stelle stichprobenspezifische Indizes hinzugefügt werden. Positionieren Sie die Rohre horizontal mit den Scharnieren nach hinten und beschriften Sie die Rohre mit einem permanenten Marker 1, 2, 3... von links nach rechts. Entfernen Sie außerdem die GSP2-Grundierungen von -20 °C und lassen Sie sie auf Raumtemperatur ausdemieren.
HINWEIS: Es ist auch wichtig, die beispielspezifischen Indizes für Sequenzierungszwecke aufzuzeichnen (sie müssen im Sequenzer-Arbeitsblatt eingegeben werden). - Fügen Sie jeder Bohrung der zweiten PCR-Reagenzbandröhren 2 L der GSP2-Primer hinzu. Übertragen Sie 18 l des ersten PCR-Reinigungsprodukts auf die zweiten PCR-Reagenzbandrohre und mischen Sie sie durch Pipettieren von 6 bis 8 Mal nach oben und unten.
- Drehen Sie nach unten und übertragen Sie auf eine 96 Well PCR Platte. Platte mit Kompressionspad in Thermocycler-Block legen und das Thermocycler-Programm laufen lassen: 95 °C 3 min, 18 Zyklen 95 °C 30 s bei 65 °C 5 min (100% Rampenrate), 72 °C 3 min, 4 °C halten (beheizter Deckel).
HINWEIS: Dies ist ein sicherer Haltepunkt und Proben können bei 4 °C über Nacht oder bei -20 °C für die Langzeitlagerung gelagert werden. - Reinigende Perlen von 4 °C entfernen und auf Raumtemperatur ausbessern lassen. Wirbelperlen weit vor Gebrauch und Pipetten 24 l in die entsprechende Anzahl von Brunnen einer U-Bodenplatte.
- Übertragen Sie 20 L des zweiten PCR-Produkts auf die Perlen. 6-8 Mal nach oben und unten, um 5 min bei Raumtemperatur zu mischen und zu brüten, gefolgt von einer 2-min-Inkubation auf dem Magneten.
- Entfernen und entsorgen Sie den Überstand und führen Sie zwei 200 l 70% Ethanol-Washes mit 30-s-Inkubationen durch. Nach der letzten Wäsche alle 70% Ethanol entfernen und die Luft für 2 min trocknen lassen.
- Entfernen Sie die Perlen in 24 l von 10 mM Tris HCl pH 8.0 vom Magneten und hängen Sie sie wieder auf. Inkubieren Sie den Magneten für 3 min, gefolgt von einer 2-min Inkubation auf dem Magneten. Übertragen Sie 20 l des zweiten PCR-Reinigungsprodukts auf eine neue 96-Well-PCR-Platte.
HINWEIS: Dies ist ein sicherer Haltepunkt und Bibliotheken können bei -20 °C für die langfristige Speicherung gespeichert werden oder sofort mit der Bibliotheksquantifizierung fortfahren.
- Entfernen Sie die zweiten PCR-Reagenzstreifenrohre aus 4 °C und legen Sie sie in einen vorgekühlten Aluminiumblock. Die richtige Nummerierung der zweiten PCR-Streifenrohre ist von entscheidender Bedeutung, da an dieser Stelle stichprobenspezifische Indizes hinzugefügt werden. Positionieren Sie die Rohre horizontal mit den Scharnieren nach hinten und beschriften Sie die Rohre mit einem permanenten Marker 1, 2, 3... von links nach rechts. Entfernen Sie außerdem die GSP2-Grundierungen von -20 °C und lassen Sie sie auf Raumtemperatur ausdemieren.
- Bibliotheksquantitation
- Entfernen Sie den Bibliotheksquantitationsmastermix und die Standards aus -20 °C Speicher und lassen Sie es ermöglichen, die Raumtemperatur zu auslagern.
- Führen Sie 1:5 Verdünnung aller Bibliotheken (zweites PCR-Produkt) mit 10 mM Tris HCl pH 8.0 gefolgt von einer seriellen Verdünnung von 1:199, 1:199 und 20:80 mit 10 mM Tris HCl pH 8.0 0.05% Polysorbat. Die letzten beiden Verdünnungen von 1:200.000 bzw. 1:1.000.000 werden in dreifacher Ausführung durchgeführt.
- Fügen Sie jedem Bohrwert einer optischen 96-Well-Platte 6 l Master-Mix hinzu, gefolgt von 4 l entsprechender Verdünnung oder Standard. Drehen Sie die Platte herunter und laden Sie sie auf das qPCR-Instrument. Verwenden Sie die folgenden Fahrradbedingungen: 1 Zyklus 95 °C 5 min, 35 Zyklen 95 °C 30 s (4,4 °C/s Rampenrate) bei 60 °C 45 s (2,2 °C/s Rampenrate).
