Summary
A análise da hemolinfa de carrapato representa uma importante fonte de informações sobre como alguns patógenos causam doenças e como os carrapatos respondem imunologicamente a essa infecção. O presente estudo demonstra como inocular propágulos fúngicos e coletar hemolinfas de fêmeas de Rhipicephalus MICROPLUS ingurgizadas.
Abstract
Carrapatos são obrigatórios ectoparasitas hematófagos e Rhipicephalus MICROPLUS tem grande importância na medicina veterinária porque causa anemia, perda de peso, depreciação do couro dos animais e também pode atuar como um vetor de vários patógenos. Devido aos custos exorbitantes para controlar esses parasitas, danos ao meio ambiente causados pelo uso inadequado de acaricidas químicos, e o aumento da resistência contra parasiticidas tradicionais, controle alternativo de carrapatos, pelo uso de os fungos entomopatogénicos, por exemplo, foram considerados uma aproximação interessante. No entanto, poucos estudos demonstraram como o sistema imunológico do carrapato atua para combater esses entomopatógenos. Portanto, este protocolo demonstra dois métodos utilizados para a inoculação de entomopatógenos em fêmeas ingurgedadas e duas técnicas utilizadas para coleta de hemolinfas e hemócitos. A inoculação de patógenos na inserção da perna no corpo da fêmea do carrapato permite a avaliação de parâmetros biológicos femininos diferentemente da inoculação entre o Scutum e o capitulo, que freqüentemente danifica o órgão de Gené. A coleção dorsal do hemolinfa rendeu uma recuperação mais elevada do volume do que a coleção através das pernas. Algumas limitações da coleta e processamento de hemolinfas de carrapato incluem i) altas taxas de ruptura de hemócitos, II) contaminação da hemolinfa com intestino médio interrompido e III) baixa recuperação do volume da hemolinfa. Quando a hemolinfa é coletada através do corte da perna, a hemolinfa leva tempo para se acumular na abertura da perna, favorecendo o processo de coagulação. Além disso, menos hemócitos são obtidos na coleta através da perna em comparação com a coleta dorsal, embora o primeiro método seja considerado mais fácil de ser realizado. Compreender a resposta imune em carrapatos mediados por agentes entomopatogênicos ajuda a revelar sua patogênese e desenvolver novos alvos para o controle do carrapato. Os processos de inoculação aqui descritos requerem recursos tecnológicos muito baixos e podem ser utilizados não apenas para expor carrapatos a microrganismos patogênicos. Da mesma forma, a coleta de hemolinfa de carrapato pode representar o primeiro passo para muitos estudos fisiológicos.
Introduction
O carrapato de bovinos, Rhipicephalus MICROPLUS, é um ectoparasita hematófago com um enorme impacto negativo sobre o gado em áreas tropicais. Este carrapato é o vetor de agentes patogénicos, como Babesia bovis, Babesia bigemina, e Anaplasma marginale que, combinada com o dano de hemofeeding direto, pode reduzir a produção de leite e carne, causar anemia e, finalmente, a morte. As perdas causadas por este ectoparasita foram estimadas em 3.240.000.000 dólares anuais no Brasil1. São exigidos métodos sustentáveis e a utilização de agentes entomopatogênicos é considerada uma alternativa promissora para reduzir o uso de acaricidas químicas2,3,4.
Fungos entomopatogênicos, como Metarhizium spp., são inimigos naturais de artrópodes, incluindo carrapatos, e alguns isolados podem ser usados como biocontroladores. Esses patógenos infectam ativamente o hospedeiro através da cutícula e colonizam ocorpo2,5,6. À medida que a infecção se desenvolve, as respostas celulares e humorais são mediadas pelo sistema imunológico do carrapato. A análise da hemolinfa do carrapato é relatada como uma ferramenta útil para avaliar as respostas imunes após o desafio com os patógenos7,8.
A resposta imune dos artrópodes é dividida em respostas humorais e celulares. A resposta humoral envolve processos de hemaglutinação e produção de proteínas/peptídeos antimicrobianos, enquanto a resposta imune celular é realizada através dos hemócitos. Estas células estão presentes na hemolinfa de todos os artrópodes e são relatadas para desenvolver um papel expressivo em estudos envolvendo a resposta imune inata9, pois está diretamente relacionado com os processos de fagocitose e encapsulação. Assim, estudos sobre hemócitos podem ajudar a investigar a via de morte e compreender processos como autofagia, apoptose e necrose. Em alguns invertebrados como bivalves, a coleção de hemócitos enfrenta limitações como ruptura celular, baixo volume de hemolinfa obtido e baixa concentração de células recuperadas10. Muito freqüentemente, dependendo da metodologia aplicada, a concentração reduzida de células é obtida, impactando diretamente na quantificação e análise das células.
O número de hemócitos circulantes na hemolinfa é variável entre os diferentes artrópodes e pode mudar na mesma espécie devido a diferentes estágios fisiológicos, como sexo, idade e estágio de desenvolvimento do artrópode11. Hemócitos também podem ser encontrados aderiram a alguns órgãos e ser liberado em circulação logo após o processo de infecção11. No entanto, a maioria dos estudos relatou uso de insetos, enquanto os carrapatos permanecem menos explorados quanto à sua fisiologia e patologia. Apesar da inoculação do patógeno e da coleta de hemolinfas em carrapatos são técnicas menos utilizadas, o estabelecimento de métodos padrão auxilia no desenvolvimento de estudos mais precisos.
O objetivo do presente estudo foi comparar os métodos mais utilizados para coleta de hemolinfas e inoculação de patógenos em carrapatos de R. MICROPLUS , avaliando a eficácia na concentração de hemolinfas e hemócitos.
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Protocol
Os carrapatos utilizados no presente estudo foram obtidos de uma colônia artificial, mantido na Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, que métodos foram aprovados pela Comissão de ética para o uso de animais vertebrados (ceua-IV/UFRRJ #037/2014).
1. carrapato fêmeas ingurgadas
- Após a coleta de carrapatos, lave as fêmeas ingurgitadas usando água da torneira e mergulhe-as em 0,5% (v/v) solução de hipoclorito de sódio por 3 min em um recipiente de vidro de 500 mL, para higiene da cutícula (Figura 1), depois seque todas as fêmeas usando toalhas de papel estéreis (Figura 2).
- Dividir fêmeas em grupos ponderados homogêneos (com 20 fêmeas cada): um grupo sem qualquer tratamento, um grupo controle inoculado com 5 μL de solução aquosa de polioxietileno sorbitano de 0,1% (v/v) e um grupo infectado inoculado com 5 μL em 1,0 x 10 7 blastosporos ml-1.
Nota: apenas carrapatos não tratados foram utilizados para concentração de volume e hemócitos. Foram realizadas três repetições de cada grupo.
2. inoculação de patógenos entre o Scutum e o capitulo
Nota: no presente estudo, foram utilizadas suspensões fúngicas entomopatogênicas como exemplo.
- Suspender blastosporos fúngicos em 1 mL de 0,1% de solução aquosa de monooleato de polioxietileno sorbitano (v/v) e ajustar a uma concentração final de 1,0 x 107 Blastosporos ml-1. Adicionar uma alíquota de 5 μL de blastósporos Metarhizium (Figura 3) suspensão à superfície de uma película de parafina plástica.
Nota: a suspensão de blastósporos de Metarhizium foi ajustada com uma câmara de Neubauer. Para acelerar o processo de inoculação, múltiplas bolhas podem ser adicionadas à superfície do filme de parafina plástica, cada bolha correspondendo a 5 μL. - Use uma seringa de insulina de 1 mL ultrafina e uma agulha de 0,3 mm para puxar a suspensão e inocular-la no carrapato. Lembre-se de tirar todo o ar da seringa antes de usá-lo.
- Inocular 5 μL de suspensão fúngica no carrapato feminino entre o Scutum e o capitulo. Inocular fêmeas do grupo controle com 5 μL de 0,1% de solução aquosa de monooleato de polioxietileno sorbitano (v/v) sem fungo.
Nota: um pequeno volume de hemolinfa pode estar presente no forame após a inserção da agulha. Tenha cuidado para não inocular o ar.
3. inoculação de fungos entomopatogênicos entre a coxa da perna e o corpo da fêmea do carrapato
- Inocular fêmeas com suspensão fúngica (5 μL em 1,0 x 107 blastosporos ml-1) entre o Tigh da perna e o corpo da fêmea, utilizando uma seringa de insulina de 1 ml ultrafina acoplada a uma agulha de 0,3 mm. Inocular fêmeas do grupo controle com 5 μL de solução aquosa de monooleato de polioxietileno sorbitano de 0,1% (v/v).
Nota: quando a inoculação de blastósporos de Metarhizium é realizada entre o Tigh da perna e o corpo da fêmea do carrapato, um pequeno volume de hemolinfa pode estar presente no Tigh após a inserção da agulha. Tenha cuidado para não inocular o ar.
4. hemolinfa dorsal coleção
- Use a parte de borracha de um conjunto de infusão alada, um tubo capilar de 0,3 mm e uma ponta filtrada para realizar a coleta de hemolinfa.
- Interrompa a cutícula dorsal fêmea usando uma agulha de 0,3 mm.
- Após a interrupção, aplique uma pressão suave na parte anterior do corpo do carrapato. Observe um líquido quase transparente puxando para fora do local da perturbação. Colete a hemolinfa sugando o líquido através da ponta do filtro acoplada à parte de borracha de um conjunto de infusão alado, e um tubo capilar de 0,3 mm.
Nota: não pressione o corpo do carrapato dificilmente durante a sua imobilização, pois isso pode perturbar o intestino médio e contaminar a hemolinfa. Aguarde até que a pressão suave possa expelir o fluido sem contaminação.
5. coleção do hemolymph do pé do tiquetaque
- Imobilizar o carrapato, cortar um pedaço de uma perna dianteira com um par de tesouras.
Nota: uma ou mais pernas podem ser cortadas, bem como, a mesma perna pode ser cortada mais de uma vez. - Aplique uma pressão suave na parte posterior do corpo do carrapato. Observar uma bolha líquida transparente que aparece no local de corte e coletá-la com o tubo capilar, conforme descrito na etapa 4,3.
Nota: não pressione o corpo do carrapato dificilmente durante a sua imobilização, pois isso pode perturbar o intestino médio e contaminar a hemolinfa. Aguarde até que a pressão suave possa expelir o fluido sem contaminação.
6. hemolinfa de processamento
- Após a coleta da hemolinfa, deposite-o em 1,5 mL de microtubos previamente preenchidos com 30 μL de coquetel de protease e 82 μL de tampão fisiológico. Mantenha os microtubos no gelo em toda a coleção da hemolinfa.
- Amostras de centrifugação (500 x g durante 3 min a 4 ° c). Uma pelota macia dos hemócitos será dada forma após A centrifugação do hemolinfa.
Nota: para a quantificação da hemolinfa, quantificar o volume de hemolinfa obtido contando o volume total dentro do microtubo e descontando o volume de coquetel de protease e tampão salino. - Retire cuidadosamente o sobrenadante (hemolinfa sem células). Ressuspender suavemente as células, por exemplo, a cultura L-15 de Leibovitz ajustada para pH 7,0-7,2. Quantifique os hemócitos colocando 10 μL de hemócitos ressuscitos em uma câmara de Neubauer.
7. preparação da corrediça da amostragem do hemocyte
- Corte a perna dianteira do carrapato com um par de tesouras.
- Aplique uma pressão suave na parte posterior do corpo do carrapato. Observe uma bolha líquida transparente que aparece no local de corte.
- Aplique as gotas do hemolinfa diretamente em corrediças limpas do microscópio, depois disso, use métodos apropriados para manchar as pilhas.
- Para manchar hemócitos usando Giemsa, secar a hemolinfa na lâmina por 30 min, corrigi-lo em temperatura ambiente com metanol por 3 min, e mancha na solução de Giemsa (1:9 proporção de solução tampão de Sorensen, pH 7,2) por 30 min à temperatura ambiente. Lave as lâminas com água corrente para remover o excesso de corante, seque o slide e avalie as células em 400x em um microscópio óptico.
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Representative Results
Este artigo aborda métodos de coleta de inoculação e hemolinfa aplicados a carrapatos. Após a inoculação entre a coxa da perna e o corpo da fêmea do carrapato, algum fluido (hemolinfa) pode ser secretado durante o processo; no entanto, é importante notar que, quando a inoculação é terminada, nenhum líquido ou tecido estiveram presentes na ponta da agulha ou no local de inoculação, assegurando que a suspensão fúngica foi completamente inoculada. Quando o processo de inoculação foi realizado corretamente, a inserção da agulha não ocasionou a morte do carrapato feminino. Por outro lado, os carrapatos morreram aproximadamente 48 h após a inoculação do fungo entomopatogénico. A inoculação entre a coxa da perna e o corpo do carrapato pode danificar órgãos internos do carrapato, como o intestino médio e os túbulos Malpighian, enquanto os danos ao órgão de gene podem ocorrer durante a inoculação entre o Scutum e o capitulo.
Quando o intestino médio do carrapato é interrompido pela agulha durante a coleta da hemolinfa dorsal, o fluido obtido é vermelho, não incolor. Isto indica uma coleção incorreta do hemolinfa. Nestes casos, a hemolinfa deve ser descartada, uma vez que está contaminada com conteúdo intestinal.
A coleção correta da hemolinfa é crucial para realizar adequadamente os experimentos e obter resultados confiáveis. Quando a hemolinfa foi coletada de pernas de carrapato cortado (n = 20 carrapatos homogeneamente pesados), o volume obtido foi menor que a hemolinfa total obtida a partir da coleta dorsal (n = 20 carrapatos homogeneamente pesados) (Figura 4). Sugere-se que, devido ao baixo volume de cada gota que puxa para fora do pé cortado, a coagulação do hemolinfa pode frequentemente ser atual durante este processo da coleção do hemolinfa. Isso pode interferir negativamente na aquisição e classificação dos hemócitos (Figura 5 e Figura 6). Apesar da maior realização do volume de hemolinfa, a coleta dorsal é considerada mais difícil de ser realizada.
Figura 1 : Carrapatos ' higienização da cutícula. As fêmeas de Rhipicephalus MICROPLUS foram lavadas com água da torneira e imersas em solução de hipoclorito de sódio a 0,5% (v/v) por 3 min em um recipiente de vidro de 500 ml. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Ticks ' secagem da cutícula. Rhipicephalus MICROPLUS as fêmeas inteiramente ingurgicadas foram secadas usando toalhas de papel estéreis. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Metarhizium blastosporos. Propaluges fúngicos utilizados na inoculação de carrapatos. Barra de escala = 50 μm. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 : Gráfico representativo demonstrando o volume de hemolinfa obtido com cada método de coleton. Volume do hemolinfa de Rhipicephalus MICROPLUS obtido após a coleção dorsal ou da perna. Para cada método, utilizou-se um conjunto de 20 carrapatos homogeneamente pesados. Estes carrapatos não foram previamente inoculados. Os valores médios ± desvio padrão seguido para a mesma letra não diferem estatisticamente após o teste de análise de variância (ANOVA) (P ≥ 0, 5). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5 : Concentração de hemócitos obtida com cada método de coleta de hemolinfas. A concentração de hemócitos de Rhipicephalus MICROPLUS obtida após a ressuscitura no meio de cultura L-15 de Leibovitz após a coleta dorsal ou de perna. Os valores médios ± desvio padrão seguido para a mesma letra não diferem estatisticamente após o teste de Kruskal-Wallis (P ≥ 0, 5). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6 : Hemócitos encontrados em Rhipicephalus MICROPLUS esfregaço de hemolinfa. Os hemócitos de R. MICROPLUS foram manchados por Giemsa. Setas pretas indicam as diferentes células no carrapato hemolinfa. Barra de escala = 100 μm. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
A inoculação de patógenos é útil quando o estudo objetiva investigar a ação in vivo de microrganismos em modelos experimentais de artrópodes, pois assegura que o patógeno está dentro do hospedeiro. A técnica também pode ser aplicada para inocular moléculas como a interferência do RNA (RNAi). A inoculação entre o Scutum e o capitulo é considerada mais fácil de realizar, mas freqüentemente danifica o órgão de Gené, prejudicando a viabilidade dos ovos12,13. O órgão de Gené está anatomicamente localizado perto da parte anterior do capitum, e é um órgão importante para a oviposição14do carrapato. Assim, a inoculação entre o Tigh da perna e o corpo da fêmea é mais adequada se o estudo exigir a observação dos parâmetros biológicos femininos, uma vez que o órgão de Gené não será ferido. Apesar do método de inoculação entre a coxa da perna e o corpo do carrapato ser considerado mais difícil e facilmente danificar ou expor os órgãos internos do carrapato, como o intestino médio e os túbulos Malpighian, quando é bem realizado, ele não interromperá esses órgãos.
A análise da hemolinfa é essencial para compreender o sistema imunológico do artrópodes,bem como para compreender a patogênese15,16. Assim, o carrapato hemolinfa pode ser usado para desvendar a fisiologia do carrapato, assegurar a infectividade do carrapato, compreender as interações entre o carrapato-patógeno e as respostas imunes celulares e humorais9,17,18.
Carrapato hemolinfa coleta através do corte da perna é relatado em vários estudos19,20,21. Apesar deste método ser simples com nenhuma ou muito baixa contaminação da hemolinfa, considera-se contraproducente para estudos que requerem altas concentrações de hemócitos ou grandes volumes de hemolinfa. Por outro lado, a correta execução da coleta de hemolinfa através da região dorsal de fêmeas ingurgidas não é fácil de conseguir, uma vez que o intestino ocupa quase todo o corpo do carrapato e a ruptura com a agulha provoca contaminação da hemolinfa. A contaminação devido ao rompimento do intestino também pode ser observada quando o carrapato é naturalmente infectado com altas cargas de hemoparasitas (viz., Babesia spp.), ou nas etapas finais do processo de morte causada por entomopatógenos8. Nestes casos, a hemolinfa deve ser descartada, pois hemócitos e análises plasmáticas podem ser afetadas.
A velocidade de centrifugação das amostras de hemolinfa para a colheita de hemócitos também é importante e influencia diretamente a concentração de hemócitos, uma vez que as altas velocidades do campo centrífugo relativo (RCF) contribuem para: i) a pelota celular difícil de ressuscitar, II) células interrupção, e III) degranulação de hemócitos. A pelota celular ideal é uma pelota macia fácil de ressuscitada. Por este motivo, utilizou-se a centrifugação a 500 x g por três minutos a 4 ° c8 . No presente estudo, os hemócitos foram reressuscitos em meio de cultura e não em solução salina tamponada por fosfato (PBS), pois o meio de cultura suporta melhor viabilidade celular.
Os métodos aqui apresentados podem enfrentar limitações quando aplicados a estágios de amadurecer (larva e ninfa) de carrapatos ou adultos não alimentados. O método de inoculação, por exemplo, só é aplicado para fêmeas ingurgeadas adultas porque o tamanho da agulha danificará estágios imaturos e possivelmente carrapatos adultos não alimentados. Para inocular estas fases, deve ser utilizado um microinjector. Da mesma forma, a coleta de hemolinfas através da região dorsal é mais efetiva quando aplicada a carrapatos ingurgilados, enquanto a coleta de hemolinfa por corte das pernas pode ser usada em estudos com carrapatos adultos não alimentados ou estágios imaturos. Apesar disso, nosso objetivo aqui foi mostrar métodos que exigem recursos tecnológicos muito baixos. Além disso, a técnica de centrifugação tem de ser realizada em baixa força de centrifugação porque a força elevada ou o tempo de rotação prolongado podem danificar as células.
Os métodos aqui divulgados podem ser utilizados como diretrizes para estudos envolvendo a inoculação de entomopatógenos em carrapatos e hemolinfa/hemócitos colados. As técnicas aqui apresentadas requerem recursos tecnológicos muito baixos e são passos clássicos para estudos sobre fisiologia do carrapato, patologia e resposta imune do carrapato.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este estudo foi financiado em parte pela coordenacão de aperfeiçoamento de pessoal de nível superior (CAPES) do Brasil, código financeiro 001. CAPES forneceu bolsa de doutorado para AF marciano. Agradecemos ao Conselho Nacional de desenvolvimento científico e tecnológico (CNPq) do Brasil pela prestação de bolsa de doutorado para J. Fiorotti. Esta pesquisa também foi apoiada por subsídios da Fundação Carlos Chagas filho para a pesquisa do estado do Rio de Janeiro (FAPERJ) e do CNPq. V.R.E.P. Bittencourt é pesquisador do CNPq.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alkaline Hypochlorite solution | Sigma-Aldrich | A1727 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-1KG | |
| EDTA | Synth | 2706 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000036 | |
| Flexible rubber | BD | ||
| Giemsa stain | Sigma-Aldrich | 48900-500ML-F | |
| Glass capillary | CTechGlass | CT95-02 | |
| Insulin syringe (needle) | BD | SKU: 324910 | |
| KH2PO4 | Vetec | 60REAVET014512 | |
| Leibovitz's L-15 culture medium | Gibco | 11415-064 | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860-1L-R | |
| Microscope slides | Kasvi | K5-7105 | |
| Microtubes | BRAND | Z336769-1PAK | |
| Na2HPO4 | Vetec | 60REAVET014593 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653-1KG | |
| Neubauer chamber | Kasvi | K5-0111 | |
| Penicillin | Gibco | 15140163 | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P2714 | |
| Tween 80 | Vetec | 60REAVET003662 |
References
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