Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

בגילוי המוליל אוסף והחיסונים של מטרהיזיפיאוס לתוך ריפיקו מיקרופלוס קרציות לקראת לימודי חסרי חוליות פתולוגיה

Published: June 1, 2019 doi: 10.3791/59899
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 1, 1,3, 1,2
1Post-Graduate Program in Veterinary Sciences, Federal Rural University of Rio de Janeiro, 2Department of Animal Parasitology, Federal Rural University of Rio de Janeiro, 3Department of Epidemiology and Public Health, Federal Rural University of Rio de Janeiro

Summary

ניתוח של שנתות המוליקמ מייצג מקור חשוב של מידע על איך כמה פתוגנים לגרום למחלה וכיצד קרציות מגיבים באופן חיסוני לזיהום זה. המחקר הנוכחי מדגים כיצד לחסן מפיץ פטרייתי ולאסוף המוליםקמ מ הנשים המנוסות מיקרופיאוס .

Abstract

קרציות הם מחייבים המטפנים ectop, ו המיקרופיקאוס מיקרופלוס יש חשיבות רבה ברפואה וטרינרית כי זה גורם לאנמיה, ירידה במשקל, פחת של עור בעלי חיים גם יכול לשמש וקטור של מספר פתוגנים. בשל העלויות הכרוכות בשליטה בטפילים אלה, נזק לסביבה הנגרמת על ידי שימוש לא הולם בחומר הדברה כימי, והתנגדות מוגברת נגד פרזיטים מסורתיים, שליטה אלטרנטיבית על קרציות, על ידי שימוש ב הפטריות הentomopathogenic, למשל, נחשבה לגישה מעניינת. עם זאת, מחקרים מעטים הוכיחו כיצד המערכת החיסונית של הקרצייה פועל כדי להילחם אלה entomopathogens. לפיכך, פרוטוקול זה מדגים שתי שיטות המשמשות לentomopathogen חיסונים לנקבות מנוגנות ושתי טכניקות המשמשות עבור אוסף המוליש וקצירת הומוציטים. החיסונים של פתוגנים בכניסה לרגל בגוף של שנתות הנשי מאפשר הערכה של הנשים פרמטרים ביולוגיים בניגוד החיסון בין scuulum לבין הקפיאולום, אשר לעתים קרובות לנזק עוגב של ג ' ו. מעבר לאוסף באמצעות הרגליים הניב התאוששות בנפח גבוה יותר. כמה מגבלות של שנתות המוליקמ האוסף ועיבוד כוללים i) שיעור גבוה של הפרעות הומוציטים, ii) המוליקמ זיהום עם שיבושים באמצע המעיים, ו iii) נמוך המוליקמ האחסון התאוששות. כאשר המוליקמ נאסף באמצעות חיתוך הרגל, המוליש לוקח זמן לצבור בפתיחת הרגל, העדפה תהליך קרישת דם. בנוסף, פחות הומוציטים מתקבלים באוסף דרך הרגל בהשוואה לאוסף הקודם, למרות שהשיטה הראשונה נחשבת קלה יותר לביצוע. הבנת התגובה החיסונית של קרציות בתיווך על ידי סוכני entomopathogenic מסייעת לחשוף פתוגנזה שלהם ולפתח מטרות חדשות עבור שליטה קרציות. תהליכי החיסונים המתוארים כאן דורשים משאבים טכנולוגיים נמוכים מאוד וניתן להשתמש בהם לא רק כדי לחשוף קרציות לאורגניזמים פתוגניים. באופן דומה, את האוסף של שנתות המוליקמ הוא עשוי לייצג את הצעד הראשון עבור מחקרים פיזיולוגיים רבים.