- Nachdem die Bibliotheksquantifizierung abgeschlossen ist und bibliothekskonzentrationen bestimmt werden (durch Mittelung beider getesteter Verdünnungen), normalisieren Sie alle Bibliotheken auf 2 nM mit 10 mM Tris HCl pH 8.0. Machen Sie den Bibliothekspool, indem Sie 10 l jeder normalisierten Bibliothek zu einem 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr kombinieren.
- Sequenzierung von Bibliotheken
- Sequenzer-Reagenzpatrone von -20 °C-Lagerung entfernen und mindestens 1 h in deionisiertem (DI)-Wasser bis zur Fülllinie abstellen. Entfernen Sie außerdem das Sequenzer-Reagenz-Kit von 4 °C und lassen Sie es zulassen, dass sie mindestens 1 h auf Raumtemperatur ausgeglichen werden. Die maximale Anzahl von Bibliotheken, die auf dieser Sequenzierungsplattform sequenziert werden können, ist 8 (eine davon muss der positive Steuerelement sein).
- Machen Sie den denaturierten Amplicon Library (DAL) Pool, indem Sie 10 L des Bibliothekspools mit 10 l 0,2 N NaOH kombinieren und 5 min bei Raumtemperatur inkubieren. Nach der 5-min-Inkubation fügen Sie 10 l von 200 mM Tris HCl pH 7.0 hinzu, gefolgt von 970 l HT1-Hybridisierungspuffer.
- Machen Sie das Endlastrohr, indem Sie 300 L HT1, 25 l 20 pM PhiX und 675 l des DAL-Pools kombinieren. Wirbel und drehen Sie das Lastrohr nach unten. Fügen Sie das gesamte Volumen des Lastrohrs in den Probenbrunnen der Sequenzer-Reagenzpatrone und laden Sie die Kassette in den Sequenzer mit einer Laufzeit von 2 x 151 bp mit 2 x 8 Indexlesevorgängen.
2. Datenanalyse
- Sequenzierung von Datenverarbeitung und -analyse
- Laden Sie Sequenzierungsmetriken vom NGS-Instrument herunter.
- Stellen Sie sicher, dass sequenzierende Daten in die folgenden Bereiche fallen (spezifisch für das in diesem Beispiel verwendete Kit). Clusterdichte (Dichte [K/mm2]): 945–1600 K; % des Leseübergabefilters (Cluster PF [%]): >90%; Qualitätsbewertungen (% Q30): >85%; PhiX-Ausrichtung (ausgerichtet %): 1,5 bis 6,0 %; PhiX-Fehlerquote (Fehlerrate [%]): <1,0%; liest übergebenden Filter (liest PF [M]): >22 Millionen.
HINWEIS: Sequenzierungsläufe, die diese Metriken nicht erfüllen, können wiederholt werden. - Überprüfen Sie den % der Lesevorgänge, die jeder Stichprobe zugeordnet sind (d. h. jeder stichprobenspezifische Index). Bei einem typischen Durchlauf, bei dem der PhiX-Spike-In 5 % betrug und 8 Samples sequenziert wurden, sollte jede Stichprobe idealerweise etwa 11,9 % der Lesevorgänge ausmachen. Der zulässige Bereich für jede Probe beträgt 5 bis 25 %. Wenn Beispiele nicht in diesen Bereich passen, wiederholen Sie die Bibliotheksquantitation und -sequenzierung.
- Übermittlung von Rohsequenzdaten an den Analysealgorithmus
HINWEIS: Version 4.1.1.7 der ArcherDx-Analyse wird hier beschrieben. In diesem Beispiel wird die Analysesoftware als "virtuelle Maschine" bereitgestellt, die auf einem internen Server ausgeführt wird. Für jedes gleichzeitig zu analysierende Sample sind eine zentrale Verarbeitungseinheit (CPU) und 12 GB Ram (Random Access Memory) erforderlich (in der Regel werden 8 Samples gleichzeitig verarbeitet, die 8 CPU und 96 GB RAM erfordern). Die Verarbeitung dauert in der Regel 3 x 8 h.- Verwenden Sie die Standardanalyseeinstellungen innerhalb des Analysesystems, mit Ausnahme von MIN_AVERAGE_UNIQUE_RNA_START_SITES_PER_GSP2_CONTROLS (dies wird von 10 auf 20 geändert) und READ_DEPTH_NORMALIZATION (dies ist auf 0 gesetzt, um Down-Sampling zu verhindern).
- Um einen Analyseauftrag zu starten, klicken Sie in der Benutzeroberfläche auf Analyse durchführen, senden Sie einen Namen für den Auftrag, und wählen Sie dann die erforderlichen FASTQ-Dateien aus (um sicherzustellen, dass beide Lesevorgänge [R1 und R2] für jedes Beispiel ausgewählt werden).
