Summary
L’analyse de l’hémolymphe des tiques représente une source importante d’information sur la façon dont certains agents pathogènes causent la maladie et comment les tiques réagissent immunologiquement à cette infection. La présente étude montre comment inoculer les propagules fongiques et recueillir l’hémolymphe des femelles de Rhipicephalus MICROPLUS engorgés.
Abstract
Les tiques sont obligatoires ectoparasites hematophages et Rhipicephalus MICROPLUS a une grande importance en médecine vétérinaire parce qu’il provoque l’anémie, perte de poids, l’amortissement du cuir des animaux et peut également agir comme un vecteur de plusieurs agents pathogènes. En raison des coûts exorbitants pour contrôler ces parasites, les dommages à l’environnement causés par l’utilisation inappropriée d’acaricides chimiques, et la résistance accrue contre les parasiticides traditionnels, le contrôle alternatif des tiques, par l’utilisation de les champignons entomopathogènes, par exemple, ont été considérés comme une approche intéressante. Néanmoins, peu d’études ont démontré comment le système immunitaire de la tique agit pour combattre ces entomopathogènes. Par conséquent, ce protocole démontre deux méthodes utilisées pour l’inoculation ENTOMOPATHOGÈNE dans les femelles engorgées et deux techniques utilisées pour la collecte de l’hémolymphe et la récolte des hémocytes. L’inoculation de pathogènes à l’insertion de la jambe dans le corps de la femelle de tique permet l’évaluation des paramètres biologiques femelles contrairement à l’inoculation entre le Scutum et le capitulum, qui endommage fréquemment l’orgue de Gené. La collecte de l’hémolymphe dorsale a donné une récupération plus importante que la collecte par les jambes. Certaines limitations de la collecte et de la transformation de l’hémolymphe des tiques comprennent i) des taux élevés de perturbation des hémocytes, II) une contamination par l’hémolymphe avec un intestin moyen perturbé et III) une faible récupération du volume de l’hémolymphe. Lorsque l’hémolymphe est recueilli par la coupe des jambes, l’hémolymphe prend du temps pour s’accumuler à l’ouverture de la jambe, favorisant le processus de coagulation. En outre, moins d’hémocytes sont obtenus dans la collection par la jambe par rapport à la collection dorsale, même si la première méthode est considérée plus facile à effectuer. La compréhension de la réponse immunitaire dans les tiques médiées par des agents entomopathogènes aide à dévoiler leur pathogenèse et à développer de nouvelles cibles pour le contrôle des tiques. Les processus d’inoculation décrits ici exigent des ressources technologiques très faibles et peuvent être utilisés non seulement pour exposer les tiques à des microorganismes pathogènes. De même, la collecte de l’hémolymphe des tiques peut représenter la première étape pour de nombreuses études physiologiques.
Introduction
La tique du bétail, Rhipicephalus MICROPLUS, est un hématophage ectoparasite avec un énorme impact négatif sur le bétail dans les zones tropicales. Cette tique est le vecteur d’agents pathogènes tels que Babesia bovis, Babesia bigemina, et Anaplasma marginale qui, combinée avec les dommages hémoalimentaires directs, peut réduire le lait et la production de viande, provoquer l’anémie et, finalement, la mort. Les pertes causées par cette ectoparasite ont été estimées en 3,24 milliards dollars annuellement au Brésil1. Des méthodes durables sont exigées et l’utilisation d’agents entomopathogènes est considérée comme une alternative prometteuse pour réduire l’utilisation des acaricides chimiques2,3,4.
Les champignons entomopathogènes, tels que les Métarhizium spp., sont des ennemis naturels des arthropodes, y compris les tiques, et certains isolats peuvent être utilisés comme biocontrôleurs. Ces agents pathogènes infectent activement l’hôte par la cuticule et colonisent leur corps2,5,6. Au fur et à mesure que l’infection se développe, les réponses cellulaires et humorales sont médiées par le système immunitaire des tiques. L’analyse de l’hémolymphe des tiques est signalée comme un outil utile pour évaluer les réponses immunitaires après les défis avec les pathogènes7,8.