Introduction

שנתות הבקר, ריפיקאראוס מיקרופלוס, הוא hematophagus ectoparasite עם השפעה שלילית עצומה על בעלי חיים באזורים טרופיים. שנתות זה הוא וקטור של סוכני פתוגניים כגון babesia סטרפטקוקוס, babesia bigemina, ו אנקלמה מרגיא כי, בשילוב עם הנזק העוצר הישיר, יכול להפחית את ייצור החלב והבשר, לגרום לאנמיה ובסופו של דבר מוות. הפסדים שנגרמו על ידי הפקעון זה הוערך ב3,240,000,000 דולר בשנה בברזיל1. שיטות בר-קיימא הינן מבוקשת והשימוש בסוכני entomopathogenic נחשב חלופה מבטיחה להפחתת השימוש בחומרי הדברה כימיים2,3,4.

פטריות Entomopathogenic, כגון Metarhizium spp., הם אויבים טבעיים של פרוקי רגליים כולל קרציות, וכמה מבודד ניתן להשתמש כמו biocontrollers קרים. פתוגנים אלה באופן פעיל להדביק את המארח דרך קוטיקולה וליישב את גופם2,5,6. ככל שהזיהום מתפתח, תגובות סלולריות ומוסריות מתווכת על ידי המערכת החיסונית שנתות. ניתוח של שנתות המוליקמ הוא דיווח ככלי שימושי כדי להעריך את התגובות החיסונית לאחר מאתגרת עם פתוגנים7,8.

התגובה החיסונית של פרוקי רגליים מחולקת תגובות ומוראלית ו הסלולר. התגובה ההואתית כוללת תהליכים hemagglutination ייצור של חלבונים מיקרוביאלית/פפטידים, בעוד התגובה החיסונית הסלולר מבוצעת דרך הומוציטים. תאים אלה נמצאים המוליקמ מכל פרוקי רגליים והם דיווחו לפתח תפקיד הבעה במחקרים הכרוכים בתגובה החיסונית מולדת9, כפי שהוא קשור ישירות הפאגוציטוזה ותהליכים אנקפסולציה. לפיכך, מחקרים על הומוציטים יכולים לעזור לחקור את נתיב המוות ולהבין תהליכים כגון אוטומטי, אפופטוזיס, ו נמק. ביצורים מסוימים כמו bivalves, אוסף הומוציטים הפנים מגבלות כמו הפרעה לתא, נמוך נפח המוליש השיגה, וריכוז נמוך של תאים התאושש10. לעתים קרובות מאוד, בהתאם למתודולוגיה המוחלת, ריכוז מופחת של תאים מתקבל, להשפיע ישירות על התאים הקוונפיקציה וניתוח.

מספר הומוציטים במחזור המוליקמ הוא משתנה בין פרוקי רגליים שונים, זה יכול לשנות באותו מינים בשל שלבים פיסיולוגיים שונים כגון סקס, גיל, ואת השלב ההתפתחותי של פרוקי הרגליים11. הומוציטים ניתן גם למצוא דבק לאיברים מסוימים ולהיות שוחרר לתוך זרימת הדם רק לאחר תהליך הזיהום11. עם זאת, רוב המחקרים דיווחו על השימוש בחרקים, בעוד שקרציות נשארות פחות בחקר הפיזיולוגיה והפתולוגיה שלהם. למרות הפתוגן ואוסף המוליקמ בקרציות הם פחות טכניקות בשימוש, הקמת שיטות סטנדרטיות מסייעת לפיתוח מחקרים מדויקים יותר.

מטרת המחקר הנוכחי היתה להשוות את השיטות הנפוצות ביותר עבור המוליקמ אוסף וחיסונים של פתוגנים לתוך R. microplus קרציות, הערכת היעילות של רכישת המוליקמ רכש וריכוז הומוציטים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

קרציות ששימשו במחקר הנוכחי התקבלו ממושבה מלאכותית, הנסבית באוניברסיטה הכפרית הפדרלית של ריו דה ז'ניירו, שיטות שאושרו על ידי הוועדה על אתיקה לשימוש בעלי חוליות (CEUA-IV/UFRRJ037/2014).