- Wählen Sie RNA Fusion für RNA-Analysetypen, Illumina (gepaart) für Plattform und FusionPlex Solid Tumor Panel für Zielregion. Klicken Sie dann auf Analyse einreichen.
- Interpretation von Assay-Daten
- Öffnen Sie die Benutzeroberfläche des Analysesystems und wählen Sie den gewünschten Auftrag aus. Wählen Sie die Positivsteuerungsstichprobe aus. Stellen Sie sicher, dass alle erwarteten Fusionen und onkogenen Isoformen nachgewiesen wurden und auf der Registerkarte Starke Beweise aufgeführt sind.
HINWEIS: Wenn eine der verfolgten Fusionen in der Positivkontrolle für einen bestimmten Lauf des Assays nicht erkannt wird, kann dies ein Hinweis auf ein Problem in diesem Lauf sein, das eine Wiederholung (von Beginn des Testes) erfordert. - Untersuchen Sie die Lesestatistiken für jede klinische Stichprobe im Lauf, indem Sie auf die Registerkarte Statistik lesen klicken. Jede Stichprobe sollte durch mindestens 1 Million Fragmente insgesamt dargestellt werden. Wenn weniger als 1 Million, sequenzieren Sie die Bibliothek mit Überlegungen zur Neuquantifizierung, um sicherzustellen, dass die anfängliche Quantifizierung nicht abwegig hoch war.
HINWEIS: Proben guter Qualität werden in der Regel auf Ziel % >85% angezeigt, und die RNA-Molekularbehälter sollten >20.000 sein und >30% der Lesevorgänge umfassen. Wenn diese Metriken jedoch nicht erfüllt werden, wird nicht automatisch ein Beispielfehler ausgelöst. - Überprüfen Sie den Wert "Durchschnittliche eindeutige Startsites pro GSP2-Steuerelementwert".
HINWEIS: Dieser Wert ist ein Maß für die Sequenzierungskomplexität von Primern bis zu vier Haushaltsgenen. Diese Metrik ist ein entscheidender Determinant der RNA-Qualität in der Probe (wenn die Sequenzierung der Gene, die in der Probe exprimiert werden sollen, schlecht ist, dann ist das Vertrauen in die Fähigkeit, eine exprimierte Genfusion zu erkennen, gering). Der Cutoff für diese Metrik ist 20. Wenn eine Stichprobe einen Wert kleiner als 20 anzeigt, müssen die Ergebnisse für die Stichprobe als uninformativ gemeldet werden, wenn keine Fusion mit hoher Sicherheit gefunden wird. Der Status dieser Metrik kann auch auf der Zusammenfassungsseite des Laufs bestimmt werden (Status wird als Fusion QC: Pass oder Fusion QC: Number of Unique RNA GSP2 Control Start Sites Low aufgeführt, je nachdem, ob der Wert größer oder kleiner als 20 ist). Eine Fusion mit hohem Vertrauen in einer Stichprobe, die diese QC-Metrik nicht bestanden hat, kann weiterhin gemeldet werden, wenn festgestellt wird, dass sie real ist (siehe unten). Im Allgemeinen korrelieren höhere QC-Werte, die diese Metrik verwenden, mit niedrigeren PreSeq Ct-Werten, wie erwartet (Abbildung 2).
- Öffnen Sie die Benutzeroberfläche des Analysesystems und wählen Sie den gewünschten Auftrag aus. Wählen Sie die Positivsteuerungsstichprobe aus. Stellen Sie sicher, dass alle erwarteten Fusionen und onkogenen Isoformen nachgewiesen wurden und auf der Registerkarte Starke Beweise aufgeführt sind.
- Fusion Call Interpretation
- Prüfen Sie sorgfältig jede aufgerufene Fusion unter der Registerkarte Starke Beweise (die Mehrheit der starken Beweisfusionen, die vom System aufgerufen werden, sind artefaktll). Scannen Sie auch die schwachen Evidenz Fusion bin, obwohl das Vorhandensein einer nicht-artifactual Fusion in diesem Behälter ist ein extrem seltenes Ereignis. Um die Gültigkeit einer Fusion zu bewerten, beachten Sie zunächst die Metriken "Lesevorgänge" (-/%) und "Sites starten".
ANMERKUNG: Im Allgemeinen erhöht das Vertrauen in eine aufgerufene Fusion, je höher diese Metriken sind. Fusionen, die von weniger als 5 Startsites und von weniger als 10% der Lesevorgänge aus dem unterstützenden Primer unterstützt werden, sollten als sehr verdächtig betrachtet werden, da sie artefaktuell sind. - Notieren Sie sich die Symbole, die in der Spalte Filter angezeigt werden.
