Præsenteret her er en protokol for en enkelt celle, epifluorescens mikroskopi-baserede teknik til at kvantificere græsnings rater i akvatiske aggressiv eukaryoter med høj præcision og taksonomisk opløsning.
Elucidating trofiske interaktioner, såsom prædation og dens virkninger, er en hyppig opgave for mange forskere i økologi. Studiet af mikrobielle samfund har mange begrænsninger, og fastsættelsen af et rovdyr, bytte, og aggressiv satser er ofte vanskeligt. Præsenteret her er en optimeret metode baseret på tilsætning af fluorescently mærket bytte som en Tracer, som giver mulighed for pålidelig kvantitation af græsning satser i akvatiske aggressiv eukaryoter og skøn over overførsel af næringsstoffer til højere trofiske niveauer.
Heterotrofisk prokaryoter er en vigtig biologisk komponent i akvatiske systemer og tegner en betydelig del af plankton biomassen1,2,3. Faktorer, der styrer deres overflod, mangfoldighed og aktivitet er afgørende for at forstå deres rolle i biogeokemiske cykling (dvs. skæbne organisk kulstof og andre næringsstoffer og strømmen af energi fra prokaryoter til højere trofiske niveauer). Protozoer græsning er en af disse vigtige faktorer. Bakterien af heterotrofisk nanoflagellater og ciliater pålægger en stærk top-down kontrol over prokaryote tæthed, samfund funktion, struktur, mangfoldighed, og selv cellulære morfologi og vækstrate af bestemte bakterie grupper4, 5,6. I nogle systemer, protister tjene som den vigtigste årsag til bakteriel dødelighed6,7.
Den standardtilgang, der anvendes til at vurdere protozo bakterivory, som har været brugt i nogen tid nu, indebærer brug af fluorescently mærkede bakterier (FLB) som bytte analoger og epifluorescens mikroskopi. Celle specifikke optagelses rater kan bestemmes ved at kvantificere antallet af mærkede bytte partikler i protistan Food vakuoler over et valgt tidsforløb8. Der er flere fordele ved denne fremgangsmåde. Tracer tilsættes til naturlige prøver med naturlige rovdyr og bytte assemblages. Der er minimal prøve manipulation før inkubation, minimal stikprøve ændring af den tilføjede FLB-Tracer, og inkubationstiderne er korte for at sikre sunde resultater opnået under tæt på in situ-betingelser. Alternativt kan der i miljøer med et lavt antal bakteriæske protister eller zooplankton (f. eks. offshore marine systemer) påvises forsvinden af FLB til prøver i lave mængder (2%-3% Tracer) via flowcytometri på lang sigt (12-24 h) inkubations eksperimenter. Derefter kvantificeres antallet af FLB ved start-og slutpunkterne (integrering af virkningen af alle bakteriere) ved strømnings cytometri (Se tidligere publikation9) for yderligere oplysninger. En sådan parameter repræsenterer imidlertid kun samlede aggregerede bakterie rater, som ikke direkte kan henføres til nogen bestemt protistan-og zooplankton-grædende grupper eller arter.
Samlet set kan det være en udfordring at kvantificere de protistan arter-eller morfotype-specifikke bakterie dødelighed i vandmiljøet nøjagtigt og med økologisk betydning. Nogle protister er selektive græsere, og størrelsen og celle formen af den tilføjede FLB Tracer kan forvride naturlige rater af bytte indtagelse10,11. Desuden er protistan aktivitet og metabolisme meget temperaturfølsom12; Derfor skal mængden af tilsat FLB-Tracer omhyggeligt manipuleres for hver enkelt prøvetype (ikke kun baseret på den naturlige overflod, størrelse og morfologi af bakterier og fremherskende typer af bakteriædere, men også på temperatur). De fleste undersøgelser fokuserer på bulk protistan græsning aktivitet; imidlertid har bakterien af specifikke protistan arter ofte en meget højere informationsværdi og kan være at foretrække. I dette tilfælde er der behov for taksonomisk viden om de protist arter, der findes i en prøve, og forståelse af deres opførsel. Derfor er der behov for betydelige mængder tid og arbejdskraft for at opnå solide resultater på artsspecifikke bakterie rater, der kan henføres til en bestemt protistan gruppe eller art.
På trods af disse vanskeligheder er denne fremgangsmåde stadig det mest velegnede værktøj til vurdering af protistan bakterien i naturlige omgivelser. Præsenteret her er en omfattende, nem at følge metode til at bruge FLB som en Tracer i akvatiske mikrobielle økologi undersøgelser. Alle de nævnte problematiske aspekter af tilgangen er tegnede sig for, og en forbedret arbejdsgang er beskrevet, med to eksperimenter fra kontrasterende miljøer samt kontrasterende ciliate arter som eksempler.
Det første casestudie blev udført i et epilimnetisk miljø fra det mesotrofe římov vandreservoir i Tjekkiet, som viser græs og bakterielle mængder, der kan sammenlignes med de fleste overflade ferskvandsområder (jf.5,7). Det andet casestudie blev udført i det meget specifikke miljø inde i fælder af den akvatiske kødædende plante Utricularia reflekxa, som er vært for ekstremt høje antal af både græsnings mixotrofe ciliates (Tetrahymena utriculariae) og bakterieceller. Der vises beregninger af celle specifikke græsnings rater og bakterielle stående bestande i begge prøvetyper. En række økologiske fortolkninger af resultaterne drøftes derefter, og der foreslås endelig eksempler på mulige opfølgende undersøgelser.
Decifrere trofiske interaktion i akvatiske systemer er altid udfordrende28, især på nano-plankton skalaer involverer protister og deres bytte, bakterier. Når det kommer til optagelse af næringsstoffer og kvantificering, er anvendelsen af metoder med succes anvendt ved højere trofiske niveauer mindre mulig på grund af den høje kompleksitet af biotiske interaktioner. Disse omfatter for eksempel stabile isotop mærkningsmetoder. Denne protokol viser fordelene ved at bruge epifluorescens mikros…
The authors have nothing to disclose.
Denne undersøgelse blev støttet af den tjekkiske videnskabs fond under forsknings tilskuddet 13-00243S og 19-16554S tildelt henholdsvis K. Š. og D. S. Denne artikel blev også støttet af projektet “Biomanipulation som et redskab til forbedring af vandkvaliteten i dæmnings reservoirer” (nr. CZ. 02.1.01/0,0/0,0/16_025/0007417), finansieret af den europæiske fond for regional udvikling, i det operationelle program for forskning, udvikling og uddannelse.
0.2-µm pore-size filters | SPI supplies, https://www.2spi.com/ | B0225-MB | Black, polycarbonate track etch membrane filters, diameter approprite for filtering apparatus used |
5-(4,6-dichlorotriazin-2-yl) aminofluorescein (DTAF) | Any brand | ||
Automatic pipettes with adjustable volumes | Any brand, various sizes | ||
Centrifuge | 22 000 x g | ||
Cryovials | Any brand, 2 mL size | ||
DAPI (4´,6-Diamidino-2´-phenylindole dihydrochloride) | Any brand | 1 mg ml-1 | |
Epiflorescence microscope | Magnification from 400 x up to 1000 x | ||
Filters appropriate for viewing in the DAPI and DTAF range | |||
Counting grid in one of the oculars | |||
Filtering apparatus | Usually with a diameter of 25 mm | ||
Formaldehyde | A brand for microscopy | ||
Glutaraldehyde | A brand for microscopy | ||
Immersion oil for microscopy | Specific oil with low fluorescence | ||
Lugol´s solution | Any brand or see comment | Make an alkaline Lugol' solution as follows: Solution 1 – dissolve 10 g of potassium iodide in 20 ml in MQ water, then add 5 g of iodine. Solution 2 – add 5 g of sodium acetate to 50 ml of MQ water. Add the solution 2 to the solution 1 and thoroughly mix | |
Methanol stabilized formalin | Any brand available for microscopy purposes | ||
Microscope slides and cover slips | Any brand produced for microscopy purposes | ||
MQ water for diluting samples | Any brand |
||
Phosphate-buffered saline (PBS; pH = 9) | Any brand | 0.05 M Na2HPO4-NaCl solution, adjusted to pH 9 | |
PPi-saline buffer | Any brand | 0.02 M Na4P2O7-NaCl solution. Add 0.53 g Na4P2O7 to 100 ml of MQ water plus 0.85 g NaCl | |
Sampling device | Appropriate for obtaining representative sample | e.g. Friedinger sampler for lake plankton | |
Sodium thiosulfate solution | Any brand | 3% solution is used in the protocol | |
Sonicator | Any brand | 30 W | |
Vortex | Any brand allowing thorough mixing of the solutes and samples | ||
Water bath | Any brand allowing temperature to be maintained at 60 °C |