1. שנתות הנקבות

  1. לאחר מפגש שנתות, לשטוף את הנקבות הנפוח באמצעות מי ברז לטבול אותם 0.5% (v/v) נתרן היפוכלוריט עבור 3 דקות ב-500 mL זכוכית בגביע הנמען, עבור היגיינה לקוטיקולה (איור 1), ואז לייבש את כל הנקבות באמצעות מגבות נייר סטרילי (איור 2).
  2. חלוקת נקבות קבוצות משוקלל הומוגנית (עם 20 הנקבות כל אחד): קבוצה אחת ללא כל טיפול, קבוצת שליטה אחת מחוסנת עם 5 μL של 0.1% polyoxyethylene ביתן מונאובית מימית פתרון (v/v), ואחד נגוע הקבוצה מחוסן עם 5 μL ב 1.0 x 10 שבעה בלסטונבגים mL-1.
    הערה: רק קרציות שאינן מטופלות שימשו לריכוז אמצעי האחסון והדימום. שלושה משכפל של כל קבוצה בוצעו.

2. גורמי פתוגנים בין הסטום לבין הקפיאולום

הערה: במחקר הנוכחי, שentomopathogenic פטריות שימשו כדוגמה.

  1. השעיה פטריות בלייסטינבגים ב 1 מ ל של 0.1% polyoxyethylene יתן מונאובית הפתרון מימית (v/v) ולהתאים לריכוז הסופי של 1.0 x 107 בלסטונבגים mL-1. הוסף הארכה של 5 μL Metarhizium (איור 3) ההשעיה על פני השטח של סרט פרפין פלסטיק.
    הערה: מטרהיזיאום בלסטונבגים הבולם הותאם באמצעות תא נויבאואר ́s. כדי להאיץ את תהליך החיסונים, בועות מרובות ניתן להוסיף משטח הסרט פרפין פלסטיק, כל בועה המתאימה 5 μL.
  2. השתמש 1 mL מזרק משובח במיוחד אינסולין ו מחט 0.3 מ"מ כדי למשוך את ההשעיה והאיחסן אותו לתוך הקרצייה. זכור להוציא את כל האוויר מתוך המזרק לפני השימוש בו.
  3. האיחסן 5 μL של התליה פטרייתי לתוך הנקבה שנתות בין scutum ו capitulum. איחסן נשים מקבוצת הביקורת עם 5 μL של 0.1% ביתן מימית הפתרון (v/v) ללא פטריה.
    הערה: נפח קטן של המוליקמ עשוי להיות נוכח על foramen לאחר החדרת מחט. . היזהר לא להיות בחיסון

3. החיסונים של פטריות entomopathogenic בין ירך הרגל לבין גוף הקרציה

  1. הנשים הנחסן עם הבולם פטרייתי (5 μL ב 1.0 x 107 blastospores mL-1) בין הרגל טיי ואת הגוף של הנקבה, באמצעות מזרק 1 mL במיוחד אינסולין משולב למחט 0.3 מ"מ. איחסן נשים מקבוצת הביקורת עם 5 μL של 0.1% ביתן מימית הפתרון (v/v).
    הערה: כאשר החיסון מבוצע בין טיי לבין הגוף הנשי, נפח קטן של המוליקמ ניתן להציג על טיי לאחר החדרת המחט. . היזהר לא להיות בחיסון

4. אוסף של המוליע

  1. השתמש בחלק הגומי של ערכת אינפוזיה מכונפת, שפופרת קפילר 0.3 מ"מ, וטיפ מסונן לביצוע אוסף המוליקמ.
  2. יש לשבש את הקוטיקולה הנשית בעזרת מחט 0.3 מ"מ.
  3. לאחר הפרעה, להחיל לחץ עדין על החלק הקדמי של הגוף הטיק. שימו לב לנוזל כמעט שקוף שיוצא מאתר השיבוש. לאסוף את המוליע על ידי יניקה הנוזל דרך קצה המסנן מצמידים לחלק גומי של ערכת עירוי מכונף, ו צינור 0.3 מ"מ נימי.
    הערה: אין ללחוץ על הגוף של הקרצייה כמעט בזמן השתק, כי זה עלול לשבש את המעיים ולזהם את המוליש. המתן עד שהלחץ העדין יכול לסלק את הנוזל ללא זיהום.