HINWEIS: Mehrere dieser Symbole warnen den Benutzer vor einer potenziellen Quelle eines Artefaktaufrufs. Häufig sind unter diesen (und in erster Linie in der schwachen Evidenz-Bin der genannten Fusionen gefunden) Fälle, in denen die Partner bekannt Paralogen sind oder zeigen Ähnlichkeit zueinander in der Reihenfolge (was auf wahrscheinliche Fehl-Priming oder fehlerhafte Ausrichtung). Eine weitere häufige Quelle von artefaktischen Fusionsaufrufen tritt auf, wenn die Lesevorgänge, die die Fusion unterstützen, eine hohe Fehlerrate enthalten, die auf eine schlechte Zuordnung zum Referenzgenom hindeutet, und dies ist mit einem eindeutigen Symbol verbunden. Transkriptionsdurchleseereignisse werden über ein anderes Symbol identifiziert. Diese sind häufig und werden im Allgemeinen ignoriert. Mehrere andere Symbole werden auch in der Benutzeroberfläche verwendet, aber eine vollständige Beschreibung von allem geht über den Rahmen dieses Artikels hinaus. Häufige Artefakte, die in der Regel ohne weitere Untersuchung ignoriert werden können, sind: ADCK4-NUMBL, SYN2-PPARG, DGKG-ETV5, ETV6-AXL, ETV1-ERG, ETV4-ETV1, FGFR3-PDGFRB, EGFR-NTRK1, RAF1-RET, ALK-TFEB, NOTCH1-RET, RELA-RET, NTRK3-ALK, BRAF ADAM-TS8, und FCGR2C-MAST. - Visualisieren Sie die unterstützenden Lesevorgänge für jede potenzielle Fusion, indem Sie auf den Link Visualisieren in der Benutzeroberfläche klicken, der den Benutzer zu einer webbasierten JBrowse-Ansicht von Anhäufungen einzelner fusionsunterstützender Lesevorgänge führt. Bestätigen Sie, dass die Lesevorgänge im Allgemeinen frei von Inübereinstimmungen sind (obwohl ein gewisses Rauschen zu erwarten ist), dass ein erheblicher Teil (idealerweise >30 Basen) der Lesevorgänge am Fusionspartner ausgerichtet ist und dass Sequenzen unmittelbar neben dem Bruchpunkt zwischen den Genen und die Primer-Bindungsstellen sind frei von Einfügungen oder Löschungen. Vergewissern Sie sich, dass die ausgerichtete Sequenz den 3' Teil der Primerbindungssequenzen für Primer enthält, die die Fusionslesevorgänge unterstützen (wenn 3' Portionen nicht enthalten sind, kann dies ein Hinweis auf eine Fehlanlösung sein).
- Wenn Codierungssequenzen beider Gene an der Fusion beteiligt sind, stellen Sie sicher, dass der 3'-Partner im Rahmen bleibt. Klicken Sie auf den Link Übersetzung in der Schnittstelle (der für jede Referenzsequenzkombination einen True- oder False-Status gibt) und bestätigen Sie auch manuell, dass die Fusion durch die Inspektion der aufgerufenen Haltepunkte in einem Genom-Browser. Die aufgerufenen Haltepunkte können bestimmt werden, indem Sie mit der Maus über die roten Punkte im Fusionsschema zeigen.
ANMERKUNG: Da die meisten (aber nicht alle) genomischen Haltepunkte für legitime Fusionen in intronischen Regionen auftreten und dazu führen, dass ganze Exons zusammengesponen werden, werden Fusionen, bei denen Exongrenzen die Haltepunkte für beide Partner umfassen, in der Regel mit einem höheren Grad betrachtet. Vertrauen. Da es jedoch viele veröffentlichte Beispiele für mittelexonische Haltepunkte in Fusionen gibt, sollte dies nicht als absolute Sitten bei der Interpretation einer Fusion herangezogen werden. - Stellen Sie für jede Fusion manuell sicher, dass Sequenzen neben dem Haltepunkt nicht homologe zu den nächsten erwarteten zusammenhängenden Basen für jeden Partner sind. Inspizieren Sie alle möglichen zusammenhängenden Exons in einem Genom-Browser.
HINWEIS: Eine häufige Quelle der artefaktischen Fusion ist Fehlausrichtung oder Fehlgrundierung aufgrund von Homologie zwischen zwei Genpartnern, und dies wird nicht immer vom System über die oben beschriebenen Symbole aufgerufen.