La réponse immunitaire des arthropodes est divisée en réponses humorales et cellulaires. La réponse humorale implique des processus d’hémagglutination et la production de protéines/peptides antimicrobiens, tandis que la réponse immunitaire cellulaire est effectuée à travers les hémocytes. Ces cellules sont présentes dans l’hémolymphe de tous les arthropodes et sont rapportées pour développer un rôle expressif dans les études impliquant la réponse immunitaire innée9, car elle est directement liée aux processus de phagocytose et d’encapsulation. En conséquence, les études sur les hémocytes peuvent aider à enquêter sur la voie de la mort et comprendre les processus tels que l’autophagie, l’apoptose, et la nécrose. Chez certains invertébrés comme les bivalves, la collection des hémocytes fait face à des limitations comme la perturbation cellulaire, le faible volume d’hémolymphe obtenu et la faible concentration des cellules récupérées10. Très fréquemment, selon la méthodologie appliquée, une concentration réduite des cellules est obtenue, affectant directement la quantification et l’analyse des cellules.
Le nombre d’hémocytes circulant dans l’hémolymphe est variable parmi les différents arthropodes et il peut changer dans la même espèce en raison de différents stades physiologiques tels que le sexe, l’âge et l’étape de développement de l’arthropode11. Les hémocytes peuvent également être trouvés collés à certains organes et être libérés en circulation juste après le processus d’infection11. Néanmoins, la plupart des études ont rapporté utiliser des insectes, tandis que les tiques restent moins explorées en ce qui concerne leur physiologie et pathologie. Malgré l’inoculation des pathogènes et la collecte de l’hémolymphe dans les tiques sont des techniques moins utilisées, l’établissement de méthodes standard aide à développer des études plus précises.
Le but de la présente étude était de comparer les méthodes les plus utilisées pour la collecte de l’hémolymphe et l’inoculation des agents pathogènes dans les tiques de R. MICROPLUS , en évaluant l’efficacité dans l’acquisition de l’hémolymphe et la concentration des hémocytes.
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Protocol
Les tiques utilisées dans la présente étude ont été obtenues à partir d’une colonie artificielle, conduite à l’Université fédérale rurale de Rio de Janeiro, quelles méthodes ont été approuvées par le Comité d’éthique pour l’utilisation des vertébrés (CEUA-IV/UFRRJ #037/2014).
1. Cochez les femelles engorgées
- Après la cueillette des tiques, lavez les femelles engorgées à l’aide d’eau du robinet et immergez-les dans une solution d’hypochlorite de sodium à 0,5% (v/v) pendant 3 min dans un récipient en verre de 500 mL, pour l’hygiène des cuticules (figure 1), puis séchez toutes les femelles à l’aide de serviettes en papier stériles (figure 2).
- Diviser les femelles en groupes pondérés homogènes (avec 20 femelles chacune): un groupe sans traitement, un groupe témoin inoculé avec 5 μL de 0,1% de polyoxyeéthylène sorbitan monooléate solution aqueuse (v/v), et un groupe infecté inoculé avec 5 μL à 1,0 x 10 7 blastospores ml-1.
Remarque: seules les tiques non traitées ont été utilisées pour la concentration en volume et en hémocytes. Trois répétitions de chaque groupe ont été exécutées.
2. inoculation des agents pathogènes entre le Scutum et le capitule
NOTE: dans la présente étude, des suspensions fongiques entomopathogéniques ont été utilisées comme exemple.
- Suspendre les blastospores fongiques dans 1 mL de 0,1% de solution aqueuse de monooléate de polyoxyéthylène sorbitan (v/v) et ajuster à une concentration finale de 1,0 x 107 blastospores ml-1. Ajouter une aliquote de 5 μL de blastospores de Metarhizium (figure 3) à la surface d’un film de paraffine en plastique.
