Summary
Analyse van Tick hemolymph vertegenwoordigt een belangrijke bron van informatie over hoe sommige ziekteverwekkers ziekte veroorzaken en hoe teken immunologisch reageren op deze infectie. De huidige studie toont aan hoe inoculeren schimmel propagulen en het verzamelen van hemolymph van Rhipicephalus Microplus engorged vrouwtjes.
Abstract
Teken zijn verplicht bloedzuigende ectoparasieten en Rhipicephalus Microplus heeft groot belang in de veterinaire geneeskunde, omdat het veroorzaakt bloedarmoede, gewichtsverlies, afschrijving van de dieren ' leer en kan ook fungeren als een vector van verschillende pathogenen. Wegens de exorbitante kosten om deze parasieten te controleren, schade aan het milieu dat door het ongepaste gebruik van chemische acariciden wordt veroorzaakt, en de verhoogde weerstand tegen traditionele parasieten bestrijdingsmiddelen uit, alternatieve controle van tikken, door het gebruik van entomopathogene schimmels, bijvoorbeeld, is beschouwd als een interessante aanpak. Niettemin, hebben weinig studies aangetoond hoe het immuunsysteem van de Tik handelt om deze entomopathogens te bestrijden. Daarom demonstreert dit protocol twee methodes die voor entomopathogen inenting in engorged wijfjes en twee technieken worden gebruikt die voor hemolymph inzameling en hemocytes het oogsten worden gebruikt. Inenting van ziekteverwekkers bij de been toevoeging in het lichaam van de Tik wijfje laat evaluatie van wijfjes biologische parameters in tegenstelling tot de inenting tussen Scutum en capitulum, die vaak Gené's orgaan beschadigen. Dorsale hemolymph collectie leverde een hoger volumeherstel dan de collectie door de benen. Enkele beperkingen van Tick hemolymph verzameling en verwerking omvatten i) hoge tarieven van hemocytes ' verstoring, II) hemolymph besmetting met verstoorde middendarm, en III) lage hemolymph volumeherstel. Wanneer hemolymph wordt verzameld door het been snijden, de hemolymph kost tijd om zich ophopen op het been opening, ten gunste van de stollingsproces. Bovendien worden in de collectie via het been minder hemocytes verkregen in vergelijking met de dorsale collectie, ook al wordt de eerste methode als gemakkelijker uitgevoerd. Inzicht in het immuunsysteem reactie in teken bemiddeld door entomopathogene agenten helpt om hun pathogenese onthullen en ontwikkelen van nieuwe doelen voor Tick Control. De hier beschreven inentings processen vereisen zeer lage technologische middelen en kunnen niet alleen worden gebruikt om teken aan pathogene micro-organismen bloot te stellen. Evenzo kan de collectie van Tick hemolymph vertegenwoordigen de eerste stap voor veel fysiologische studies.
Introduction
Het vee Tick, Rhipicephalus Microplus, is een Hematophagus ectoparasite met een enorme negatieve invloed op de veestapel in tropische gebieden. Deze teek is de vector van pathogene agentia zoals Babesia bovis, Babesia Bigemina, en Anaplasma marginale dat, in combinatie met de directe hemofeeding schade, kan verminderen melk en vleesproductie, bloedarmoede veroorzaken en uiteindelijk de dood. De verliezen die door dit ectoparasite worden veroorzaakt werden geschat in 3.240.000.000 dollars jaarlijks in Brazilië1. Er worden duurzame methoden geëist en het gebruik van entomopathogene middelen wordt beschouwd als een veelbelovend alternatief om het gebruik van chemische acariciden2,3,4te verminderen.
Entomopathogene schimmels, zoals anisopliae spp., zijn natuurlijke vijanden van geleedpotigen met inbegrip van teken, en sommige isolaten kunnen worden gebruikt als biocontroller. Deze pathogenen infecteren actief de gastheer door de cuticula en koloniseren hun lichaam2,5,6. Naarmate de infectie zich ontwikkelt, cellulaire en humorale reacties worden bemiddeld door de teek immuunsysteem. Analyse van de teek hemolymph wordt gerapporteerd als een nuttig instrument om het immuunsysteem reacties na de uitdagende met pathogenen7,8te evalueren.
De immune reactie van geleedpotigen is verdeeld in humorale en cellulaire reacties. De humorale reactie betreft hemagglutination processen en de productie van antimicrobiële eiwitten/peptiden, terwijl de cellulaire immuunrespons wordt uitgevoerd door de hemocytes. Deze cellen zijn aanwezig in de hemolymph van alle geleedpotigen en worden gerapporteerd aan een expressieve rol in studies met innate immune response9te ontwikkelen, want het is direct gerelateerd aan de fagocytose en inkapseling processen. Dienovereenkomstig, kunnen de studies over hemocytes helpen om doods weg te onderzoeken en processen zoals autophagy, apoptosis, en necrose te begrijpen. In sommige ongewervelden als tweekleppigen, de hemocytes ' collectie gezichten beperkingen zoals cel verstoring, lage hemolymph volume verkregen, en lage concentratie van teruggewonnen cellen10. Zeer vaak, afhankelijk van de toegepaste methodologie, verminderde concentratie van cellen wordt verkregen, invloed rechtstreeks op de cellen kwantificering en analyse.
Het aantal hemocytes dat in hemolymph circuleert is veranderlijk onder verschillende geleedpotigen en het kan in de zelfde soort veranderen toe te schrijven aan verschillende fysiologische stadia zoals geslacht, leeftijd, en ontwikkelingsstadium11van de geleedpotige. Hemocytes kan ook worden gevonden gerespecteerd voor sommige organen en worden vrijgegeven in het verkeer net na de infectie proces11. Niettemin, rapporteerden de meeste studies gebruik insecten, terwijl de tikken minder onderzocht betreffende hun fysiologie en pathologie blijven. Ondanks pathogeen inenting en hemolymph collectie in teken zijn minder gebruikte technieken, het vaststellen van standaard methoden helpt de ontwikkeling van meer accurate studies.
Het doel van deze studie was het vergelijken van de meest gebruikte methoden voor hemolymph inzameling en inenting van pathogenen in R. Microplus teken, het evalueren van de werkzaamheid in de hemolymph acquisitie en hemocytes concentratie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Teken gebruikt in de huidige studie werden verkregen uit een kunstmatige kolonie, onderhouden aan de federale rurale Universiteit van Rio de Janeiro, welke methoden zijn goedgekeurd door de Commissie ethiek voor het gebruik van gewervelde dieren (CEUA-IV/UFRRJ #037/2014).
1. Tick engorged vrouwtjes
- Na het tikken verzamelen, wassen engorged vrouwtjes met behulp van leidingwater en dompel ze in 0,5% (v/v) natrium hypochloriet oplossing voor 3 min in een 500 mL glas beker ontvanger, voor de cuticula hygiëne (Figuur 1), dan drogen alle vrouwen met steriele papieren handdoeken (figuur 2).
- Verdeel wijfjes in homogene gewogen groepen (met 20 wijfjes elk): één groep zonder enige behandeling, één controlegroep ingeënt met 5 µ L van 0,1% polyoxyethyleen sorbitanester Glycerolmonooleaat waterige oplossing (v/v), en één besmet-groep geënt met 5 µ L bij 1,0 x 10 7 blastospores ml-1.
Opmerking: alleen onbehandelde teken werden gebruikt voor volume en hemocyte concentratie. Er zijn drie replica's van elke groep uitgevoerd.
2. ziekteverwekkers inenting tussen Scutum en capitulum
Opmerking: in de huidige studie, entomopathogene schimmel schorsingen werden gebruikt als een voorbeeld.
- Suspendeer schimmel blastospores in 1 mL van 0,1% polyoxyethyleen sorbitanester Glycerolmonooleaat waterige oplossing (v/v) en stel in op een eindconcentratie van 1,0 x 107 blastospores ml-1. Voeg een hoeveelheid van 5 µ L anisopliae Blastospores (Figuur 3) suspensie toe aan het oppervlak van een plastic paraffine folie.
Opmerking: anisopliae blastospores schorsing werd aangepast met behulp van een Neubauer ´ s kamer. Om het inentings proces te versnellen, kunnen meerdere bubbels worden toegevoegd aan het plastic paraffine folie oppervlak, elke zeepbel die overeenkomt met 5 µ L. - Gebruik een 1 mL ultra-fijne insuline spuit en een 0,3 mm naald om de vering te trekken en inoculeren het in de teek. Vergeet niet om alle lucht uit de spuit te nemen voordat u het.
- Inoculeren 5 µ L van schimmel schorsing in de teek vrouwtje tussen de Scutum en capitulum. Inoculeren vrouwtjes uit de controlegroep met 5 µ L van 0,1% polyoxyethyleen sorbitanester Glycerolmonooleaat waterige oplossing (v/v) zonder schimmel.
Opmerking: een klein volume van hemolymph kan aanwezig zijn op het foramen na de naald inbrengen. Wees voorzichtig om niet inoculeren lucht.
3. inenting van entomopathogene schimmels tussen het been dij en de teek vrouwelijk lichaam
- Inoculeren wijfjes met schimmel suspensie (5 µ L bij 1,0 x 107 blastospores ml-1) tussen het been Tigh en het vrouwelijk lichaam, met behulp van een 1 ml ultra-fijne insuline spuit gekoppeld aan een 0,3 mm naald. Inoculeren wijfjes van de controlegroep met 5 µ L van 0,1% polyoxyethyleen sorbitanester Glycerolmonooleaat waterige oplossing (v/v).
Nota: wanneer anisopliae blastospores inenting tussen het been Tigh en het lichaam van het teken wijfje wordt uitgevoerd, kan een klein volume van hemolymph op de Tigh na de naald toevoeging aanwezig zijn. Wees voorzichtig om niet inoculeren lucht.
4. dorsale hemolymph collectie
- Gebruik het rubberen deel van een gevleugelde infusie set, een 0,3 mm capillaire buis, en een gefilterde tip om de hemolymph collectie uit te voeren.
- Verstoort de vrouwelijke dorsale cuticula met behulp van een 0,3 mm naald.
- Na verstoring, van toepassing zijn zachte druk op de voorste deel van de teek lichaam. Observeer een bijna transparante vloeistof te trekken uit de ontwrichting site. Verzamel de hemolymph door het zuigen van de vloeistof door de filter Tip gekoppeld aan het rubberdeel van een gevleugelde infusie set, en een 0,3 mm capillaire buis.
Opmerking: druk niet op het lichaam van de teek nauwelijks tijdens de immobilisatie, omdat dit kan verstoren de middendarm en vervuilen de hemolymph. Wacht tot de zachte druk kan de vloeistof te verdrijven zonder vervuiling.
5. Hemolymph collectie van het teek been
- Immobiliseren de teek, snijd een stuk van een voorpoot met een schaar.
Opmerking: een of meer poten kunnen worden gesneden, evenals, hetzelfde been kan worden gesneden meer dan een keer. - Breng zachte druk op de achterste lichaamsdeel van de teek. Observeer een transparante vloeibare zeepbel die verschijnt op de cut site en het verzamelen met de capillaire buis, zoals beschreven in stap 4,3.
Opmerking: druk niet op het lichaam van de teek nauwelijks tijdens de immobilisatie, omdat dit kan verstoren de middendarm en vervuilen de hemolymph. Wacht tot de zachte druk kan de vloeistof te verdrijven zonder vervuiling.
6. Hemolymph verwerking
- Na hemolymph collectie, deponeren in 1,5 mL microtubes eerder gevuld met 30 µ L protease cocktail en 82 µ L Saline buffer. Houd de microtubes op het ijs in de hemolymph collectie.
- Centrifugeer monsters (500 x g voor 3 min bij 4 °c). Een zachte pellet van hemocytes zal worden gevormd na hemolymph centrifugeren.
Opmerking: voor hemolymph kwantificatie, kwantificeren van de hemolymph volume verkregen door het tellen van het totale volume in de micro tube en discontering het volume van protease cocktail en zoute buffer. - Verwijder voorzichtig de bovendrijvende (Cell-Free hemolymph). Voorzichtig de cellen opnieuw op te schorten in, bijvoorbeeld, Leibovitz L-15 cultuur aangepast aan pH 7.0-7.2. Kwantificeren hemocytes door het plaatsen van 10 µ L van resuspended hemocytes in een Neubauer kamer.
7. Hemocyte bemonstering dia voorbereiding
- Snijd de teek voorpoot met een schaar.
- Breng zachte druk op de achterste lichaamsdeel van de teek. Observeer een transparante vloeibare zeepbel die verschijnt op de cut site.
- Breng de hemolymph druppels direct op schone Microscoop dia's, na die, gebruik de juiste methoden om de cellen vlek.
- Aan vlek hemocytes gebruikend Giemsa, lucht-droog de hemolymph op de dia 30 min, bevestig het bij kamertemperatuur met methanol voor 3 min, en vlek in Giemsa oplossing (1:9 verhouding van de bufferoplossing van Sorensen, pH 7,2) 30 min bij kamertemperatuur. Was de dia's met stromend water om de overmaat van kleurstof te verwijderen, lucht-droog de dia en evalueer de cellen bij 400x in een optische Microscoop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dit artikel benadert inenting en hemolymph inzamelings methodes die op tikken worden toegepast. Na de inenting tussen de been dij en het lichaam van de teken wijfje, wat vloeistof (hemolymph) kan tijdens het proces worden uitgescheiden; Nochtans, is het belangrijk om op te merken dat wanneer de inenting wordt gebeëindigd, geen vloeistof of weefsels in de naald uiteinde of bij de inentings plaats aanwezig waren, ervoor zorgend dat de schimmel opschorting volledig werd ingeënt. Toen het inentings proces correct werd uitgevoerd, veroorzaakte de naald toevoeging geen teken wijfjes dood. Aan de andere kant, teken stierf ongeveer 48 h na inenting van de entomopathogene schimmel. Inenting tussen de been dij en Tick vrouwelijk lichaam kan beschadigen teek interne organen zoals middendarm en de Malpighian tubuli, terwijl schade aan het orgaan van genen kan optreden tijdens de inenting tussen de Scutum en capitulum.
Wanneer de teek middendarm wordt verstoord door de naald tijdens de dorsale hemolymph collectie, de verkregen vloeistof is rood, niet kleurloos. Dit geeft een onjuiste hemolymph-collectie aan. In deze gevallen wordt hemolymph weggegooid omdat het besmet is met intestinale inhoud.
De juiste hemolymph collectie is cruciaal om de experimenten goed te kunnen uitvoeren en betrouwbare resultaten te behalen. Wanneer hemolymph werd verzameld uit geslepen teek poten (n = 20 teken homogeen gewogen), het verkregen volume was lager dan de totale hemolymph verkregen uit de dorsale collectie (n = 20 teken homogeen gewogen) (Figuur 4). Er wordt gesuggereerd dat, als gevolg van het lage volume van elke druppel die trekt uit het snij been, hemolymph stolling kan vaak aanwezig zijn tijdens dit proces van hemolymph collectie. Dit kan een negatieve invloed hebben op de hemocytes verwerving en classificatie (Figuur 5 en Figuur 6). Ondanks het hogere volume voltooiing van hemolymph, wordt de dorsale inzameling beschouwd als moeilijker om worden uitgevoerd.
Figuur 1 : Teken ' cuticula hygienization. Rhipicephalus Microplus volledig engorged vrouwtjes werden gewassen met behulp van leidingwater en ondergedompeld in 0,5% natrium hypochloriet oplossing (v/v) voor 3 min in een 500 ml glas beker ontvanger. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2 : Teken ' cuticula drogen. Rhipicephalus Microplus volledig engorged vrouwtjes werden gedroogd met steriele papieren handdoeken. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3 : Anisopliae blastospores. Schimmel propaluges gebruikt in Tick inenting. Schaalbalk = 50 µm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4 : Representatieve grafiek waaruit blijkt hemolymph volume verkregen met elke collecton methode. Rhipicephalus Microplus hemolymph volume verkregen na dorsale of been collectie. Een pool van 20 homogeen gewogen teken werden gebruikt voor elke methode. Deze teken waren niet eerder geënt. Gemiddelde waarden ± standaarddeviatie gevolgd voor dezelfde letter verschillen niet statistisch na analyse van variantie (ANOVA) test (P ≥ 0,05). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5 : Hemocytes concentratie verkregen met elke hemolymph-inzamel methode. Rhipicephalus Microplus hemocytes concentratie verkregen na hersuspensie in Leibovitz L-15 kweekmedium na dorsale of been collectie. Gemiddelde waarden ± standaarddeviatie gevolgd voor dezelfde letter verschillen niet statistisch na Kruskal-Wallis test (P ≥ 0,05). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 6 : Hemocytes gevonden in Rhipicephalus Microplus hemolymph uitstrijkje. R. Microplus hemocytes werden bevlekt door Giemsa. Zwarte pijlen geven de verschillende cellen in de teek hemolymph. Schaalbalk = 100 µm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Inenting van ziekteverwekkers is nuttig wanneer de studie poogt de in vivo actie van micro-organismen in experimentele geleedpotige modellen te onderzoeken omdat het verzekert dat de ziekteverwekker binnen de gastheer is. De techniek kan ook worden toegepast op inoculeren moleculen zoals RNA interferentie (RNAi). De inenting tussen Scutum en capitulum wordt beschouwd als gemakkelijker uit te voeren maar vaak beschadigt Gené's orgaan, dat de eieren levensvatbaarheid12,13schaadt. Gené's orgel is anatomisch gelegen dicht bij het voorste deel van capitum, en het is een belangrijk orgaan voor de teek ovipositie14. Dienovereenkomstig, is de inenting tussen het been Tigh en het lichaam van het wijfje meer aangewezen als de studie de observatie van de biologische parameters van wijfjes ' "vereist aangezien het Gené's orgaan niet zal worden verwond. Ondanks de inentings methode tussen de been dij en het lichaam van de teek wordt beschouwd als moeilijker en gemakkelijk schade of bloot de teek interne organen, zoals de middendarm en de Malpighian tubuli, wanneer het goed wordt uitgevoerd, zal het niet verstoren deze organen.
De analyse van Hemolymph is essentieel om het geleedpotige immune systeem te begrijpen evenals pathogenese15,16te begrijpen. Dienovereenkomstig Tick hemolymph kan worden gebruikt om teek fysiologie onthullen, te verzekeren teek infectiviteit, te begrijpen Tick-pathogeen interacties, en de cellulaire en humorale immuunrespons9,17,18.
Tick hemolymph collectie door het been snijden wordt gerapporteerd in verschillende studies19,20,21. Ondanks deze methode die eenvoudig met geen of zeer lage hemolymph verontreiniging is, wordt het beschouwd als averechts voor studies die hoge concentraties van hemocytes of grote volumes van hemolymph vereisen. Aan de andere kant, de juiste uitvoering van hemolymph collectie door de dorsale regio van engorged vrouwtjes is niet gemakkelijk te bereiken, omdat de darm neemt bijna de hele teek lichaam en scheuren het met de naald veroorzaakt hemolymph besmetting. Besmetting als gevolg van darm verstoring kan ook worden waargenomen wanneer de teek is van nature besmet met een hoge belasting van hemoparasites (namelijk, Babesia spp.), of in de laatste stappen van het doods proces veroorzaakt door entomopathogens8. In deze gevallen, hemolymph zal worden weggegooid, omdat hemocytes en plasma analyses kunnen worden beïnvloed.
De centrifugesnelheid van hemolymph monsters voor hemocytes oogsten is ook belangrijk en direct invloed op de hemocytes concentratie, omdat hoge relatieve centrifugale veld (RCF) snelheden bijdragen tot: i) Cell pellet moeilijk te hersuspenderen, II) cellen verstoring, en III) hemocytes degranulatie. De ideale Cell pellet is een zachte pellet gemakkelijk op te schorten. Om deze reden, werd de centrifugeren bij 500 x g drie minuten bij 4 °c8 gebruikt. In de huidige studie, werden hemocytes opnieuw opgeschort in een cultuurmiddel en niet in fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) omdat het cultuurmiddel betere levensvatbaarheid van de cel steunt.
De hier gepresenteerde methoden kunnen worden geconfronteerd met beperkingen wanneer toegepast op onvolwassen stadia (larve en nimf) van teken of Unfed volwassenen. De inentings methode, bijvoorbeeld, wordt slechts toegepast voor volwassen engorged wijfjes omdat de naald grootte onrijpe stadia en misschien Unfed volwassen tikken zal beschadigen. Om deze stadia te inoculeren, moet een microinjector worden gebruikt. Evenzo, hemolymph collectie door de dorsale regio is effectiever wanneer toegepast op engorged teken, terwijl hemolymph collectie door het snijden van de benen kunnen worden gebruikt in studies met Unfed volwassen teken of onvolwassen stadia. Ondanks dit, ons doel hier was om te laten zien methoden die zeer lage technologische middelen vereisen. Bovendien, centrifugeer techniek moet worden uitgevoerd bij lage Centrifugeer kracht, omdat hoge kracht of uitgebreide spin tijd kan beschadigen cellen.
De methodes die hier worden onthuld kunnen als richtlijnen voor studies worden gebruikt die inenting van entomopathogens in tikken en hemolymph/hemocytes het oogsten impliceren. De hier gepresenteerde technieken vereisen een zeer lage technologische middelen en zijn klassieke stappen voor studies over Tick fysiologie, pathologie, en het immuunsysteem van Tick reactie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Deze studie werd deels gefinancierd door de Coordenacão de Aperfeiçoamento de Pessoaal de nível Superior (CAPEs) uit Brazilië, Finance code 001. CAPEs mits Ph.D. Scholarship voor A.F. Marciano. Wij danken de nationale Raad voor wetenschappelijke en technologische ontwikkeling (CNPq) van Brazilië voor het verstrekken van Ph.D. beurs voor J. Fiorotti. Dit onderzoek werd ook ondersteund door subsidies van Carlos Chagas Filho Stichting voor onderzoek van de staat Rio de Janeiro (FAPERJ) en CNPq. V.R.E.P. Bittencourt is een CNPq onderzoeker.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alkaline Hypochlorite solution | Sigma-Aldrich | A1727 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-1KG | |
| EDTA | Synth | 2706 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000036 | |
| Flexible rubber | BD | ||
| Giemsa stain | Sigma-Aldrich | 48900-500ML-F | |
| Glass capillary | CTechGlass | CT95-02 | |
| Insulin syringe (needle) | BD | SKU: 324910 | |
| KH2PO4 | Vetec | 60REAVET014512 | |
| Leibovitz's L-15 culture medium | Gibco | 11415-064 | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860-1L-R | |
| Microscope slides | Kasvi | K5-7105 | |
| Microtubes | BRAND | Z336769-1PAK | |
| Na2HPO4 | Vetec | 60REAVET014593 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653-1KG | |
| Neubauer chamber | Kasvi | K5-0111 | |
| Penicillin | Gibco | 15140163 | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P2714 | |
| Tween 80 | Vetec | 60REAVET003662 |
References
- Grisi, L., et al. Reassessment of the potencial economic impact of cattle parasites in Brazil. Revista Brasileira de Parasitologia Veterinária. 23 (2), 150-156 (2014).
- Schrank, A., Vainstein, M. H. Metarhizium anisopliae enzymes and toxins. Toxicon. 56 (7), 1267-1274 (2010).
- Camargo, M. G., et al. Metarhizium anisopliae for controlling Rhipicephalus microplus ticks under field conditions. Veterinary Parasitology. 223, 38-42 (2016).
- Perinotto, W. M. S., et al. In vitro pathogenicity of different Metarhizium anisopliae s.l. isolates in oil formulations against Rhipicephalus microplus. Biocontrol Science and Technology. 27 (3), 338-347 (2017).
- Pedrini, N., Crespo, R., Juarez, M. P. Biochemistry of insect epicuticle degradation by entomopathogenic fungi. Comparative Biochemistry and Physiology. Part C: Toxicology and Pharmacolpgy. 146 (1-2), 124-137 (2007).
- Ortiz-Urquiza, A., Keyhani, N. O. Action on the surface: Entomopathogenic fungi versus the insect cuticle. Insects. 4 (3), 357-374 (2013).
- Angelo, I. C., et al. Detection of serpins involved in cellular immune response of Rhipicephalus microplus challenged with fungi. Biocontrol Science and Technology. 24 (3), 351-360 (2014).
- De Paulo, J. F., et al. Rhipicephalus microplus infected by Metarhizium: unveiling hemocyte quantification, GFP-fungi virulence, and ovary infection. Parasitology Research. 117, 1847-1856 (2018).
- Marmaras, V. J., Lampropoulou, M. Regulators and signalling in insect haemocyte immunity. Cell Signal. 21, 186-195 (2009).
- Hinzmann, M. F., Lopes-Lima, M., Gonçalves, J., Machado, J. Antiaggregant and toxic properties of different solutions on hemocytes of three freshwater bivalves. Toxicological & Environmental Chemistry. 95, 790-805 (2013).
- Nation, J. L. Insect Physiology and Biochemistry. , University of Florida. Gainesville, FL. (2016).
- Gene, J. Mémoires de l'Académie royale des sciences. Torino. 9, 751 (1848).
- Lees, A. D., Beament, J. W. L.
- Sonenshine, D. E., Roe, R. M. Biology of ticks. , Oxford University Press. Oxford, UK. (2014).
- Tan, J., et al. Characterization of hemocytes proliferation in larval silkworm Bombyx mori. Journal of Insect Physiology. 59 (6), 595-603 (2013).
- Bowden, T. J. The humoral immune systems of the American lobster (Homarus americanus) and the European lobster (Homarus gammarus). Fish Research. 186, 367-371 (2017).
- Sonenshine, D. E., Hynes, W. L. Molecular characterization and related aspects of the innate immune response in ticks. Frontiers in Bioscience. 13, 7046-7063 (2008).
- Tsakas, S., Marmaras, V. Insect immunity and its signaling: an overview. Invertebrate Survival Journal. 7, 228-238 (2010).
- Burgdorfer, W. Hemolymph Test. A technique for detection of Rickettsiae in ticks. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 19, 1010-1014 (1970).
- Dunham-Ems, S. M., et al. Live imaging reveals a biphasic mode of dissemination of Borrelia burgdorferi within ticks. Journal of Clinical Investigation. 119, 3652-3665 (2009).
- Patton, T. G., et al. Saliva, salivary gland, and hemolymph collection from Ixodes scapularis ticks. Journal of Visualized Experiments. 60, e3894 (2012).