- Prüfen Sie sorgfältig jede aufgerufene Fusion unter der Registerkarte Starke Beweise (die Mehrheit der starken Beweisfusionen, die vom System aufgerufen werden, sind artefaktll). Scannen Sie auch die schwachen Evidenz Fusion bin, obwohl das Vorhandensein einer nicht-artifactual Fusion in diesem Behälter ist ein extrem seltenes Ereignis. Um die Gültigkeit einer Fusion zu bewerten, beachten Sie zunächst die Metriken "Lesevorgänge" (-/%) und "Sites starten".
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Representative Results
In Abbildung 3, Abbildung 4 und Abbildung 5 sind Screenshots aus der Analyse-Benutzeroberfläche zu sehen, die die Ergebnisse einer Lungenadenokarzinomprobe zeigen. In Abbildung 3wird die Stichprobenzusammenfassung (oben) angezeigt, die die so genannten starken Evidenzfusionen sowie den QC-Status (rot eingekreist) auflistet. Die ADCK4-NUMBL-Fusion (von denen 3 Isoformen aufgeführt sind) wird sofort ignoriert, da es sich um ein persistentes transkriptionsdurchlesendes Ereignis handelt (notiert durch die unterbrochenen Kreissymbole neben den Auflistungen). Der Unterr der Abbildung 3 ist ein Screenshot der Seite Statistik lesen. Besonders informative Metriken sind grün eingekreist. Die kritische QC-Metrik, die die Pass/Fail-Eigenschaft des Beispiels bestimmt, wird rot hervorgehoben (dies ist die Metrik, die den Pass/Fail-Status in der obigen Zusammenfassung vorschreibt). Liegt dieser Wert unter 20, gilt ein negatives Fusionsergebnis als "uninformativ". Abbildung 4 und Abbildung 5 sind Screenshots der Fusionsschemata (oben) und JBrowse-Ansichten von Fusionsunterstützenden Lesevorgängen (unten) für die beiden Fusionen, die eine weitere Untersuchung rechtfertigten. Die KIF5B-RET-Fusion (Abbildung 4) zeigt eine hohe Anzahl von unterstützenden Lesevorgängen, einen hohen % der Lesevorgänge aus dem Primer, der die Fusion unterstützt, und eine hohe Anzahl von Startstandorten. Darüber hinaus sind mehrere zusammenhängende Exons des Fusionspartners (KIF5B) in der Ausrichtung enthalten, die Fusion wurde als im Rahmen überprüft, und die Lesevorgänge, die die Fusion unterstützen, sind in der Regel frei von Missverhältnis. Aus diesen Gründen gilt die Fusion als real und meldepflichtig. Die LOC101927681-PDGFRB-Fusion (Abbildung 5) zeigt niedrigere Unterstützende Metriken. Darüber hinaus ist der Teil der Lesezuordnung zum Partner relativ kurz und enthält eine hohe Fehlerquote, was stark auf eine Fehlausrichtung und einen artefaktischen Fusionsaufruf hindeutet. Schließlich ist die intronische Sequenz von PDGFRB enthalten, was weiter auf ein Artefakt hindeutet (die meisten, aber nicht alle, legitimen Fusionen bestehen ausschließlich aus Sequenzen, die den Kodierungsregionen beider Gene zugeordnet sind). Aus diesen Gründen wird diese Fusion als Artefakt betrachtet und ist nicht meldepflichtig.
Abbildung 1: Schematische Darstellung des AMP-Ansatzes. Herkömmliche ampliconvermittelte Ansätze zur Zielanreicherung werden durch die Tatsache begrenzt, dass Primer für alle Fusionspartner benötigt werden. So werden neue Fusionspartner nicht erkannt. In AMP ist der gegnerische Primer spezifisch für den Adapter, so dass neuartige Partner erkannt werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Korrelation zwischen PreSeq QC-Score und QC nach der Sequenzierung. Die PreSeq Ct und die durchschnittlichen eindeutigen Startsites pro GSP2 Control-Werten wurden für eine Reihe von 100 Stichproben korreliert. Im Allgemeinen korrelieren, wie erwartet, niedrige PreSeq-Werte mit höheren SS/GSP2-Werten (beide sind Indikatoren für eine gute RNA-Qualität). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Beispielzusammenfassung und Lesen von Statistikansichten. Oben: Ansicht einer Beispielzusammenfassung in der Benutzeroberfläche mit starken Beweisfusionen aufgelistet. Unten: Ansicht der Seite "Lesestatistiken" in der Benutzeroberfläche. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Beispiel für einen legitimen Fusionsaufruf. Oben: Ansicht des Fusionsschemas in der Benutzeroberfläche. Unten: JBrowse-Ansicht einzelner Lesevorgänge, die die Fusion unterstützen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Beispiel für einen artefaktischen Fusionsaufruf. Oben: Ansicht des Fusionsschemas in der Benutzeroberfläche. Unten: JBrowse-Ansicht einzelner Lesevorgänge, die die Fusion unterstützen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| AKT3 | EWSR1 | NOTCH1 | PRKCA |
| Alk | FGFR1 | NOTCH2 | PRKCB |
| ARHGAP26 | FGFR2 | NRG1 | RAF1 |
| Axl | FGFR3 | NTRK1 | Rela |
| Braf | Fgr | NTRK2 | Ret |
| BRD3 | INSR | NTRK3 | ROS1 |
| BRD4 | MAML2 | NUMBL | RSPO2 |
| Egfr | MAST1 | NUTM1 | RSPO3 |
| Erg | MAST2 | PDGFRA | Tert |
| ESR1 | Traf | PDGFRB | TFE3 |
| ETV1 | MSMB | PIK3CA | TFEB |
| ETV4 | moschus | PKN1 | THADA |
| ETV5 | MYB | Pparg | TMPRSS2 |
| ETV6 | |||
| Der Assay enthält genspezifische Primer zu verschiedenen Exonen (und einigen Introns) in den oben genannten 53 Genen. | |||
Ergänzende Tabelle 1: Liste der Gene, für die genspezifische Primer in den Assay aufgenommen werden (zu verschiedenen Exons und Introns).
