Fluorescent märkt bakterier som spårämne för att avslöja nya vägar för organiskt kol flöde i akvatiska ekosystem
Summary
Presenteras här är ett protokoll för en encellig, epifluorescens mikroskopi-baserad teknik för att kvantifiera betes hastigheter i akvatiska rovdjur Eukaryoter med hög precision och taxonomisk upplösning.
Abstract
Att belysa trofiska interaktioner, såsom predation och dess effekter, är en flitig uppgift för många forskare inom ekologi. Studiet av mikrobiella samhällen har många begränsningar, och att fastställa ett rovdjur, bytesdjur, och underprissättning är ofta svårt. Presenteras här är en optimerad metod som bygger på tillsats av fluorescerande märkta bytesdjur som en spårämne, som möjliggör tillförlitlig kvantifiering av betes graden i akvatiska rovdjur Eukaryoter och uppskattning av näringsämne överföring till högre trofiska nivåer.
Introduction
Heterotrofiska prokaryoter är en viktig biologisk komponent i akvatiska system och står för en betydande del av plankton biomassa1,2,3. Faktorer som styr deras överflöd, mångfald och aktivitet är avgörande för att förstå deras roll i biogeokemisk cykling (dvs. ödet för organiskt kol och andra näringsämnen och flödet av energi från prokaryoter till högre trofiska nivåer). Protozoer bete är en av dessa viktiga faktorer. Bakterivory av heterotrofiska nanoflagellater och ciliater lägger en stark uppifrån och ned kontroll över prokaryotiska överflöd, gemenskap funktion, struktur, mångfald, och även cellulära morfologi och tillväxthastighet av särskilda bakterie grupper4, 5,6. I vissa system, protister fungera som den främsta orsaken till bakteriell dödlighet6,7.
Den standardmetod som används för att bedöma protozoiska bakterier, som har använts under en tid nu, innebär användning av fluorescerande märkta bakterier (FLB) som bytes analoger och epifluorescens mikroskopi. Cell-specifika upptag hastigheter kan bestämmas genom att kvantifiera antalet märkta bytes partiklar i protistan mat vakuoler under en vald tid kurs8. Det finns flera fördelar med detta tillvägagångssätt. Tracer tillsätts naturliga prover med naturliga rovdjur och byten assemblages. Det finns minimal prov manipulation före inkubering, minsta prov ändring av den tillförda FLB-spårningstiden och inkubations tiderna är korta för att säkerställa sunda resultat som erhålls under förhållanden nära in situ. Alternativt, i miljöer med ett lågt antal bakteriehaltiga protister eller zooplankton (t. ex. offshore Marina system), kan försvinnanden av FLB som tillsätts i prover i låga mängder (2%-3% spårämne) detekteras via flödescytometri på lång sikt (12-24 h) inkubations experiment. Därefter kvantifieras antalet FLB vid start-och slutpunkterna (som integrerar effekten av alla bakterienorer) med flödescytometri (för detaljer, se tidigare publikation9). En sådan parameter utgör dock endast en sammanlagd aggregerad bakterieränta som inte direkt kan hänföras till någon särskild grupp eller art av djurplankton Grazer.
Övergripande, kvantifiera protistan art-eller morfotypspecifika bakteriella dödligheten i vattenmiljön exakt och med ekologisk innebörd kan vara utmanande. Vissa protister är selektiva betare, och storleken och cellens form av den tillagda FLB Tracer kan snedvrida naturliga satser av byten intag10,11. Dessutom är protistan aktivitet och metabolism mycket temperaturkänsliga12; Därför måste mängden tillsatt FLB Tracer noggrant manipuleras för varje enskilt prov typ (inte bara baserat på det naturliga överflöd, storlek, och morfologi av bakterier och rådande typer av bakteriemedel, men också på temperatur). De flesta studier fokuserar på bulk protistan bete verksamhet; bakterien i specifika protistan-arter har dock ofta ett mycket högre informationsvärde och kan vara att föredra. I detta fall behövs taxonomisk kunskap om de protistiska arter som finns i ett prov och förståelse för deras beteende. Därför krävs avsevärda mängder tid och arbetskraft för att uppnå sunda resultat på artspecifika nivåer av bakterien som kan hänföras till en viss protistan-grupp eller art.
Trots dessa svårigheter, detta tillvägagångssätt är fortfarande det lämpligaste verktyget för närvarande för att bedöma protistan bacterivory i naturliga miljöer. Presenteras här är en heltäckande, lätt att följa metod för att använda FLB som en spårämne i akvatiska mikrobiella ekologi studier. Alla de problematiska aspekterna av tillvägagångssättet redovisas och ett förbättrat arbetsflöde beskrivs, med två experiment från kontrasterande miljöer och kontrasterande ciliatarter som exempel.