5. המוליקמ אוסף מתוך הרגל שנתות

  1. לשתק את הקרצייה, לחתוך חתיכת. רגל קדמית עם זוג מספריים
    הערה: ניתן לגזור את הרגליים אחת או יותר, כמו גם את אותה הרגל ניתן לגזור יותר מפעם אחת.
  2. הפעילו לחץ עדין על חלק גופו האחורי של הקרצייה. צפו בבועה נוזלית שקופה אשר מופיע באתר לחתוך ולאסוף אותו עם צינור נימי, כפי שמתואר בשלב 4.3.
    הערה: אין ללחוץ על הגוף של הקרצייה כמעט בזמן השתק, כי זה עלול לשבש את המעיים ולזהם את המוליש. המתן עד שהלחץ העדין יכול לסלק את הנוזל ללא זיהום.

6. עיבוד המוליש

  1. לאחר אוסף המוליקמ, להפקיד אותו 1.5 mL מיקרוצינוריות בעבר מילא 30 μL הקוקטייל פרוטאז ו 82 מאגר מלוחים μL. לשמור על המיקרוצינוריות על הקרח ברחבי אוסף המוליקמ.
  2. דגימות צנטריפוגה (500 x g עבור 3 דקות ב -4 ° c). גלולה רכה של הומוציטים ייווצר לאחר המוליקמ צנטריפוגה.
    הערה: עבור כימות המוליקמ, לכמת את נפח המוליקמ שהושג על ידי ספירת הנפח הכולל בתוך מיקרופופרת ולממש את עוצמת הקול של קוקטייל פרוטאז מאגר מלוחים.
  3. הסר בזהירות את הסופרנטנט (ללא תא המוליקמ). השהה מחדש בעדינות את התאים ב-, לדוגמה, התרבות L-15 של ליבוביץ הותאמה ל-pH 7.0-7.2. מכמת הומוציטים על ידי הצבת 10 μL של מושעה מחדש בתוך תא של נויבאואר.

7. הכנת שקופיות דגימת הומוציט

  1. תחתוך את הרגל הקדמית של הקרצייה. עם זוג מספריים
  2. הפעילו לחץ עדין על חלק גופו האחורי של הקרצייה. שימו לב לבועה נוזלית שקופה שתופיע באתר החתוך.
  3. להחיל את המוליקמ טיפות ישירות על שקופיות מיקרוסקופ נקי, לאחר מכן, להשתמש בשיטות מופקעים להכתים את התאים.
    1. כדי להכתים הומוציטים באמצעות Giemsa, אוויר יבש המוליקמ על השקופית עבור 30 דקות, לתקן אותו בטמפרטורת החדר עם מתנול עבור 3 דקות, וכתם בתמיסה Giemsa (1:9 יחס של פתרון המאגר של סורנסן, pH 7.2) עבור 30 דקות בטמפרטורת החדר. רוחצים את השקופיות עם מים זורמים כדי להסיר את עודף הצבע, האוויר יבש את השקופית ולהעריך את התאים ב-400 x במיקרוסקופ אופטי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