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Discussion
Verankerte Multiplex-PCR-basierte Zielanreicherung und Bibliotheksvorbereitung, gefolgt von der Sequenzierung der nächsten Generation, eignet sich gut für die Multiplex-Genfusionsbewertung in klinischen Tumorproben. Durch die Konzentration auf DEN RNA-Eingang und nicht auf die genomische DNA wird die Notwendigkeit vermieden, große und sich wiederholende Introns zu sequenzieren. Da dieser Ansatz genfusionen unabhängig von der Identität des Fusionspartners verstärkt, werden neue Fusionen nachgewiesen. Dies ist ein kritischer Vorteil im klinischen Bereich, und es gab viele Beispiele für umsetzbare neuartige Genfusionen, die durch AMP identifiziert wurden, die in der Literatur21,22,23,24berichtet wurden. 25.
Da der Assay RNA-basiert ist, ist es wichtig, die RNA-Qualität in Proben während der Verarbeitung zu erhalten. Es ist auch wichtig zu bestimmen, welche Proben EINE RNA-Sequenzierung produziert haben, die zu schlecht ist, um negativen Fusionsergebnissen zu vertrauen. Dies wird durch die Auswertung von Sequenzierungsdaten von Primern auf vier Haushaltsgene erreicht. Wenn die Sequenzierung dieser Gene schlecht ist, werden negative Fusionsergebnisse als uninformativ betrachtet. Darüber hinaus ist es angesichts der Komplexität und Der Vielzahl von Nassbankschritten im Assay wichtig, in jedem Assay-Lauf eine Fusions-Positiv-Steuerung einzubeziehen. Auf diese Weise werden kompromittierte Assay-Läufe durch die Analyse der erwarteten Fusionsereignisse in der Kontrolle sichtbar.
Wie bei allen Amplicon-basierten Ansätzen ist AMP in hohem Maße auf die individuelle Primer-Performance angewiesen. Bei der Bewertung mehrerer Exons mehrerer Gene ist es unvermeidlich, dass einige Primer nicht so gut funktionieren wie andere. Daher ist es für Benutzer wichtig zu wissen, wo der Assay aufgrund von Primer-Ineffizienz unterschneidet. Darüber hinaus erfordern NGS-basierte Assays eine komplexe bioinformatische Datenanalyse. Wenn die verwendeten Algorithmen nicht durchdacht konzipiert sind, sind falsch-negative und falsch-positive Ergebnisse wahrscheinlich. Es ist sehr wichtig, dass alle Genfusionen, die von Analysealgorithmen aufgerufen werden, vom Benutzer manuell inspiziert werden.
Mit einer ständig wachsenden Liste von umsetzbaren Genfusionen, die in klinischen Tumorproben bewertet werden sollten, wird die Verwendung von Multiplex-Assays wie AMP in klinischen Laboratorien weiter zunehmen. Zukünftige Anwendungen der Technik werden sich wahrscheinlich auf die Kombination von Fusion und Mutationsbewertung innerhalb eines einzigen Assays konzentrieren. Unabhängig vom molekularen Assay-Ansatz müssen sich Anwender stets der Assay-Beschränkungen bewusst sein und sollten immer Qualitätskontrollmetriken festlegen, um die Dateninterpretation zu leiten.