Den första fallstudien utfördes i en epilimnetisk miljö från mesotrofiska římov-vattenreservoaren i Tjeckien, som visar Grazer-och bakterie förekomster som är jämförbara med de flesta ytsötvatten-kroppar (jfr.5,7). Den andra fallstudien utfördes i den mycket specifika miljön inne i fällor av vattenlevande köttätande växten Utricularia Auktor, som är värd för extremt höga antal både betande mixotrofiska ciliater (Tetrahymena utriculariae) och bakterieceller. Beräkningar av cellspecifika betes hastigheter och bakteriella stående bestånd i båda prov typerna visas. En rad ekologiska tolkningar av resultaten diskuteras sedan, och exempel på möjliga uppföljningsstudier föreslås slutligen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dechiffrera trofiska interaktion i akvatiska system är alltid utmanande28, särskilt på nano-plankton skalor som involverar protister och deras byte, bakterier. När det kommer till näringsupptaget vägar och kvantifiering, tillämpning av metoder som framgångsrikt används vid högre trofiska nivåer är mindre möjligt, på grund av den höga komplexiteten av biotiska interaktioner. Dessa inkluderar till exempel stabila isotop märkningsmetoder. Detta protokoll visar fördelarna med att anv?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna studie stöddes av den tjeckiska vetenskapsstiftelsen under Forskningsbidraget 13-00243S och 19-16554S tilldelade till K. Š. respektive D. S.. Denna artikel stöddes också av projektet “Biomanipulation som ett verktyg för att förbättra vattenkvaliteten i dammen reservoarer” (nr CZ. 02.1.01/0.0/0.0/16_025/0007417), finansierat av Europeiska regionala utvecklingsfonden, inom verksamhetsprogrammet forskning, utveckling och utbildning.
Materials
| 0.2-µm pore-size filters | SPI supplies, https://www.2spi.com/ | B0225-MB | Black, polycarbonate track etch membrane filters, diameter approprite for filtering apparatus used |
| 5-(4,6-dichlorotriazin-2-yl) aminofluorescein (DTAF) | Any brand | ||
| Automatic pipettes with adjustable volumes | Any brand, various sizes | ||
| Centrifuge | 22 000 x g | ||
| Cryovials | Any brand, 2 mL size | ||
| DAPI (4´,6-Diamidino-2´-phenylindole dihydrochloride) | Any brand | 1 mg ml-1 | |
| Epiflorescence microscope | Magnification from 400 x up to 1000 x | ||
| Filters appropriate for viewing in the DAPI and DTAF range | |||
| Counting grid in one of the oculars | |||
| Filtering apparatus | Usually with a diameter of 25 mm | ||
| Formaldehyde | A brand for microscopy | ||
| Glutaraldehyde | A brand for microscopy | ||
| Immersion oil for microscopy | Specific oil with low fluorescence | ||
| Lugol´s solution | Any brand or see comment | Make an alkaline Lugol' solution as follows: Solution 1 – dissolve 10 g of potassium iodide in 20 ml in MQ water, then add 5 g of iodine. Solution 2 – add 5 g of sodium acetate to 50 ml of MQ water. Add the solution 2 to the solution 1 and thoroughly mix | |
| Methanol stabilized formalin | Any brand available for microscopy purposes | ||
| Microscope slides and cover slips | Any brand produced for microscopy purposes | ||
| MQ water for diluting samples | Any brand |
||
| Phosphate-buffered saline (PBS; pH = 9) | Any brand | 0.05 M Na2HPO4-NaCl solution, adjusted to pH 9 | |
| PPi-saline buffer | Any brand | 0.02 M Na4P2O7-NaCl solution. Add 0.53 g Na4P2O7 to 100 ml of MQ water plus 0.85 g NaCl | |
| Sampling device | Appropriate for obtaining representative sample | e.g. Friedinger sampler for lake plankton | |
| Sodium thiosulfate solution | Any brand | 3% solution is used in the protocol | |
| Sonicator | Any brand | 30 W | |
| Vortex | Any brand allowing thorough mixing of the solutes and samples | ||
| Water bath | Any brand allowing temperature to be maintained at 60 °C |
References
- Azam, F., et al. The ecological role of water-column microbes in the sea. Marine Ecology Progress Series. 10, 257-263 (1983).
- Šimek, K., et al. A finely tuned symphony of factors modulates the microbial food web of a freshwater reservoir in spring. Limnology & Oceanography. 59, 1477-1492 (2014).
- Šimek, K., et al. Bacterial prey food characteristics modulate community growth response of freshwater bacterivorous flagellates. Limnology & Oceanography. 63, 484-502 (2018).
- Šimek, K., et al. Changes in bacterial community composition, dynamics and viral mortality rates associated with enhanced flagellate grazing in a meso-eutrophic reservoir. Applied & Environmental Microbiology. 67, 2723-2733 (2001).
- Jürgens, K., Matz, C. Predation as a shaping force for the phenotypic and genotypic composition of planktonic bacteria. Antonie Van Leeuwenhoek. 81, 413-434 (2002).
- Pernthaler, J. Predation on prokaryotes in the water column and its ecological implications. Nature Reviews Microbiology. 3, 537-546 (2005).
- Berninger, U. B., Finlay, J., Kuuppo-Leinikki, P. Protozoan control of bacterial abundances in freshwaters. Limnology and Oceanography. 36, 139-147 (1991).
- Sherr, E. B., Sherr, B. F., Kemp, P. F., Sherr, B. F., Sherr, E. B., Cole, J. J. Protistan grazing rates via uptake of fluorescently labeled prey. Handbook of Methods in Aquatic Microbial Ecology. , 695-701 (1993).
- Vazquez-Dominguez, E., Peters, F., Gasol, J. M., Vaqué, D. Measuring the grazing losses of picoplankton: methodological improvements in the use of fluorescently tracers combined with flow cytometry. Aquatic Microbial Ecology. 20, 119-128 (1999).
- Šimek, K., et al. Ecological role and bacterial grazing of Halteria spp.: Small oligotrichs as dominant pelagic ciliate bacterivores. Aquatic Microbial Ecology. 22, 43-56 (2000).
- Montagnes, D. J. S., et al. Selective feeding behaviour of key free-living protists: avenues for continued study. Aquatic Microbial Ecology. 53, 83-98 (2008).
- Kirchman, D. L. . Processes in Microbial Ecology. 2nd Edition. , (2018).
- Porter, K. G., Feig, Y. S. The use of DAPI for identifying and counting aquatic microflora. Limnology and Oceanography. 25, 943-948 (1980).
- Foissner, W., Berger, H. A user-friendly guide to the ciliates (Protozoa, Ciliophora) commonly used by hydrobiologists as bioindicators in rivers, lakes, and waste waters, with notes on their ecology. Freshwater Biology. 35, 375-482 (1996).
- Foissner, W., Berger, H., Schaumburg, J. Identification and ecology of limnetic plankton ciliates. Informationsberichte des Bayer Landesamtes für Wasserwirtschaft Heft. , 3-99 (1999).
- Šimek, K., et al. Ciliate grazing on picoplankton in a eutrophic reservoir during the summer phytoplankton maximum: a study at the species and community level. Limnology & Oceanography. 40, 1077-1090 (1995).
- Skibbe, O. An improved quantitative protargol stain for ciliates and other planktonic protists. Archiv für. Hydrobiolgie. 130, 339-347 (1994).
- Macek, M., et al. Growth rates of dominant planktonic ciliates in two freshwater bodies of different trophic degree. Journal of Plankton Research. 18, 463-481 (1996).
- Šimek, K., et al. Microbial food webs in hypertrophic fishponds: omnivorous ciliate taxa are major protistan bacterivores. Limnology & Oceanography. , (2019).
- Jezbera, J., et al. Major freshwater bacterioplankton groups: Contrasting trends in distribution of Limnohabitans and Polynucleobacter lineages along a pH gradient of 72 habitats. FEMS Microbiology Ecology. 81, 467-479 (2012).
- Kasalický, V., et al. The diversity of the Limnohabitans genus, an important group of freshwater bacterioplankton, by characterization of 35 isolated strains. PLoS One. 8, 58209 (2013).
- Stabell, T. Ciliate bacterivory in epilimnetic waters. Aquatic Microbial Ecology. 10, 265-272 (1996).
- Zingel, P., et al. Ciliates are the dominant grazers on pico- and nanoplankton in a shallow, naturally highly eutrophic lake. Microbial Ecology. 53, 134-142 (2007).
- Bickel, S. L., Tang, K. W., Grossart, H. P. Ciliate epibionts associated with crustacean zooplankton in german lakes: distribution, motility, and bacterivory. Frontiers in Microbiology. 3 (243), (2012).
- Sirová, D., et al. Hunters or gardeners? Linking community structure and function of trap-associated microbes to the nutrient acquisition strategy of a carnivorous plant. Microbiome. 6, 225 (2018).
- Šimek, K., et al. Ecological traits of a zoochlorellae-bearing Tetrahymena sp. (Ciliophora) living in traps of the carnivorous aquatic plant Utricularia reflexa. Journal of Eukaryotic Microbiology. 64, 336-348 (2017).
- Pitsch, G., et al. The green Tetrahymena utriculariae n. sp. (Ciliophora, Oligohymenophorea) with its endosymbiotic algae (Micractinium sp.), living in the feeding traps of a carnivorous aquatic plant. Journal of Eukaryotic Microbiology. 64, 322-335 (2017).
- Nielsen, J. M., Clare, E. L., Hayden, B., Brett, M. T., Kratina, P. Diet tracing in ecology: Method comparison and selection. Methods in Ecology and Evaluation. 9, 278-291 (2018).
- Beisner, B. E., Grossart, H. P., Gasol, J. M. A guide to methods for estimating phago-mixotrophy in nanophytoplankton. Journal of Plankton Research. , 1-13 (2019).
- Dolan, J. D., Šimek, K. Processing of ingested matter in Strombidium sulcatum, a marine ciliate (Oligotrichida). Limnology and Oceanography. 42, 393-397 (1997).
- Massana, R., et al. Grazing rates and functional diversity of uncultured heterotrophic flagellates. The ISME Journal. 3, 588-596 (2009).
- Grujčić, V., et al. Cryptophyta as major freshwater bacterivores in experiments with manipulated bacterial prey. The ISME Journal. 12, 1668-1681 (2018).