מאמר זה מתקרב לחיסון ושיטות גבייה המוליקמ על קרציות. לאחר החיסון בין ירך הרגל לגוף הנשי, ניתן לפרש חלק מהנוזל (המוליקמ) במהלך התהליך; עם זאת, חשוב לציין כי כאשר החיסון מסתיים, לא נמצאו נוזלים או רקמות בקצה המחט או באתר החיסונים, ומבטיחים כי ההשעיה הפטרייתית מחוסנת לחלוטין. כאשר תהליך החיסונים התבצע בצורה נכונה, החדרת המחט לא גרמה למותה של הנקבות הקרציות. מצד שני, קרציות מתו כ 48 h לאחר החיסון של הפטריה הentomopathogenic. החיסון בין הירך לבין הגוף הנשי יכול לגרום נזק לאיברים המתמחים בקרציות כגון ביניים והמאלפיגאנים tubules, בעוד הנזק לאיבר של ג'ין יכול להתרחש במהלך החיסון בין הסטום לבין capitulum.

כאשר שנתות בינוני מופרת על ידי המחט במהלך אוסף המוליקמ הקדמי, הנוזל המתקבל הוא אדום, לא חסר צבע. זה מצביע על אוסף לא נכון של המוליקמ. במקרים אלה, המוליש יהיה מושלך מאז הוא מזוהם עם תכולת המעיים.

אוסף המוליקמ הנכון הוא חיוני כדי לבצע את הניסויים ולקבל תוצאות אמינות. כאשר המוליקמ נאסף מפני לחתוך הרגליים שנתות (n = 20 קרציות שוקלת באופן מוחלט), נפח שהושג היה נמוך יותר המוליכה הכולל שהתקבלו מתוך האוסף הגב (n = 20 קרציות שוקלת באופן ברור) (איור 4). הוא הציע כי, בשל הנפח הנמוך של כל טיפה כי מושך את הרגל לחתוך, קרישה המוליקמ ניתן להציג לעתים קרובות במהלך תהליך זה של אוסף המוליקמ. זה עשוי להפריע לרעה ברכישת הומוציטים וסיווג (איור 5 ואיור 6). למרות ההישג הגבוה יותר של המוליקמ, הקולקציה הזאת נחשבת לקשה יותר לביצוע.

Figure 1
איור 1 : קרציות ' hygienization קוטיקולה. הנקבות מיקרופיקאוס בתוספת הנשים נשטפו באמצעות מי ברז שקוע ב 0.5% נתרן היפוכלוניט הפתרון (v/v) עבור 3 דקות בתוך הנמען בספל הזכוכית 500 mL. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2 : קרציות ' ייבוש קוטיקולה. בעזרת מגבות נייר סטרילי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3 : מטאהיזינום . בלסטונבגים . פטריות משמשות לשימוש בקרציות סרגל קנה מידה = 50 μm. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. 

Figure 4
איור 4 : גרף הנציגה הפגינו נפח המוליקמ שהושג עם כל שיטת הקולקטיטון. מיקרופיפאוס בתוספת המוליקמ כרך שהושג לאחר איסוף ברגל או ברגליים. בכל שיטה שימשו בריכה של 20 קרציות שקלו באופן ברור. קרציות אלה לא חוסנו בעבר. ערכים מתכוונים ± סטיית תקן ואחריו מכתב זהה אינם שונים סטטיסטית לאחר ניתוח של שונות (ANOVA) מבחן (P ≥ 0.05). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. 

Figure 5
איור 5 : הומוציטים ריכוז מושגת עם שיטת כל המוליקמ אוסף. בנוסף , הריכוז המיקרוציטים של הנגיף מקבל לאחר ההשעיה במדיום התרבותי L-15 של ליבוביץ ' לאחר איסוף הרגל או הרגליים. ערכים מתכוון ± סטיית התקן ואחריו מכתב זהה אינם שונים מבחינה סטטיסטית לאחר מבחן הואליס-ווליס (P ≥ 0.05). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. 

Figure 6
איור 6 : הומוציטים שנמצאו ב ריפיקאפייוס מיקרופלוס . למרוח את המוליקמ R. microplus הומוציטים היה מוכתם על ידי Giemsa. חיצים שחורים מציינים את התאים השונים ב שנתות המוליקמ. סרגל קנה מידה = 100 μm. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. 