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Disclosures
D.L.A. hat Beratungshonorare von Bayer Oncology, Genentech, AbbVie und Bristol Myers Squibb erhalten. K.D.D hat gesponserte Reisen von ArcherDx erhalten.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der Molecular Pathology Shared Resource der University of Colorado (National Cancer Institute Cancer Center Support Grant No. P30-CA046934) und vom Colorado Center for Personalized Medicine.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mM Tris HCl pH 8.0 | IDT | 11-05-01-13 | Used for TNA dilution |
| 1M Tris pH 7.0 | Thermo Fisher | AM9850G | Used in library pooling |
| 25 mL Reagent Reservoir with divider | USA Scientific | 9173-2000 | For use with multi-channel pipetters and large reagent volumes |
| 96-well TemPlate Semi-Skirt 0.1mL PCR plate-natural | USA Scientific | 1402-9700 | Plate used for thermocycler steps |
| Agencourt AMPure XP Beads | Beckman Coulter | A63881 | Used in purification after several assay steps |
| Agencourt Formapure Kit | Beckman Coulter | A33343 | Used in TNA extraction |
| Archer FusionPlex Solid Tumor kit | ArcherDX | AB0005 | This kit contains most of the reagents necessary to perform library preperation for Illumina sequencing (kits for Ion Torrent sequencing are also available) |
| Cold block, 96-well | Light Labs | A7079 | Used for keeping samples chilled at various steps |
| Ethanol | Decon Labs | DSP-MD.43 | Used for bead washes |
| Library Quantification for Illumina Internal Control Standard | Kapa Biosystems | KK4906 | Used for library quantitation |
| Library Quantification Primers and ROX Low qPCR mix | Kapa Biosystems | KK4973 | Used for library quantitation |
| Library Quantification Standards | Kapa Biosystems | KK4903 | Used for library quantitation |
| Magnet Plate, 96-well (N38 grade) | Alpaqua | A32782 | Used in bead purificiation steps |
| MBC Adapters Set B | ArcherDX | AK0016-48 | Adapters that contain sample-specific indexes to enable multiplex sequencing |
| Micro Centrifuge | USA Scientific | 2641-0016 | Used for spinning down PCR tubes |
| MicroAmp EnduraPlate Optical 96 well Plate | Thermo-Fisher | 4483485 | Used for Pre-Seq QClibrary quantitation |
| Microamp Optical Film Compression Pad | Applied Biosystems | 4312639 | Used for library quantitation |
| Mini Plate Spinner | Labnet | MPS-1000 | Used for collecing liquid at bottom of plate wells |
| MiSeq Reagent Kit v3 (600 cycle) | Illumina | MS-102-3003 | Contains components necessary for a MiSeq sequencing run |
| MiSeqDx System | Illumina | NGS Sequencing Instrument | |
| Model 9700 Thermocycler | Applied Biosystems | Used for several steps during assay | |
| nuclease free water | Ambion | 9938 | Used as general diluent |
| Optical ABI 96-well PCR plate covers | Thermo-Fisher | 4311971 | Used for Pre-Seq QClibrary quantitation |
| PCR Workstation Model 600 | Air Clean Systems | BZ10119636 | Wet-bench assay steps performed in this 'dead air box' |
| Proteinase K | Qiagen | 1019499 | Used in TNA extraction |
| QuantStudio 5 | Applied Biosystems | LSA28139 | qPCR instrument used for PreSeq and library quantitation |
| Qubit RNA HS Assay Kit | Life Technologies | Q32855 | Use for determing RNA concentration in TNA samples |
| RNase Away | Fisher | 12-402-178 | Used for general RNase decontamination of work areas |
| Seraseq FFPE Tumor Fusion RNA Reference Material v2 | SeraCare | 0710-0129 | Used as the assay positive control |
| Sodium Hydroxide | Fisher | BP359-212 | Used in clean-up steps and for sequencing setup |
| SYBR Green Supermix | Bio Rad | 172-5120 | Component of PreSeq QC Assay |
| TempAssure PCR 8-tube Strips | USA Scientific | 1402-2700 | Used for reagent and sample mixing etc. |
| Template RT PCR film | USA Scientific | 2921-7800 | Used for covering 96-well plates |
| U-Bottom 96-well Microplate | LSP | MP8117-R | Used during bead purification |
References
- Mitelman, F., Johansson, B., Mertens, F. The impact of translocations and gene fusions on cancer causation. Nature Reviews Cancer. 7 (4), 233-245 (2007).
- Daley, G. Q., Van Etten, R. A., Baltimore, D. Induction of chronic myelogenous leukemia in mice by the P210bcr/abl gene of the Philadelphia chromosome. Science. 247 (4944), 824-830 (1990).
- Druker, B. J., et al. Activity of a specific inhibitor of the BCR-ABL tyrosine kinase in the blast crisis of chronic myeloid leukemia and acute lymphoblastic leukemia with the Philadelphia chromosome. New England Journal of Medicine. 344 (14), 1038-1042 (2001).
