Onkogene Genfusionsdetektion mit verankerter Multiplex-Polymerase-Kettenreaktion gefolgt von Sequenzierung der nächsten Generation

Dieses Protokoll wird zum Nachweis von kritisch informativen Genfusionen für Patiententumorproben verwendet. Der Fusionsstatus von Dutzenden von Genen wird gleichzeitig in einem einzigen Test bewertet. Der Vorteil dieser Technik ist, dass ich Genfusionen unabhängig von der Identität des Fusionspartners aus Tumorproben identifizieren kann, die durch formelhafte Fixierung verarbeitet wurden.

Der Nachweis bestimmter Genfusionen in klinischen Tumorproben informiert direkt über Diagnose, Prognose und Behandlungsauswahl bei vielen Krebsarten. Es ist wichtig zu verstehen, dass viele Fusionen, die vom Analysealgorithmus aufgerufen werden, Artefakte sind. Die schwierigste Aufgabe beim Analysieren von Daten ist die Unterscheidung zwischen Artefakt und echten Fusionsaufrufen.

Beginnen Sie mit der Verdünnung der Gesamtennukleinsäure, um die gewünschte Konzentration von RNA zu erreichen. Für jede Probe 20 Mikroliter der Verdünnung in die zufälligen Grundierreagenz-Bandrohre in einem vorgekühlten Aluminiumblock übertragen und durch Sechs- bis Achtmales nach oben und unten mischen. Drehen Sie die Proben kurz herunter, übertragen Sie das gesamte Volumen auf eine 96-Well-PCR-Platte und versiegeln Sie sie mit Plattenversiegelungsfolie.

Legen Sie die Platte in einen Thermocycler ein, decken Sie sie mit dem Kompressionspad ab und schließen Sie den Deckel. Bei 65 Grad Celsius für fünf Minuten inkubieren. Nach der Inkubation das gesamte Volumen des zufälligen Grundierprodukts in die ersten Strangreagenzbandrohre übertragen.

Mischen Sie durch Pipettieren nach oben und unten und kurz nach unten drehen. Übertragen Sie das gesamte Volumen auf eine 96-Well-PCR-Platte und versiegeln Sie mit RT-Folie. Setzen Sie die Platte in den Thermocycler ein und führen Sie die Reaktion entsprechend den Manuskriptrichtungen aus.

Führen Sie die zweite Strang-cDNA-Synthese und Reparatur und LigationSchritt eins entsprechend den Manuskriptrichtungen durch und fahren Sie mit dem zweiten Ligationsschritt fort. Um den molekularen Barcode oder MBC AdapterStreifenrohre zu nummerieren, positionieren Sie die Rohre horizontal mit Scharnieren nach hinten und verwenden Sie einen permanenten Marker. Nehmen Sie die Perlenreinigungsplatte aus dem ersten Ligationsschritt und übertragen Sie 40 Mikroliter jeder Probe in die MBC Adapterstreifenrohre, wobei darauf geachtet wird, das Perlenpellet nicht zu stören.

Mischen Sie die Reagenzien durch Pipettieren, drehen Sie die Rohre herunter und übertragen Sie das gesamte Volumen auf die Ligationsstufe zwei Reagenzienbandrohre. Mischen Sie die Proben, drehen Sie sie nach unten, und legen Sie sie in einen Thermocycler-Block. Lassen Sie den beheizten Deckel ab und führen Sie den Thermocycler bei 22 Grad Celsius für fünf Minuten, gefolgt von 4 Grad Celsius halten.

Als nächstes bereiten Sie die Ligationsbereinigung Perlen vor, indem Sie sie wirbeln und 50 Mikroliter zu einem neuen Satz von PCR-Streifenröhren hinzufügen. Auf dem Magneten für eine Minute bebrüten und den Überstand entsorgen. Entfernen Sie die Streifenrohre vom Magneten und setzen Sie die Perlen in 50 Mikroliter Ligationsreinigungspuffer wieder auf, indem Sie nach oben und unten pfeifen.

Übertragen Sie das gesamte Probenvolumen aus dem zweiten Ligationsschritt in den Ligationsbereinigungsperlenstreifen. Wirbeln Sie die Proben zu mischen und lassen Sie sie bei Raumtemperatur für 10 Minuten. Wirbeln Sie die Probe einmal auf halbem Weg durch die Inkubation.

Anschließend wirbeln die Proben, spinnen Sie sie herunter und brüten eine Minute lang auf dem Magneten. Entsorgen Sie den Überstand und fügen Sie 200 Mikroliter frischer Ligationsreinigungspuffer hinzu. Wirbel zum Resuspendieren, Nachdrehen und Platzieren auf dem Magneten für eine Minute.

Nach den beiden Waschungen eine dritte Wäsche mit reinem Wasser anstelle von Puffer durchführen. Setzen Sie die Perlen in 20 Mikrolitern von 5 Millimeter Natriumhydroxid aus und übertragen Sie die Proben auf eine 96-Well-PCR-Platte. Legen Sie die Platte in einen Thermocycler mit einem Kompressionspad und führen Sie sie bei 75 Grad Celsius für 10 Minuten, gefolgt von einem 4 Grad Celsius halten.

Sobald die Proben auf 4 Grad Celsius abgekühlt sind, legen Sie die Platte mindestens drei Minuten auf einen Magneten und fahren Sie mit der ersten PCR fort. Bereiten Sie die PCR-Reaktionen vor, indem Sie zwei Mikroliter GSP1-Primer zu jedem Bohrwert des ersten PCR-Reagenzstreifens hinzufügen. 18 Mikroliter des zweiten Ligationsreinigungsprodukts auf die ersten PCR-Reagenzbandrohre übertragen und durch Pipettieren nach oben und unten mischen.

Drehen Sie die Proben herunter und übertragen Sie sie auf eine 96-Well-PCR-Platte. Legen Sie sie in den Thermocycler und führen Sie PCR entsprechend den Manuskriptrichtungen aus. Fahren Sie mit der Perlenreinigung fort, indem Sie 20 Mikroliter des PCR-Produkts zu einer U-Bodenplatte hinzufügen, die mit 24 MikroliterReinigungsperlen pro Brunnen gefüllt ist.

Pipette nach oben und unten zu mischen und lassen Sie die Platte bei Raumtemperatur für fünf Minuten, dann inkubieren Sie die Platte auf dem Magneten für zwei Minuten. Entsorgen Sie den Überstand aus den Perlen und waschen Sie ihn zweimal mit 200 Mikrolitern 70% Ethanol. Nach der letzten Wäsche das gesamte Ethanol entfernen und die Probenluft zwei Minuten trocknen lassen.

Entfernen Sie die Platte vom Magneten und setzen Sie die Perlen in 24 Mikrolitern von 10 Millimeter NB-HCl und pH 8.0 wieder auf. Den Magneten für drei Minuten abbrüteund und dann die Platte für zwei Minuten wieder auf den Magneten legen. Beginnen Sie die Bibliotheksquantifizierung, indem Sie ein bis fünf Verdünnungen des zweiten PCR-Produkts in 10-Millimeter-Tris-HCl vorbereiten.

Folgen Sie diesem durch eine serielle Verdünnung von 1:199, 1:199 und 20:80 in 10 Millimeter Tris-HCl mit 05%Polysorbat. Richten Sie die Schlüssel-PCR ein, indem Sie jedem Brunnen einer optischen 96-Well-Platte sechs Mikroliter Master-Mix hinzufügen, gefolgt von vier Mikrolitern der entsprechenden Verdünnung oder Norm. Drehen Sie die Platte herunter und laden Sie sie in das qPCR-Instrument.

Führen Sie qPCR gemäß den Manuskriptanweisungen aus. Nachdem die Bibliotheksquantifizierung abgeschlossen ist, verdünnen Sie alle Bibliotheken auf zwei Nanomolar mit 10 Millimeter Tris-HCl. Erstellen Sie einen Bibliothekspool, indem Sie 10 Mikroliter jeder normalisierten Bibliothek zu einem 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenrohr kombinieren.

Als nächstes bereiten Sie die denaturierte Amplicon-Bibliothek, oder DAL-Pool, vor, indem Sie 10 Mikroliter des Bibliothekspools mit 10 Mikrolitern 0,2 normalem Natriumhydroxid kombinieren und die Mischung für fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Nach der Inkubation 10 Mikroliter 200 Millimeter Tris-HCl bei pH 7,0 hinzufügen, gefolgt von 970 MikroliterHT1 Hybridization Buffer. Machen Sie das endbelastbare Rohr, indem Sie 300 Mikroliter HT1, 25 Mikroliter 20 picomolar PhiX und 675 Mikroliter des DAL-Pools kombinieren.

Fügen Sie das gesamte Volumen des Lastrohrs in den Probenbrunnen der Sequenzer-Reagenzpatrone und laden Sie die Patrone in den Sequenzer. Wählen Sie zunächst die Positivkontrollprobe aus und stellen Sie sicher, dass alle erwarteten Fusionen und onkogenen Isoformen nachgewiesen und auf der Registerkarte “Starke Evidenz” aufgeführt sind. Überprüfen Sie für jedes Beispiel die durchschnittlichen eindeutigen Startsites pro GSP2-Steuerelementwert, und visualisieren Sie dann die unterstützenden Lesevorgänge für jede potenzielle Fusion, indem Sie auf den Link “Visualisieren” klicken, der den Benutzer zu einer webbasierten JBrowse-Ansicht von Anhäufungen einzelner Fusionsunterstützender Lesevorgänge führt.

Bestätigen Sie, dass die Lesevorgänge größtenteils frei von Inübereinstimmungen sind, aber mehr als 30 Basen der Lesevorgänge mit dem Fusionspartner übereinstimmen und dass Sequenzen, die an den Haltepunkt zwischen den Genen und Primerbindungsstellen angrenzen, frei von Einfügungen oder Löschungen sind. Es ist wichtig sicherzustellen, dass jede Anruffusion im Allgemeinen frei von Fehlausrichtung ist und dass ein erheblicher Teil der Lesevorgänge mit dem Fusionspartner übereinstimmt. Dieses Protokoll wurde verwendet, um den Genfusionsstatus in einer Lungenadenokarzinomprobe zu untersuchen.

Die Zusammenfassung zeigt starke Evidenzfusionen und die Seite Statistik lesen zeigt Metriken der Stichprobe. Diese Probe weist eine gute RNA-Qualität auf, so dass negative Ergebnisse gemeldet würden, wenn keine Fusionen gefunden würden. Ein legitimer Fusionsaufruf hat eine hohe Anzahl von unterstützenden Lesevorgängen, einen hohen Prozentsatz der Lesevorgänge aus dem Primer, der die Fusion unterstützt, und eine hohe Anzahl von Startsites.

Die Visualisierung der Lesevorgänge zeigt eine gute Ausrichtung auf große Bereiche des Fusionspartners. Umgekehrt weist ein artefaktischer Fusionsaufruf niedrigere unterstützende Metriken und eine hohe Fehlerquote bei der Zuordnung zum Partner auf. Artefaktische Fusionsaufrufe, die vom Analysealgorithmus getätigt werden, sind häufig.

Es ist wichtig, jeden Aufruf manuell zu inspizieren, um sicherzustellen, dass er eine echte Genfusion in der Patientenprobe darstellt.