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

החיסונים של פתוגנים הוא שימושי כאשר המחקר שואפת לחקור את הפעולה vivo של מיקרואורגניזמים במודלים פרוקי-רגליים ניסיוני כי זה מבטיח כי הפתוגן הוא בתוך המארח. ניתן להחיל את הטכניקה גם על מולקולות של החיסונים כגון RNA הפרעה (RNAi). החיסון בין הסטום לקפיאולום נחשב לקל יותר לביצוע, אך לעתים קרובות הוא מהווה נזק לאיבר המין של הג, ופוגע בכדאיות הביציות12,13. העוגב של ג. ג. ממוקם מבחינה אנטומית קרוב לחלקו הקדמי של הקפינום, והוא איבר חשוב לתנוחת ההטלה הקרציה14. בהתאם לכך, החיסון בין הרגל טיי לבין גוף האישה מתאים יותר אם המחקר דורש התבוננות בפרמטרים הביולוגיים של הנקבות מאחר והעוגב לא ייפגע. למרות שיטת החיסון בין ירך הרגל לבין גוף הקרצייה נחשבת לפגיעה קשה יותר ובקלות או לחשיפת האברים הפנימיים הקרציות, כגון המיבטן והמיפיגאנים tubules, כאשר הוא מבוצע היטב, הוא לא משבש את האברים הללו.

ניתוח המוליקמ הוא חיוני כדי להבין את המערכת החיסונית של פרוקי, כמו גם כדי להבין פתוגנזה15,16. בהתאם שנתות המוליקמ יכול לשמש כדי לחשוף את הפיזיולוגיה שנתות, להבטיח הנגועים בקרציות, להבין את האינטראקציות שנתות הפתוגן, ואת הסלולר ואת התגובה החיסונית מוסרית9,17,18.

תקתוק המוליקמ אוסף באמצעות חיתוך הרגל מדווח במספר מחקרים19,20,21. למרות שיטה זו היא פשוטה עם זיהום לא או נמוך מאוד המוליקמ, הוא נחשב פרודוקטיבי מונה עבור מחקרים הדורשים ריכוזים גבוהים של הומוציטים או כמויות גדולות של המוליקמ. מצד שני, ההוצאה הנכונה של אוסף המוליקמ באמצעות האזור הגבי של הנקבות הנפוחים הוא לא קל להשיג מאז הבטן תופסת כמעט את הגוף שנתות כולו, ולאחר שהוא המחט גורמת לזיהום המוליקמ. זיהום בשל שיבוש המעיים יכול להיות גם נצפתה כאשר הקרצייה נגוע באופן טבעי עם המון גבוה של המופילאתרים (כלומר, Babesia spp.), או בשלבים האחרונים של תהליך המוות שנגרם על ידי entomopathogens8. במקרים אלה, המוליקמ יהיה מושלך מאז הומוציטים ומנתח פלזמה יכול להיות מושפע.

המהירות צנטריפוגה של המוליקמ דגימות עבור קצירת הומוציטים הוא גם חשוב וישירות להשפיע על הריכוז הומוציטים, מאז השדה הקרוב ביותר צנטריפוגלי (RCF) מהירויות לתרום: i) תא גלולה קשה להשעות מחדש, ii) תאים הפרעה ושלישית) הומוציטים. הגלולה התא האידיאלי היא גלולה רכה קל להשהות. מסיבה זו, שימש הצנטריפוגה ב-500 x g למשך שלוש דקות ב-4 ° צ'8 . במחקר הנוכחי, הומוציטים הושעו מחדש במדיום תרבות ולא בתמיסת מלח מאגור פוספט (PBS) משום שמדיום התרבותי תומך ביכולת הקיום הטובה יותר של תאים.