Remarque: la suspension des blastospores de Metarhizium a été ajustée à l’aide d’une chambre Neubauer. Pour accélérer le processus d’inoculation, plusieurs bulles peuvent être ajoutées à la surface du film de paraffine en plastique, chaque bulle correspondant à 5 μL. - Utiliser une seringue d’insuline ultra fine de 1 mL et une aiguille de 0,3 mm pour tirer la suspension et l’inoculer dans la tique. N’oubliez pas de retirer tout l’air de la seringue avant de l’utiliser.
- Ensemencez 5 μL de suspension fongique dans la femelle de la tique entre le Scutum et le capitule. Ensemencez des femelles du groupe témoin avec 5 μL de 0,1% de polyoxyeéthylène sorbitan monooléate solution aqueuse (v/v) sans champignon.
Remarque: un petit volume d’hémolymphe peut être présent sur le foramen après l’insertion de l’aiguille. Veillez à ne pas inoculer l’air.
3. inoculation de champignons entomopathogènes entre la cuisse de la jambe et le corps de la femelle de la tique
- Ensemencez les femelles avec une suspension fongique (5 μL à 1,0 x 107 blastospores ml-1) entre le Tigh de la jambe et le corps de la femelle, à l’aide d’une seringue d’insuline ultra fine de 1 ml couplée à une aiguille de 0,3 mm. Inoculer des femelles du groupe témoin avec 5 μL de solution aqueuse de monooléate de polyoxyéthylène sorbitane de 0,1% (v/v).
Remarque: lorsque l’inoculation de blastospores de Metarhizium est effectuée entre le Tigh de la jambe et le corps de la femelle de la tique, un petit volume d’hémolymphe peut être présent sur le Tigh après l’insertion de l’aiguille. Veillez à ne pas inoculer l’air.
4. prélèvement de l’hémolymphe dorsale
- Utilisez la partie en caoutchouc d’un ensemble de perfusion ailée, un tube capillaire de 0,3 mm et une pointe filtrée pour effectuer la collecte de l’hémolymphe.
- Perturber la cuticule dorsale femelle à l’aide d’une aiguille de 0,3 mm.
- Après perturbation, appliquez une légère pression sur la partie antérieure du corps de la tique. Observez un liquide presque transparent sortant du site perturbateur. Recueillir l’hémolymphe en suçant le liquide à travers la pointe du filtre couplée à la partie en caoutchouc d’un ensemble de perfusion ailée, et un tube capillaire de 0,3 mm.
Remarque: ne pas presser le corps de la tique à peine pendant son immobilisation, car cela peut perturber l’intestin moyen et contaminer l’hémolymphe. Attendre que la pression douce puisse expulser le fluide sans contamination.
5. collection hémolymphe de la jambe de la tique
- Immobilisez la tique, coupez un morceau d’une jambe avant avec une paire de ciseaux.
Remarque: une ou plusieurs jambes peuvent être coupées, ainsi que, la même jambe peut être coupée plus d’une fois. - Appliquez une légère pression sur la partie postérieure du corps de la tique. Observez une bulle liquide transparente qui s’affiche sur le site de coupe et collectez-la avec le tube capillaire, comme décrit à l’étape 4,3.
Remarque: ne pas presser le corps de la tique à peine pendant son immobilisation, car cela peut perturber l’intestin moyen et contaminer l’hémolymphe. Attendre que la pression douce puisse expulser le fluide sans contamination.
6. traitement de l’hémolymphe
- Après la collecte de l’hémolymphe, le déposer dans des microtubes de 1,5 mL préalablement remplis de 30 μL de cocktail protéase et de 82 μL de tampon physiologique. Gardez les microtubes sur la glace tout au long de la collection d’hémolymphe.
- Centrifuger les échantillons (500 x g pendant 3 min à 4 ° c). Une pastille molle d’hémocytes sera formée après la centrifugation de l’hémolymphe.
NOTE: pour la quantification de l’hémolymphe, quantifier le volume d’hémolymphe obtenu en comptant le volume total à l’intérieur du microtube et en décomptant le volume de cocktail protéase et de tampon salin. - Retirer délicatement le surnageant (hémolymphe sans cellule). Resuspendre doucement les cellules dans, par exemple, la culture L-15 de Leibovitz ajustée à pH 7,0-7,2. Quantifier les hémocytes en plaçant 10 μL d’hémocytes resuspendus dans une chambre Neubauer.
7. préparation des lames d’échantillonnage des hémocytes
- Coupez la jambe avant de la tique avec une paire de ciseaux.
- Appliquez une légère pression sur la partie postérieure du corps de la tique. Observez une bulle liquide transparente qui s’affiche sur le site de coupe.
- Appliquer les gouttes d’hémolymphe directement sur les lames de microscope propres, après cela, utiliser des méthodes appropriées pour tacher les cellules.
- Pour colorer les hémocytes à l’aide de Giemsa, sécher à l’air l’hémolymphe sur la glissière pendant 30 min, la fixer à température ambiante avec du méthanol pendant 3 min, et la tache dans la solution de Giemsa (1:9 rapport de la solution tampon de Sorensen, pH 7,2) pendant 30 min à température ambiante. Lavez les lames avec de l’eau courante pour enlever l’excès de colorant, sécher à l’air la glissière et évaluer les cellules à 400x dans un microscope optique.
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Representative Results
Cet article aborde les méthodes de prélèvement de l’inoculation et de l’hémolymphe appliquées aux tiques. Après l’inoculation entre la cuisse de jambe et le corps de la femelle de tique, un certain liquide (hémolymphe) peut être sécrété pendant le processus; Cependant, il est important de noter que lorsque l’inoculation est terminée, aucun liquide ou aucun tissu n’est présent dans l’embout de l’aiguille ou au site d’inoculation, ce qui garantit que la suspension fongique a été complètement inoculé. Lorsque le processus d’inoculation a été correctement effectué, l’insertion de l’aiguille n’a pas provoqué la mort des femelles de tique. D’autre part, les tiques sont mortes environ 48 h après l’inoculation du champignon entomopathogène. L’inoculation entre la cuisse de jambe et le corps de la femelle de la tique peut endommager les organes internes de Tick tels que l’intestin moyen et les tubules malpighiens, tandis que les dommages causés à l’organe de Gene peuvent survenir pendant l’inoculation entre le Scutum et le capitulum.
Lorsque l’intestin moyen de la tique est perturbé par l’aiguille pendant la collecte de l’hémolymphe dorsale, le liquide obtenu est rouge, et non incolore. Ceci indique une mauvaise collection d’hémolymphe. Dans ces cas, l’hémolymphe doit être jeté car il est contaminé par la teneur intestinale.
La bonne collection d’hémolymphe est cruciale pour mener à bien les expériences et obtenir des résultats fiables. Lorsque l’hémolymphe a été prélevé à partir des pattes coupées (n = 20 tiques pondérés de façon homogène), le volume obtenu était inférieur à l’hémolymphe totale obtenue à partir de la collection dorsale (n = 20 Ticks pondérés de façon homogène) (figure 4). Il est suggéré que, en raison du faible volume de chaque goutte qui sort de la jambe coupée, la coagulation de l’hémolymphe peut être fréquemment présente pendant ce processus de collecte de l’hémolymphe. Cela peut nuire à l’acquisition et à la classification des hémocytes (figure 5 et figure 6). Malgré la plus grande réalisation de volume de l’hémolymphe, la collection dorsale est jugée plus difficile à réaliser.
Figure 1 : Ticks' l' hygiénisation des cuticules. Les femelles de Rhipicephalus MICROPLUS ont été lavées à l’aide d’eau du robinet et immergées dans une solution d’hypochlorite de sodium à 0,5% (v/v) pendant 3 min dans un récipient en verre de 500 ml. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
La figure 2 : Ticks' séchage des cuticules. Rhipicephalus MICROPLUS les femelles entièrement engorgées ont été séchées à l’aide de serviettes en papier stériles. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Metarhizium des blastospores. Propaluges fongiques utilisés dans l’inoculation de tiques. Barre d’échelle = 50 μM. s’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Graphique représentatif montrant le volume d’hémolymphe obtenu avec chaque méthode collecton. Volume de Rhipicephalus MICROPLUS HEMOLYMPHE obtenu après la collecte dorsale ou de la jambe. Pour chaque méthode, on a utilisé un pool de 20 graduations pondérés de façon homogène. Ces tiques n’ont pas été inoculés antérieurement. Les valeurs moyennes ± l’écart type suivi pour la même lettre ne diffèrent pas statistiquement après l’analyse de la variance (ANOVA) (P ≥ 0,05). S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 5 : Concentration d’hémocytes obtenue avec chaque méthode de prélèvement de l’hémolymphe. Concentration de Rhipicephalus MICROPLUS hémocytes obtenue après la remise en suspension dans le milieu de culture L-15 de Leibovitz après la collecte dorsale ou de la jambe. Les valeurs moyennes ± écart-type suivis pour la même lettre ne diffèrent pas statistiquement après le test de Kruskal-Wallis (P ≥ 0,05). S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 6 : Les hémocytes trouvés dans Rhipicephalus MICROPLUS frottis d’hémolymphe. Les hémocytes de R. MICROPLUS ont été colorés par Giemsa. Les flèches noires indiquent les différentes cellules de l’hémolymphe des tiques. Barre d’échelle = 100 μM. s’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
L’inoculation d’agents pathogènes est utile lorsque l’étude vise à étudier l’action in vivo des microorganismes dans les modèles expérimentaux d’arthropodes, car elle assure que l’agent pathogène est à l’intérieur de l’hôte. La technique peut également être appliquée pour inoculer des molécules telles que l’interférence d’ARN (RNAi). L’inoculation entre le Scutum et le capitulum est considérée comme plus facile à effectuer mais endommage fréquemment l’orgue de Gené, ce qui compromet la viabilité des oeufs12,13. L’orgue de Gengis est anatomiquement localisé près de la partie antérieure du capitum, et il est un organe important pour la position de la tique14. Par conséquent, l’inoculation entre le Tigh de la jambe et le corps de la femelle est plus appropriée si l’étude exige l’observation des paramètres biologiques des femelles puisque l’organe de la Gené ne sera pas blessé. Malgré la méthode d’inoculation entre la cuisse de la jambe et le corps de la tique est considéré comme plus difficile et facilement endommager ou exposer les organes internes de la tique, tels que l’intestin moyen et les tubules Malpighian, quand il est bien exécuté, il ne perturbera pas ces organes.
L’analyse de l’hémolymphe est essentielle pour comprendre le système immunitaire des arthropodes et pour comprendre la pathogenèse15,16. En conséquence, Tick hémolymphe peut être utilisé pour dévoiler la physiologie des tiques, assurer l’infectivité des tiques, comprendre les interactions tiques-pathogènes et les réponses immunitaires cellulaires et humorales9,17,18.
Tick hémolymphe collection à travers la coupe des jambes est rapporté dans plusieurs études19,20,21. En dépit de cette méthode simple avec aucune ou très faible contamination de l’hémolymphe, il est considéré comme contre-productif pour les études qui exigent des concentrations élevées d’hémocytes ou de grands volumes d’hémolymphe. D’autre part, l’exécution correcte de la collecte de l’hémolymphe à travers la région dorsale des femelles engorgées n’est pas facile à réaliser puisque l’intestin occupe presque tout le corps de la tique et la rupture avec l’aiguille provoque la contamination de l’hémolymphe. La contamination due à la perturbation intestinale peut également être observée lorsque la tique est naturellement infectée par des charges élevées d’héoparasites (c.-à-d., Babesia spp.), ou dans les étapes finales du processus de mort causée par les entomopathogènes8. Dans ces cas, l’hémolymphe doit être éliminé car les hémocytes et les analyses plasmatiques peuvent être affectés.
La vitesse de centrifugation des échantillons d’hémolymphe pour la récolte des hémocytes est également importante et influe directement sur la concentration des hémocytes, puisque les vitesses de champ centrifuge relatif élevé (RCF) contribuent à: i) les granules cellulaires difficiles à resuspendre, II) les cellules perturbation, et III) la dégranulation des hémocytes. Le culot de cellule idéal est une granule molle facile à resuspendre. Pour cette raison, la centrifugation à 500 x g pendant trois minutes à 4 ° c8 a été utilisée. Dans la présente étude, les hémocytes ont été resuspendus dans un milieu de culture et non dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) parce que le milieu de culture favorise une meilleure viabilité cellulaire.
Les méthodes présentées ici peuvent faire face à des limitations lorsqu’elles sont appliquées aux stades d’immaturité (larve et nymphe) des tiques ou des adultes non nourris. La méthode d’inoculation, par exemple, n’est appliquée que pour les femelles engorgées adultes parce que la taille de l’aiguille endommagera les stades immatures et possiblement les tiques adultes non nourris. Pour inoculer ces stades, un microinjecteur doit être utilisé. De même, la collecte de l’hémolymphe à travers la région dorsale est plus efficace lorsqu’elle est appliquée à des tiques engorgées, tandis que la collecte de l’hémolymphe en coupant les jambes peut être utilisée dans des études avec des tiques adultes non nourris ou des stades immatures. Malgré cela, notre but ici était de montrer des méthodes qui exigent des ressources technologiques très faibles. En outre, la technique de centrifugation doit être effectuée à faible force de centrifugation car la force élevée ou le temps de rotation prolongé peuvent endommager les cellules.
Les méthodes divulguées ici peuvent être utilisées comme lignes directrices pour les études impliquant l’inoculation d’entomopathogènes dans les tiques et l’hémolymphe/hémocytes récolte. Les techniques présentées ici exigent des ressources technologiques très faibles et sont des étapes classiques pour des études sur la physiologie des tiques, la pathologie et la réponse immunitaire de la tique.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Cette étude a été financée en partie par le Coordenacão de Aperfeiçoamento de Pessoal de nível Superior (CAPES) du Brésil, code des Finances 001. CAPES a fourni une bourse de doctorat pour M.A. Marciano. Nous remercions le Conseil national pour le développement scientifique et technologique (CNPq) du Brésil d’avoir fourni une bourse de doctorat pour J. Fiorotti. Cette recherche a également été soutenue par des subventions de la Fondation Carlos Chagas Filho pour la recherche de l’état de Rio de Janeiro (FAPERJ) et de CNPq. V.R.E.P. Bittencourt est un chercheur CNPq.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alkaline Hypochlorite solution | Sigma-Aldrich | A1727 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-1KG | |
| EDTA | Synth | 2706 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000036 | |
| Flexible rubber | BD | ||
| Giemsa stain | Sigma-Aldrich | 48900-500ML-F | |
| Glass capillary | CTechGlass | CT95-02 | |
| Insulin syringe (needle) | BD | SKU: 324910 | |
| KH2PO4 | Vetec | 60REAVET014512 | |
| Leibovitz's L-15 culture medium | Gibco | 11415-064 | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860-1L-R | |
| Microscope slides | Kasvi | K5-7105 | |
| Microtubes | BRAND | Z336769-1PAK | |
| Na2HPO4 | Vetec | 60REAVET014593 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653-1KG | |
| Neubauer chamber | Kasvi | K5-0111 | |
| Penicillin | Gibco | 15140163 | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P2714 | |
| Tween 80 | Vetec | 60REAVET003662 |
References
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