- Solomon, B. J., et al. First-line crizotinib versus chemotherapy in ALK-positive lung cancer. New England Journal of Medicine. 371 (23), 2167-2177 (2014).
- Shaw, A. T., et al. Crizotinib in ROS1-rearranged non-small-cell lung cancer. New England Journal of Medicine. 371 (21), 1963-1971 (2014).
- Drilon, A., et al. Efficacy of Larotrectinib in TRK Fusion-Positive Cancers in Adults and Children. New England Journal of Medicine. 378 (8), 731-739 (2018).
- Kawai, A., et al. SYT-SSX gene fusion as a determinant of morphology and prognosis in synovial sarcoma. New England Journal of Medicine. 338 (3), 153-160 (1998).
- de Alava, E., et al. EWS-FLI1 fusion transcript structure is an independent determinant of prognosis in Ewing's sarcoma. Journal of Clinical Oncology. 16 (4), 1248-1255 (1998).
- Pierron, G., et al. A new subtype of bone sarcoma defined by BCOR-CCNB3 gene fusion. Nature Genetics. 44 (4), 461-466 (2012).
- Papaemmanuil, E., et al. Genomic Classification and Prognosis in Acute Myeloid Leukemia. New England Journal of Medicine. 374 (23), 2209-2221 (2016).
- Arber, D. A., et al. The 2016 revision to the World Health Organization classification of myeloid neoplasms and acute. Blood. 127 (20), 2391-2405 (2016).
- Sanders, H. R., et al. Exon scanning by reverse transcriptase-polymerase chain reaction for detection of known and novel EML4-ALK fusion variants in non-small cell lung cancer. Cancer Genetics. 204 (1), 45-52 (2011).
- Camidge, D. R., et al. Optimizing the Detection of Lung Cancer Patients Harboring Anaplastic Lymphoma Kinase (ALK) Gene Rearrangements Potentially Suitable for ALK Inhibitor Treatment. Clinical Cancer Research. 16 (22), 5581-5590 (2010).
- Mino-Kenudson, M., et al. A novel, highly sensitive antibody allows for the routine detection of ALK-rearranged lung adenocarcinomas by standard immunohistochemistry. Clinical Cancer Research. 16 (5), 1561-1571 (2010).
- Suehara, Y., et al. Identification of KIF5B-RET and GOPC-ROS1 fusions in lung adenocarcinomas through a comprehensive mRNA-based screen for tyrosine kinase fusions. Clinical Cancer Research. 18 (24), 6599-6608 (2012).
- Davies, K. D., et al. Comparison of Molecular Testing Modalities for Detection of ROS1 Rearrangements in a Cohort of Positive Patient Samples. Journal of Thoracic Oncology. 13 (10), 1474-1482 (2018).
- Reeser, J. W., et al. Validation of a Targeted RNA Sequencing Assay for Kinase Fusion Detection in Solid Tumors. Journal of Molecular Diagnostics. 19 (5), 682-696 (2017).
- Beadling, C., et al. A Multiplexed Amplicon Approach for Detecting Gene Fusions by Next-Generation Sequencing. Journal of Molecular Diagnostics. 18 (2), 165-175 (2016).
- Mamanova, L., et al. Target-enrichment strategies for next-generation sequencing. Nature Methods. 7 (2), 111-118 (2010).
- Zheng, Z., et al. Anchored multiplex PCR for targeted next-generation sequencing. Nature Medicine. 20 (12), 1479-1484 (2014).
- Davies, K. D., et al. Dramatic Response to Crizotinib in a Patient with Lung Cancer Positive for an HLA-DRB1-MET Gene Fusion. JCO Precision Oncology. 2017 (1), (2017).
- Vendrell, J. A., et al. Detection of known and novel ALK fusion transcripts in lung cancer patients using next-generation sequencing approaches. Scientific Reports. 7 (1), 12510 (2017).
- Agaram, N. P., Zhang, L., Cotzia, P., Antonescu, C. R. Expanding the Spectrum of Genetic Alterations in Pseudomyogenic Hemangioendothelioma With Recurrent Novel ACTB-FOSB Gene Fusions. American Journal of Surgical Pathology. 42 (12), 1653-1661 (2018).
- Skalova, A., et al. Molecular Profiling of Mammary Analog Secretory Carcinoma Revealed a Subset of Tumors Harboring a Novel ETV6-RET Translocation: Report of 10 Cases. American Journal of Surgical Pathology. 42 (2), 234-246 (2018).
- Guseva, N. V., et al. Anchored multiplex PCR for targeted next-generation sequencing reveals recurrent and novel USP6 fusions and upregulation of USP6 expression in aneurysmal bone cyst. Genes Chromosomes and Cancer. 56 (4), 266-277 (2017).