השיטות המוצגות כאן עשויות לעמוד בפני מגבלות כאשר הן מוחלות על שלבים שאינם מתבגרים (זחל ונימפה) של קרציות או מבוגרים שאינם ניזונים. שיטת החיסונים, למשל, מוחל רק עבור נקבות מבוגרים מוכי המחט נזק בשלבים בלתי בוגרים ואולי לא האכילו קרציות מבוגרים. כדי לאפשר שלבים אלה, ייעשה שימוש במיקרומזרק. באופן דומה, אוסף המוליקמ דרך האזור הגבי הוא יעיל יותר כאשר להחיל קרציות נפוח, בעוד המוליקמ אוסף על ידי חיתוך הרגליים ניתן להשתמש במחקרים עם קרציות למבוגרים לא מוזנים או שלבים בלתי מפותחים. למרות זאת, מטרתנו כאן הייתה להראות שיטות שדורשות משאבים טכנולוגיים נמוכים מאוד. בנוסף, הטכניקה צנטריפוגה צריך להתבצע בכוח צנטריפוגה נמוך, כי כוח גבוה או זמן ספין מורחב יכול להזיק לתאים.

השיטות הידועות כאן יכולות לשמש כהנחיות למחקרים הכרוכים בחיסונים entomopathogens לקרציות ולקצירת המוליש/הומוציטים. הטכניקות המוצגות כאן דורשות משאבים טכנולוגיים נמוכים מאוד והינם צעדים קלאסיים למחקרים על פיזיולוגיה של הקרציות, הפתולוגיה ותגובת החיסון של הקרציות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgments

מחקר זה היה ממומן בחלקו על ידי המלון העליון (שכמיות) מברזיל, קוד כספים מספר 001. גלימות סיפקה מלגת דוקטורט עבור A.F. מרציאנו. אנו מודים למועצה הלאומית לפיתוח מדעי וטכנולוגי (CNPq) של ברזיל למתן מלגת דוקטורט לג פיורארוטי. מחקר זה היה נתמך גם על ידי מענקים של קרלוס חגיאס קרן Filho לחקר מדינת ריו דה ז'ניירו (FAPERJ) ו CNPq. V.R.E.P. Bittencourt הוא חוקר CNPq.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alkaline Hypochlorite solution Sigma-Aldrich A1727
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G8270-1KG
EDTA Synth 2706
Fetal Bovine Serum Gibco 16000036
Flexible rubber BD
Giemsa stain Sigma-Aldrich 48900-500ML-F
Glass capillary CTechGlass CT95-02
Insulin syringe (needle) BD SKU: 324910
KH2PO4 Vetec 60REAVET014512
Leibovitz's L-15 culture medium  Gibco 11415-064
Methanol Sigma-Aldrich 34860-1L-R
Microscope slides Kasvi K5-7105
Microtubes BRAND Z336769-1PAK
Na2HPO4 Vetec 60REAVET014593
NaCl Sigma-Aldrich S7653-1KG
Neubauer chamber  Kasvi K5-0111
Penicillin Gibco 15140163
Protease inhibitor cocktail Sigma-Aldrich P2714
Tween 80 Vetec 60REAVET003662

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Grisi, L., et al. Reassessment of the potencial economic impact of cattle parasites in Brazil. Revista Brasileira de Parasitologia Veterinária. 23 (2), 150-156 (2014).
  2. Schrank, A., Vainstein, M. H. Metarhizium anisopliae enzymes and toxins. Toxicon. 56 (7), 1267-1274 (2010).
  3. Camargo, M. G., et al. Metarhizium anisopliae for controlling Rhipicephalus microplus ticks under field conditions. Veterinary Parasitology. 223, 38-42 (2016).
  4. Perinotto, W. M. S., et al. In vitro pathogenicity of different Metarhizium anisopliae s.l. isolates in oil formulations against Rhipicephalus microplus. Biocontrol Science and Technology. 27 (3), 338-347 (2017).
  5. Pedrini, N., Crespo, R., Juarez, M. P. Biochemistry of insect epicuticle degradation by entomopathogenic fungi. Comparative Biochemistry and Physiology. Part C: Toxicology and Pharmacolpgy. 146 (1-2), 124-137 (2007).
  6. Ortiz-Urquiza, A., Keyhani, N. O. Action on the surface: Entomopathogenic fungi versus the insect cuticle. Insects. 4 (3), 357-374 (2013).
  7. Angelo, I. C., et al. Detection of serpins involved in cellular immune response of Rhipicephalus microplus challenged with fungi. Biocontrol Science and Technology. 24 (3), 351-360 (2014).
  8. De Paulo, J. F., et al. Rhipicephalus microplus infected by Metarhizium: unveiling hemocyte quantification, GFP-fungi virulence, and ovary infection. Parasitology Research. 117, 1847-1856 (2018).
  9. Marmaras, V. J., Lampropoulou, M. Regulators and signalling in insect haemocyte immunity. Cell Signal. 21, 186-195 (2009).
  10. Hinzmann, M. F., Lopes-Lima, M., Gonçalves, J., Machado, J. Antiaggregant and toxic properties of different solutions on hemocytes of three freshwater bivalves. Toxicological & Environmental Chemistry. 95, 790-805 (2013).
  11. Nation, J. L. Insect Physiology and Biochemistry. , University of Florida. Gainesville, FL. (2016).
  12. Gene, J. Mémoires de l'Académie royale des sciences. Torino. 9, 751 (1848).
  13. Lees, A. D., Beament, J. W. L. An organ waxing in ticks. The Quarterly Journal of the Mythic Society. 7, 291-332 (1948).
  14. Sonenshine, D. E., Roe, R. M. Biology of ticks. , Oxford University Press. Oxford, UK. (2014).
  15. Tan, J., et al. Characterization of hemocytes proliferation in larval silkworm Bombyx mori. Journal of Insect Physiology. 59 (6), 595-603 (2013).
  16. Bowden, T. J. The humoral immune systems of the American lobster (Homarus americanus) and the European lobster (Homarus gammarus). Fish Research. 186, 367-371 (2017).
  17. Sonenshine, D. E., Hynes, W. L. Molecular characterization and related aspects of the innate immune response in ticks. Frontiers in Bioscience. 13, 7046-7063 (2008).
  18. Tsakas, S., Marmaras, V. Insect immunity and its signaling: an overview. Invertebrate Survival Journal. 7, 228-238 (2010).
  19. Burgdorfer, W. Hemolymph Test. A technique for detection of Rickettsiae in ticks. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 19, 1010-1014 (1970).
  20. Dunham-Ems, S. M., et al. Live imaging reveals a biphasic mode of dissemination of Borrelia burgdorferi within ticks. Journal of Clinical Investigation. 119, 3652-3665 (2009).
  21. Patton, T. G., et al. Saliva, salivary gland, and hemolymph collection from Ixodes scapularis ticks. Journal of Visualized Experiments. 60, e3894 (2012).

Tags

אימונולוגיה וזיהום סוגיה 148 זיהום פטרייתי שנתות הומוציטים תגובה חיסונית פרוקי רגליים דגם מארח אימונולוגיה
בגילוי המוליל אוסף והחיסונים של <em>מטרהיזיפיאוס </em>לתוך ריפיקו מיקרופלוס קרציות לקראת לימודי חסרי חוליות פתולוגיה <em></em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fiorotti, J., Gôlo, P. S.,… More

Fiorotti, J., Gôlo, P. S., Marciano, A. F., Camargo, M. G., Angelo, I. C., Bittencourt, V. R. E. P. Disclosing Hemolymph Collection and Inoculation of Metarhizium Blastospores into Rhipicephalus Microplus Ticks Towards Invertebrate Pathology Studies. J. Vis. Exp. (148), e59899, doi:10.3791/59899 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter