Summary
הפרוטוקול מפרט קרצינומה מורמתי מחוץ לתמונה של שעתוק לא גנטי פגום. כאן, עיכוב כרוני של CDK9 משמש כדי לדכא התארכות פרודוקטיבי של RNA פול II לאורך גנים התגובה הפרו-דלקתיות לחקות ולחקור את התופעה הקלינית הרפואית TEבהחלט , נוכח כ 20% מסוגי הסרטן.
Abstract
בעבר דיווחו כי קבוצת משנה של סרטן מוגדר על ידי האוספים הגלובליים החוצה עם הליקויים הנרחבים ב-mRNA התארכות שעתוק (TE) — אנו קוראים כאלה סרטן כמו TEבהחלט. בעיקר, הסרטןבהחלט TE מאופיין על ידי תמלול מלאכותי עיבוד mrna בקבוצה גדולה של גנים, כגון אינטרפרון/JAK/STAT ו-TNF/NF-κB מסלולים, המוביל הדיכוי שלהם. TEבהחלט תת סוג של גידולים בתאי הכליה קרצינומה וחולי מלנומה גרורתית לתאם באופן משמעותי עם תגובה גרועה ותוצאה בטיפול חיסוני. בהתחשב בחשיבות של חקירת הסרטן teבהחלט -כפי שהוא רומז על מחסום משמעותי נגד טיפול חיסוני — המטרה של פרוטוקול זה היא להקים מודל מבחנהבהחלט העכבר בטוח לחקור אלה נפוצים, לא גנטית מומים הטרנססקריפט בסרטן ולהשיג תובנות חדשות, הרומן משתמש עבור תרופות קיימות, או למצוא אסטרטגיות חדשות נגד סוגי סרטן כאלה. אנו לפרט את השימוש של פלאדידול כרונית מתווך CDK9 עיכוב לבטל זרחון של סרין 2 שאריות על התחום החוזר C-מסוף (CTD) של RNA פולימראז II (RNA פול II), דיכוי שחרורו של RNA פול II לתוך תמלול פרודוקטיבי תארכות. בהתחשב בעובדה כי הסרטןבהחלט אינם מסווגים תחת כל מוטציה סומטית ספציפית, מודל תרופתי הוא יתרון, והטוב ביותר מחקה את הטרנססקריפט הנפוץ ופגמים אפיגנטיים שנצפו בהם. השימוש במינון ממוטב תת קטלני של פלאופאפידולדול הוא האסטרטגיה היחידה יעילה ביצירת מודל הניתן להכליל של שיבוש נרחב שאינם גנטיים התארכות שעתוק ו-mRNA עיבוד פגמים, לחקות היטב את ה-TE הנצפה קלינית . בהחלט מאפיינים לכן, מודל זה של TEבהחלט יכול להיות ממונפת כדי לנתח, התאים האוטונומית מאפשר להם להתנגד התקפה תא החיסון בתיווך.
Introduction
צעד הגבלת קצב מפתח בביטוי של כמעט כל הגנים הפעילים הוא המעבר של RNA פולימראז ii (RNA Pol ii) מן היזם-הקרובים הקרובים התארכות פרודוקטיבי1,2. בהינתן כי בחוסר התקנה גנטית של התארכות ההסטריה מסייע ההתקדמות של ממאירות אנושית מרובות המוגדרים TEבהחלט, המוביל איתות תת אופטימלי במסלולי התגובה pro-דלקתיות בהיקף תגובה עלובה ואת התוצאה לטיפול חיסוני3, המטרה הרחבה של פרוטוקול זה היא להקים מודל שימושי מבחנה כדי לחקור אלה הפרעות הטרנססקריפט הנרחב שאינם גנטיים בסרטן. באור זה, השימוש של עיכוב תרופתי כרונית של CDK9 היא אסטרטגיה יעילה ליצירת מודל הניתנת להכליל של שיבוש נרחב שאינם גנטיים התארכות שעתוק ו-mRNA עיבוד פגמים. הרציונל מאחורי השימוש בעיכוב CDK9 כרונית היא כי הוא השעריה זירחון של סרין 2 שאריות על התחום החוזר C-terminal (CTD) של RNA פול II, ובכך לדכא את שחרורו של RNA פול II לתוך שעתוק פרודוקטיבי. גם, TEבהחלט סרטן, תיאר בעבר על ידי הקבוצה שלנו3, אינם מסווגים תחת כל מוטציה סומטית ספציפית. לכן, מודל לא גנטי (תרופתי) הוא יתרון, הטוב ביותר מחקה את הטרנססקריפט הנפוץ ופגמים אפיגנטיים שנצפו בהם. השיטה כאן מפרט את הדור והאפיון של מודל הטיפול פלאפירידול כרונית של תאים סרטניים מורלין. שיטה זו הדגמה משבש את התארכות התעתיק לאורך הגנים המאופיינת באורכים גנומית ארוכים יותר, עם היזמים וביטויים inducible כגון tnf/NF-κB ו-אינטרפרון/STAT איתות, נשלט באופן עמוק ברמת ה . תעתיק התארכות3,4,5 בסך הכל, זה מודל קו ממוטב של תא מורטין של ליקויים התארכות כתבי-המודל היחיד לידע שלנו כדי ללמוד את המחקר החדש שתוארובהחלט גידולים – כוננים עמידות נגד הגידול החיסון נגד הסרטן, עיבוד מערכת שימושית לנצל ו לבחון את הפגיעויות של פגמים שאינם גנטיים מכונות תמלול הליבה בסרטן לעומת-à-לעומת החיסון מתווך התא.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים והוועדה המוסדית של הקרן לחקר הילדים בסינסינטי אישרה את כל ההליכים הניסיוניים לבעלי חיים (פרוטוקול IACUC #2017-0061 ו-IBC protocol #IBC2016-0016), ואלה ניסויים בוצעו בהתאם לתקנים כמתואר במדריך NIH לטיפול ושימוש בחיות מעבדה.
1. עיכוב כרוני של RNA פול השני על ידי טיפול פלאפיאנדול – אסטרטגיה בסיסית
- זרע B16/F10 מלנומה תאים בצפיפות נמוכה (0.2 x 106) בלוח התרבות 10 ס מ במדיום המקביל שלהם (בינונית המקבילה של מדיום הנשר [dmem], 10% סרום של שור עוברי [fbs], 1% פניצילין ו סטרפטומיצין [עט/דלקת]) ו-דגירה לילה ב 37 ° c, 5% CO2 מחולל חממה.
- למחרת, לשטוף את התאים עם מלוחים 1 x פוספט באגירה (PBS) ולהוסיף אצווה חדשה של מדיה תרבותית עם מינון תת קטלני (אומדן כ -25 ננומטר) של פלאופלפידול – מעכב של התארכות RNA פול II ההרחבה p-TEFb (ציקלט T/CDK9) — למשך שבוע בלי עוד תת-שתיים.
- בעקבות שבוע של טיפול פלאפירידול, לבצע confirmatory בחני להעריך את היכולת של המודל ללכוד תכונות שונות של פגמים התארכות היפוך ראה TEבהחלט סרטן.
2. Confirmatory כתמי חיסוני הערכה להעריך פגום RNA פול II פונקציה ופגיעה של אינטרפרון (IFN) המסלול ואת נמק הגידול גורם (TNF) מסלול איתות של העכבר המופק TEבהחלט מודל
- תרבות מספר שווה (105) של פלאופלאפידולדול מטופלים B16/f10 מלנומה תאים והורים B16/f10 מלנומה העכבר תאים בשתי קבוצות שונות של 12 לוחות היטב (אחד להגדיר עבור האפיון הפונקציונלי השני RNA פול II ולהגדיר אחרים עבור ציטוקינים גירוי) ב-37 ° c ב-5 % ושבע מחולל חממה למשך הלילה.
- למחרת, לטפל בתאים בגירוי ציטוקינים להגדיר עם העכבר ifn-γ, ifn-α (5 ng/ml), או tnf-α (5 ng/ml) עבור 45 דקות ב 37 ° c.
- עכשיו, לחלץ חלבון מתאים בשני cy, ו-RNA פול II האפיון פונקציונליות באמצעות מאגר לradioimmunoprecipitation (ריפה) לליזה באופן הבא:
- לשטוף את התאים עם 1x PBS ו lyse זה עם 50 μL של מאגר הליזה בכל טוב. גרד, ואז מצנע את התאים האלה ב -4 מעלות צלזיוס, 21,130 x g.
- מדוד את החלבון בתא הליפוסט-באמצעות שיטת הצביעה הסטנדרטית לריכוז חלבונים בעקבות מסיסות הניקוי (ברדפורד או שיטה דומה).
- טען כמות שווה של חלבון נמדד (15 μg) מכל מדגם לרוץ בתוך 4%-18% נתרן dodecyl סולפט (sds) אלקטרופורזה ג'ל, ולהעביר אותם אל polyvinylidene difluoride (pvdf) קרום.
- לחסום את ממברנות PVDF ב 5% חלב יבש ב טריס-באגירה מלוחים-polysorbate 20 (TBST) עבור 1 h ואחריו דגירה לילה ב 4 ° צ' עם נוגדנים העיקרי (RNA פול II 1:1000; p-SER2 RNA פול II 1:1000; p-SER5 RNA פול II 1:1000; H3K36me3 1:2000; סה"כ H3 1:2000; STAT1 1:1000; p-STAT1 1:1000; NFκB 1:1000; p-NFκB 1:1000; β-Actin 1:5000) בתוספת של 5% בסרום שפרה.
- למחרת, לשטוף את ממברנות PVDF עם 1 x TBST עבור 15 דקות בטמפרטורת החדר (RT), ו-דגירה אותם עם נוגדנים משניים המתאים (אנטי עכברוש [1:5000] עבור RNA פול II, p-SER2 RNA פול II, ו-p-SER5 RNA פול II; האנטי ארנב (1:5000) עבור H3K36me3, סך H3, STAT1, p-STAT1, NFκB, ו-p-NFκB) עבור 50 דקות ב RT. לזהות את אותות החלבון באמצעות מסחרית זמין מסחרי peroxidase (HRP) מצע עם משופר משופרת.
הערה: β-Actin הראשי בשימוש הוא HRP מצומת, ולכן זה יכול להיות מפותח ללא משני.
3. Confirmatory הטיפול כדי להעריך פגמים בעיבוד mRNA ב-TE העכבר שנוצר מודלבהחלט
- זרע מספר שווה (0.2 x 106) של פלאופלדול טיפל B16/f10 תאים מלנומה העכבר ההורים B16/f10 מלנומה העכבר תאים ב 6-היטב צלחות ב 37 ° c ב 5% CO2 מחולל חממה למשך הלילה.
- לחלץ RNA סה כ מן התאים מתורבתים ב 60% השטף באמצעות מגיב או קיט של הפקת RNA (שולחן חומרים).
- מרוקן את rRNA מכלל ה-RNA שחולץ באופן הבא:
הערה: פרוטוקול קלט נמוך בחרה במשותף מערכה מסחרית הזמינה כדי לרוקן את rRNA- הגדר אמבט מים או מחסום חום אחד ל-70-75 ° c, ומרחץ-מים נוסף או בלוק חום ב37 ° c.
- להוסיף את ה-RNA הכולל (100-500 ng ב 2 μL of nuclease-מים ללא תשלום) עם 1 μL של בדיקה בררנית rRNA מחסור ו 30 μL של מאגר הכלאה בצינור מיקרוצנטריפוגה, לערבב בעדינות על ידי vortexing ו-דגירה אותם ב 70 על 75 ° צ' עבור 5 דקות.
- כעת, העבר את הצינורות לאמבט מים בגודל 37 ° c, ואפשר לדגם להתקרר עד 37 ° c במשך 30 דקות.
- השהה מחדש את המחסור rrna בדיקה חרוזים מגנטיים על ידי vortexing, ואת סדרת מחלקים 75 μl של חרוזים ב-1.5 mL rnase-שפופרת מיקרוצנטריפוגה חינם.
- מניחים את ההשעיה חרוז על מפריד מגנטי 1 דקות.. הניחו לחרוזים להתיישב מתיף בעדינות. ומבטל את הסופרנטאנט חזור על שטיפת החרוזים שוב על ידי הוספת 75 μL של nuclease-מים ללא תשלום ולהשליך את supernatant לאחר הפרדה מגנטית.
- השהה מחדש את החרוזים הנשטפים ב-75 μL של מאגר הכלאה, ו-25 μL של זה לצינור אחר ולשמור אותו ב 37 ° צ' לשימוש מאוחר יותר.
- מניחים את השאר 50 μL חרוזים על מפריד מגנטי עבור 1 דקות ולמחוק את הסופרנטאנט. השהה מחדש את החרוזים ב -20 μL של מאגר היברידיזציה ושמור אותו ב-37 ° צ' לשימוש מאוחר יותר.
- לאחר הקירור של המחסור RNA/סלקטיבי rRNA בדיקה התערובת כדי 37 ° c עבור 30 דקות, לקצר צנטריפוגה את הצינור כדי לאסוף את המדגם לתחתית הצינור.
- העברת 33 μL של RNA/בררני rRNA המחסור התערובת לחרוזי מגנטי מוכן משלב 3.3.7. מערבבים על ידי מהירות נמוכה הורטקסנג.
- מודקון את הצינור ב 37 ° c עבור 15 דקות. במהלך הדגירה, לערבב את התוכן בעדינות מדי פעם. ואחריו צנטריפוגה קצרה לאסוף את הדגימה לתחתית הצינור.
- הניחו את הצינור על מפריד מגנטי במשך 1 דקות כדי להניח את מכלול rRNA-בדיקה. הפעם אל תמחק את הסופרנטאנט. הסופרנטאנט מכיל את ה-RNA שרוקן את rRNA.
- מניחים את הצינור של 25 μL של חרוזים משלב 3.3.6 על מפריד מגנטי עבור 1 דקות.. ולהשליך את הסופרנטאנט הוסיפו את הסופרנטאנט משלב 3.3.11 לצינורית החדשה של החרוזים. מערבבים על ידי מהירות נמוכה הורטקסנג.
- מודקון את הצינור ב 37 ° c עבור 15 דקות. במהלך הדגירה, לערבב את התוכן בעדינות מדי פעם. צנטריפוגה בקצרה את השפופרת כדי לאסוף את המדגם לתחתית הצינור.
- הניחו את הצינור על מפריד מגנטי במשך 1 דקות כדי להניח את מכלול rRNA-בדיקה. . אל תמחק את הסופרנטאנט העבר את הסופרנטנט (כ-53 μL) המכיל את ה-RNA שרוקן לאחר rRNA לשפופרת חדשה.
- למדוד את הריכוז של התשואה RNA על ידי ספקטרוסקופיה.
- השתמש במחצית אחת של הדגימות rRNA-מרוקנים כקלט לחרוזים מגנטיים המכילים oligo (dT) 25 כדי לחלץ polyA+ RNA באופן הבא:
הערה: פרוטוקול זה של בידוד הזנב polyA שליח RNA באמצעות רצפים oligo dT מאוגד על פני השטח של חרוזים מגנטיים כבר שותף מערכת זמין מסחרית (טבלת חומרים).- השהה מחדש את חרוזי oligo dT בבקבוקון על ידי בקצרה vortexing עבור > 30 s ולהעביר 200 μL של מחרוזת oligo dT לצינור. הוסף את אותו אמצעי אחסון (200 μL) של מאגר האיגוד והשהה אותו מחדש.
- הניחו את הצינור במגנט במשך 1 דקות והשמט את הסופרנטאנט. עכשיו, להסיר את השפופרת מן המגנט ולהשעות מחדש את ששטף oligo מחרוזת dT ב 100 μL של מאגר מחייב.
- להתאים את העוצמה של הקלט rRNA-הכולל מדגם RNA כדי 100 μL עם 10 mM טריס-HCl pH 7.5. כעת, הוסף 100 μL של מאגר האיגוד.
- חום עד 65 ° c עבור 2 דקות כדי לשבש מבנים RNA משני. . עכשיו, מקום מייד על הקרח
- הוסף את 200 μL של RNA סה כ לחרוזי ה-100 μL שנשטפו. לערבב ביסודיות ולאפשר קשירה על ידי סיבוב ברציפות על רוטור עבור 5 דקות ב RT.
- מניחים את הצינור על המגנט עבור 1-2 דקות ובזהירות להסיר את כל supernatant ובזהירות להסיר את כל supernatant.
- להסיר את הצינור מן המגנט ולהוסיף 200 μL של מאגר כביסה.
- למדוד את הטוהר ואת הריכוז של polyA המחולצים+ RNA על ידי ספקטרוסקופיה.
הערה: יחס 260/280 של 1.90-2.00 ויחס 260/230 של 2.00-2.20 לכל דגימות ה-RNA נחשבים למקובלים. - השתמש במחצית הנותרת של הדגימות rRNA-immunoprecipitation מסעיף 3.3 כקלט לחלבון עמודות (המסופקות בערכת ה-RNA (RIP), הטבלה ' חומרים') כדי לimmunoprecipitate הכתיר חמישה פריים באמצעות מונושבטים 7-methylguanosine נוגדן באופן הבא:
הערה: פרוטוקול זה של בידוד m7G הכתיר שליח RNA באמצעות ערכת RNA immunoprecipitation זמין מסחרית כבר בחרה ושונה עוד.- לשטוף את החלבון חרוזים מגנטיים שהתקבלו מערכת RIP על פי פרוטוקול של היצרן כדי לאגד מראש את הנוגדן לחרוזים.
- העברה 3 μg של methylguanosine הנוגדן 7 (ארנב IgG המסופקים בערכה ניתן להשתמש שליטה שלילית) על חרוזים בצינור מיקרוצנטריפוגה מושעה 100 μL לשטוף מאגר מתוך הערכה.
- דגירה עם סיבוב מהירות נמוכה עבור 30 דקות ב RT. צינורות צנטריפוגה בקצרה ולאחר מכן למקם את הצינורות על מפריד מגנטי, להסיר ולמחוק את supernatant.
- להסיר את הצינורות ולהוסיף 500 μL של מאגר לשטוף מתוך הערכה ומערבולת בקצרה. צנטריפוגה את החצוצרות בקצרה ואחריו הפרדה מגנטית שוב, להסיר ולמחוק את supernatant.
- חזור על השלב 3.6.4 פעם נוספת.
- הוסף סביב 120 ng של rRNA מרוקן (מתוך סעיף 3.3) כדי לקדם את הנוגדן מראש שטוף 7-methylguanosine חרוזים. הוסף 1 μL של מעכב RNase. מודטה ב-RT עבור 1-1.5 h עם עצבנות קלה.
- לסובב את החרוזים ב 300 x g עבור 10 s ולהסיר את supernatant המכיל uncapped (non-7-) mrna לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש.
- הוסף 100 μL של לשטוף את המאגר ושטוף אותו פעמיים יותר באופן דומה. מאגר של supernatant שנאסף באותו צינור מיקרוצנטריפוגה מתויג ללא התווית (non-7-methylguanosine) mRNA. . חנות על קרח
- Elute מושלגת (7-methylguanosine) mRNA מן החרוזים עם 300 μL של מאגר לליזה אוריאה (ULB) המכיל 7 M אוריאה, 2% SDS, 0.35 M הנאל, 10 מ"מ EDTA ו 10 מ"מ טריס, pH 7.5 על ידי חימום החרוזים ב 65 ° c עבור 2-3 דקות.
- מערבבים 300 μL של דגימות שאינן מתויגות (mRNA) עם 300 μL של פנול: כלורופורם: isoamyl אלכוהול (25:24:1; מסחרית זמין) (מאוחסן ב -4 ° c). מערבבים היטב על ידי היפוך ולעזוב כ 10 דקות ואז לערבב שוב בעדינות.
- צנטריפוגה ב 18,928 x g עבור 2 דקות ובזהירות פיפטה השכבה העליונה לצינור טרי ולמחוק את השכבה התחתונה.
- הוסף 300 μL של פנול: כלורופורם: isoamyl אלכוהול (25:24:1; מאוחסן ב -4 ° c) לדגימות. מערבבים היטב על ידי היפוך ולאחר מכן צנטריפוגה ב 18,928 x g עבור 1 דקות. בזהירות, פיפטה את השכבה העליונה לצינור טרי ולמחוק את השכבה התחתונה.
- הוסף 300 μL של 2-porpanol ו 30 μL של 3 M אצטט נתרן (pH 5.2) על RNA הכתיר והבלתי מושלגת. היפוך המדגם כמה פעמים ולשים אותו ב-20 ° c עבור 20 h.
- עכשיו, לצנטריפוגה את הדגימות ב 18,928 x g עבור 10 דקות ב 4 ° c. הסר בזהירות את supernatant ולהוסיף 500 μL של 70% אתנול.
- צנטריפוגה שוב ב 18,928 x g עבור 10 דקות ב 4 ° c. התעלם בזהירות מהסופרנט וייבש את הגלולה בשעה RT במשך פחות מ -5 דקות. השהה את הגלולה במים נטולי שכירות.
- למדוד את הטוהר ואת הריכוז של התשואה RNA על ידי ספקטרוסקופיה. היחס 260/280 צריך להיות בטווח של 1.90-2.00, ואת היחס 260/230 בטווח של 2.00-2.20 עבור כל דגימות RNA.
4. הConfirmatory הספק להעריך את התגובה של העכבר TE מודלבהחלט כדי fasl מתווך תאים מוות
- זרעי מספר שווה (30,000 תאים) של פלאופלאפידולדול טיפל B16/F10 תאים מלנומה העכבר ההורים B16/F10 תאים מלנומה העכבר בלוח 96-היטב התרבות במדיום המקביל שלהם (DMEM), ו דגירה לילה ב 37 ° c, 5% CO2 מחולל חממה.
- לטפל בתאים במכסה התרבות עם ריכוזים שונים של h 6faslשלו(0.1-1000 Ng/mL) בנוכחות של 10 μg/ml אנטי נוגדן ו-הדגירה של 24 שעות ב 37 ° c, 5% CO2 מחולל חממה.
- להסיר תאים מתים על ידי שטיפת עם מאגר ה-PBS 1x. תקן את התאים המחוברים 4% פאראמפורמלדהיד עבור 20 דקות ב RT. להיפטר 4% פאראפורמלדהיד (אין צורך לשטוף), ומכתים עם פתרון גביש סגול (20% מתנול, 0.5% קריסטל סגול ב-1x PBS) עבור 30 דקות.
- להסיר כתם עודף על ידי שטיפה בעדינות את הצלחות במי ברז. השאר את הלוחות יבשים ב-RT.
- לפזר מחדש את הגביש סגול ב 100 μL של 1 x nonionic שתיל מומס 1x PBS, ולמדוד את צפיפות התא על ידי מדידת ספיגה ב 570 nm בקורא מיקרופלייט.
5. שיטת גישוש כדי להעריך את התגובה של העכבר TE מודלבהחלט אנטיגן מסוים ציטוטוקסיים T-cell התקפה
- בידוד והפעלה של OT-I CD8 + ציטוטוקסיים T-cell התקפה (CTL)
- טיהור CD8 + תאים מפני משטחים של OT-I TCR Tg-1/-עכברים על-ידי הפרדת תאים מגנטית באמצעות העכבר CD8 T ערכת בידוד תא כדלקמן:
- לקצור שני משטחים משני מRPMI.
- מחית טחולים ב 70 יקרומטר מסנן שמרו על שפופרת 50 ml מלא 20 מ ל של RPMI, באמצעות גב של מזרק עד רק שומן נשאר מאחור במסנן.
- צנטריפוגה את הזרם בתוך 220 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c. . מחק את הסופרנטאנט
- הוסף 1 מ ל של תא דם אדום (RBC) מאגר הליזה לגלולה הטחול מן השלב הקודם צנטריפוגה ופיפטה התערובת עבור 1 דקות.
- נטרל את הפתרון על ידי הוספת עד 10 מ ל של RPMI.
- צנטריפוגה ב 220 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c. בטל את הסופרנטאנט והשהה מחדש ב-10 מ ל של RPMI.
- . קח מעיל קטן לספירה צנטריפוגה את הנותרים ב 220 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c.
- עבור כל מיליון תאים שנספרו, להשעות מחדש את הגלולה ב 1 מ ל של מאגר מגנטי זמין מסחרית מערכת ההפרדה (מאגר מוג או מאגר דומה).
- להכין קוקטייל נוגדן של נפח 100 μL עבור כל 1 mL של תאים מסוימים בשלב 5.1.1.8. קוקטייל הנוגדן כולל: ביוטין anti-CD4, CD105, CD45R/B220, CD11c, CD49b, TER-119, CD19, CD11b, tcr γ/δ, CD44.
- הוסף את הקוקטייל הזה לתאים המפלשים 1 mL ושמור על קרח במשך 15 דקות.
- הוסף 100 μL של מגנטי (streptavidin) חרוזים לכל 100 μL של קוקטייל הנוגדן שנוספו 1 mL מושעה בתאי הטחול מחדש. . שמור על קרח במשך 15 דקות
- הוסף 7 מ ל של מאגר מגנטי זמין מסחרית מערכת ההפרדה. עכשיו, בערך 3 עד 4 מיל של התערובת לצינור חדש. מערבבים היטב ולתקן אותו למגנט עבור 5 דקות.
- Decant הנוזל (מכיל CD8 + תאים) לצינור חדש על הקרח. עכשיו, מחלקים את הנותרים 3 ל 4 מ ל של תערובת משלב 5.1.1.12 לצינור ולתקן אותו המגנט עבור 5 דקות. Decant הנוזל (הקבוצה השנייה של CD8 + תאים מבודדים) לצינור זהה המכיל את האצווה הראשונה של CD8 + תאים שנשמרו על קרח.
- הנדסה זרעים מהונדסים הפיצוץ APC-(MEC. B7. Sigova) שורה כדי לבטא אובלבומין ספציפי (ב)-נגזר, H-2kb-מוגבל פפטיד אפירופה OVA257-264 (si, יחד עם מולקולה שיתוף המולקולה b 7.1, ב 75,000 תאים לכל טוב ב 24-באר צלחות, ב 37 ° c, 5% co2 מחולל חממה.
הערה: מעבדה של ד ר אדית ג'נסן בשימוש היא מתנה מהמעבדה בצ. השורה נוצרה במקור במעבדה של ד ר סטיבן פ. שוטברגר במכון לה הויה לאלרגיה ואימונולוגיה6. - לאחר 24 שעות, לשטוף את mon, המונייר של APC פעם עם מדיום שונה של דולקוב של המדיום (IMDM) מסחרית זמין עם מאגר HEPES, נתרן פירובט, L-גלוטמין ו גלוקוז גבוה), ולהוסיף 0.5 x 106 נאיבי OT-I CD8 + תאים (משלב 5.1.1.13) ב 2 מ ל imdm בתוספת עם 50 mM β-ME, 2 מ"ל EDTA, 4 מ"מ L-גלוטמין ו HEPES ו 10% FBS.
- לאחר 20 h, בעדינות לקצור את התאים הלא מחסיד OT-I (על ידי איסוף התקשורת בצלחת התרבות עם צפה בתאי OT-I ו להתאים את התאים ב 191 x g עבור 2 דקות; לספור את התאים ot-i הקיימא) ולהעביר אותם לתרבות שיתוף.
- טיהור CD8 + תאים מפני משטחים של OT-I TCR Tg-1/-עכברים על-ידי הפרדת תאים מגנטית באמצעות העכבר CD8 T ערכת בידוד תא כדלקמן:
- שיתוף תרבות של CD8 + תאים עם B16/F10-OVA תאים
- זרעים OT-I-נגזר CD8 + תאים ביחס של 1:1 (300,000 תאים כל אחד) ב שיתוף תרבות עם B16/F10 (חסר אנטיגן ovalbumin), מטופל B16/F10-OVA, ו B16/F10-OVA תאים מראש עם פלאופאפידול (25 ננומטר) במשך שבוע אחד, ב 6-היטב מנות עם DMEM לאה מדיה עבור 20 h ב 37 ° c ב 5% CO2 מחולל חממה.
- לאחר 20 שעות, הסר את התאים CD8 +-I-נגזרות (על-ידי איסוף המדיה בצלחת התרבות באמצעות הCD8 והתאים הצפים הנגזרים). שטוף את התאים B16/F10-OVA ב 1x PBS.
- טריסיזציה של שלוש הקבוצות של תאים B16/F10-OVA המצורפת ב-0.05% EDTA המכילים טריפסין עבור 5 דקות. כדור התאים הטריסיזציה ב 191 x g עבור 5 דקות.
- כתם בתאים שנקטפו B16/F10-OVA על-ידי דגירה אותם ב-PBS קר (המכיל 0.5% FBS ו 0.05% נתרן azide) עם היכולת לצבוע ונוגדנים רלוונטיים התווית (לתקן את הכדאיות לתקן e780, AF647-מצועם העכבר CD8 ו BV421-מעלה מצופת העכבר CD45 ).
- לנתח את הכדאיות של שלוש קבוצות של B16/F10-OVA בתאי ידי זרימה cy try.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כאן, אנו מספקים ערכה מפורטת (איור 1) כדי להקים מודל תאבהחלט cell מושגת על ידי תת קטלני כרונית (איור 2) טיפול עם פלאופלאפידולדול ב 25 ננומטר. באיור 3, על 3 ימים של טיפול עם פלאופלדול, B16 בתאי OVA להראות מאפיינים חלקיים של TEבהחלט אך לאחר שבוע של טיפול, B16/F10 תאים בנובה להראות אובדן עמוק של זרחון ב סרין 2 מיקום על Ctd של RNA פול II לאורך בירידה משמעותית ב-H3K36me3 – שינוי באבן מעורב בהגדרת גבולות האקסון ומעכב של העתקים מתוך הריצה. כתוצאה מכך, TEבהחלט תא מודל מראה הפגמים הקריטיים של עיבוד mrna עם יחס מוגבר מוגברת של mrna באופן לא כהלכה ולא פולי-מתחזה (איור 4a, B). גם, הדיכוי הספציפי של המפתח התגובה דלקתית מפתח גנים ו FasL מתווך מסלול מוות תאים נראים באיור 5 ואיור 6. התנגדות מוטלות אינטרפרון (IFN-α, IFNγ) ו-TNF-α גירוי זירחון של STAT1 ו NFκB, והתנגדות למוות התא על ידי ליגלציה מוות FasL באופן דרסטי מפחית את הרעילות של התקפה תא חיסונית נגד TEבהחלט גידולים. טכניקות confirmatory אלה נועדו לבחון את היקף ההשפעה של השפעה כרונית של שעתוק התארכות יש על מגוון רחב של הגנים מגיבים גירוי, והאם כגון התגובה במודל העכבר הנתון קו המתאים מספיק כדי ל הודעה על מחסור אקוטי של mRNA פונקציונלי לתגובה דלקתית הגנים איתות, לחקות את הדברים הבסיסיים של TEבהחלט מחלות סרטן קלינית. בהתבסס על המחקר שלנו של הטיפול פלאפירידול, הדיכוי של זרחון בשאריות סרין השני (pSER2) של RNA פול השני CTD הוא קריטי, כפי שהוא מסמן התארכות שעתוק. מנה משנית עבור כל קו קרצינומה של העכבר נתון חייב להשיג ירידה ברמות pSER2 בנוסף בעל השפעה משמעותי על שיעור הצמיחה והכדאיות של קו התא. למרות שאנו רואים בעקביות ירידה pSER2 ו H3K36me3 רמות על 25 הטיפולים בפלאדידול ננומטר, זה לא להבטיח דיכוי של pSTAT1 ו pNFκB רמות (על IFN-α, IFNγ ו-TNF-α מגירוי, בהתאמה). כל תא קרצינומה של העכבר הוא ייחודי (B16/F10 OVA או CT26 התאים המתורבתות במעבדות שונות על פני תקופה של זמן עשוי להיות אפקטים ששונו מעט) והם עשויים להיות JAK1 או CCNT1 באופן חלקי הצלת את ההשפעות של פלאופאפידול בדיכוי ה מסלול תגובה דלקתית גנים. במקרים כאלה, הקינטיקה של רמות pSTAT1 ו pNFκB עשוי להיות מסומן בנקודות זמן שונות (5-70 דקות) כדי להבין את הזמניות של השפעות מתווכת פלאופלדול והצלה שלה על ידי JAK1 או CCNT1. בהתאם, JAK1 ו/או CCNT1 ייתכן שיהיה צורך להפיל את המודל הזה.
לאחר מודל פלאפיאירידול הוקמה ומאופיין באמצעות האמור לעיל, אנו מספקים מבחן הבדיקה כדי לבדוק אם התא TEבהחלט תא מודל ההתנגדות להתקפה T-CELL (CTL) ציטוטוקסיים. בהתבסס על פרוטוקול אופטימיזציה שלנו, פלאפיאירידול טיפל B16/F10 באופן מוגזם לבטא את הגן OVA (B16 OVA) co-דגירה עם הופעל CD8 + CTLs (ספציפי עבור אפירופה OVA257 264) לאחר רעילות סלקטיבית כדי ביטוי תאים (מתנה Dr. מעבדתו של סטיבן פ. שוטברגר6) לא היו רגישים לפירוק הגידול בשנת OT-I CTL-תיווך. B16/F10 תאים בנובה (לא מראש עם פלאפידולדול) עבר מוות תאים מסיבי במערכת זו, בעוד B16/F10 תאים הורים שרדו, כפי שהם לא מבטאים אנטיגן OVA (איור 7). זה ברור מהתוצאה של מערכת הבדיקה המוצעת כי המושרה כרוניתבהחלט יכול להעניק אמצעים להימלט מפני התקפה חיסונית אנטי הגידול אפילו vivo. זה יכול להיות בבדיקה נוספת ב vivo מודלים הגידול כדי לבדוק את הנטייה של TEבהחלט מודלים לברוח מולדים הסתגלות נגד הגידול התגובות החיסונית. Anti-asialo טיפולים יכול לשמש כדי לווסת את הפעילות של תאים NK בvivo בעכברים הנושאת הגידול. כמו כן, טיפול במחסום החיסונית (anti-CTLA4 ו anti-PD1) ניתן לנהל את TEבהחלט הגידול עכברים הנושאת.
בטוטאליות, TEבהחלט confirmatory בחני יחד עם שיטת הבדיקה המוצעת יחד להפגין את השירות של שילוב זה תאבהחלט מודל התא בשורה שלמה של גידולים אחרים-בדיקות החיסונית. מודל זה יכול לעזור לנתח את הפרטים המולקולריים כתוצאה מהתארכות הדדיות פגומה בתאי הגידול והתגובה שלהם לאינטראקציות תאים חיסוניים.
איור 1: ייצוג סכמטי של זרימת העבודה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: מאפייני הצמיחה של התא של B16 OVA תאים כרוניים שטופלו במינון נמוך פלאופלדול: הכדאיות (נמדד על ידי הכדאיות הכימית) של שליטה ו פלאופלפידול התייחסו בתאים B16 OVA בימים המצוינים לאחר הטיפול. איור זה השתנה ממודולר ואח '3. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: הConfirmatory שיטת הערכה להערכת RNA פול ii ופרופיל היסטון: חיסוני מצוין של היסטון ו-rna פול ii בתאי B16 OVA מטופלים עם פלאופלדול עבור 72 h או שבוע אחד. איור זה השתנה ממודולר ואח '3. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: הConfirmatory שיטת הערכה של פגמים חמורים בעיבוד mRNA. היחס של 5 ′-uncapped כתיר ל 5 ′-הכתיר (A) ו-3 ′-non-pvc כדי 3 ′-Polyadenylated (ב) ריכוזי mrna לאחר המחסור rrna בקווי התא המצוין. קווי שגיאה מייצגים סטיית תקן בהתבסס על שלוש משכפל טכני. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: הConfirmatory שיטת הערכה להערכת פרופיל גירוי ציטוקין. בלוק חיסוני של STAT1, pSTAT1, NFκB ו-p NFκB בשליטה ופלאופאפירידול מטופלים מראש B16 תאים בנובה מגורה עם IFN-α, IFNγ או TNF-α עבור 30 דקות ב (5 ng/mL). איור זה השתנה ממודולר ואח '3. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: הConfirmatory שיטת התנגדות להערכת ההתנגדות למוות מתווך של תא בתוך מבחנה. שליטה ופלאופאנאפידול מטופלים מראש B16 בתאי OVA שטופלו על FasL עבור 24 שעות הבדיקה נמדד על ידי שיטת הכדאיות. איור זה השתנה ממודולר ואח '3. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 7: שיטת גישוש להערכת התנגדות של TEבהחלט מודל אנטיגן מוגבל ציטוטוקסיים תא T בתיווך התקפה בתוך מבחנה. שמאל: ערכה של שיטת הבדיקה המגמטית. מימין: הכדאיות היחסית של B16/F10-OVA תאים שיתוף תרבותי עם מופעל CD8 + ctls (1:1 יחס) מבודדים מן טחולים של העכבר OT-I. P: וולש two-לדגום מבחן t. איור זה השתנה ממודולר ואח '3. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
RNA פול II בקרת התארכות התפתחה כמנוף מכריע עבור ויסות הביטוי הגנטי תגובה תמריץ לטובת תאים ממאירים5,7,8. התגברות על משהה הקדם-הפני משתהה התארכות והייצור mrna הבאים דורש את הפעילות קינאז של P-tefb9,10,11. המודל שלנו מנצל פלאפירידול (25 ננומטר), מעכב של הציקלאני החיוני CDK9 קינאז, כדי לחקות את פגמים שנצפו במהלך התארכות פול השני ב TEבהחלט סרטן – פנוטיפים לא ידוע בעבר סרטן שהתגלו על ידי הקבוצה שלנו בעבר3.
פעילות CDK9 קינאז כבר זמן רב ידוע להיות חיוני לזירחון של סרין 2 שאריות ב-CTD של יחידת המשנה הגדולה של פול השני. באופן קריטי, הצלחנו למטב פלאופלאפידולדול מטופל עיכוב כרונית של CDK9 (25 ננומטר לשבוע 1) ב B16/F10 בנובה כגון זה, בנוסף מעכב הזירחון CTD, 25 ננומטר לטיפול בשבוע 1 מונע מעבר שלאחר ההמרה הנכון שינויים של mRNA בדרך בלתי צפויה וביעילות abrogates p-TEFb-תלוי התארכות פרודוקטיבי לאורך גנים ארוכים כגון, pro-דלקתיות תגובה הגנים, שינוי משמעותי דפוסי הביטוי שלהם הן ב-mRNA ו רמות החלבון. למיטב ידיעתנו, אין מודל אחר המתואר בספרות אשר משיגה ביעילות את אותו הדבר.
זה קל להקים, המודל הניתן להתאמה של TEבהחלט יכול להיות ממונפת כדי לנתח, הן הטרנססקריפט ו epigenetic שינויים המאפשרים TE סרטןבהחלט להסתגל להתקפה החיסונית מתווכת התא. יתר על כן, זה מודל murine שומר שלה TEבהחלטכמו הפחתה של סך ו פוספאו-RNA פול II רמות 21 ימים לאחר שחרור פלאדידול ב vivo הצמיחה3 (לא הוזכר בפרוטוקול כאן), המציעה את היקף היציבות של זה מודל לא גנטי להמשך ניסויים vivo. עם זאת, הטיפול חייב להילקח כדי למטב את המינון המדויק משנה הקטלנית של פלאופאפידול עבור שורות murine אחרים (למשל, על 20 הטיפול בפלאנאפידול במשך 1 שבוע הוא מינון תת קטלני עבור קרצינומה MC38 murine קו; לא בשימוש פרוטוקול זה), ההשפעה של וריאציה בתא צפיפות הציפוי, תנאי התרבות, ותנאי הגירוי של ציטוקינים עשויים להשתנות עבור קווי מורטין שונים. הפרוטוקול המתואר כאן נותן מסגרת בסיסית כדי למזער את המשתנים הידועים להיות קריטיים עבור הדור של TEבהחלטכמו תכונות על ידי כרונית CDK9 עכבות. בנוסף, תאי קרצינומה של האדם, כגון T47D ו CAL51 נבדקו עם לטווח קצר (3 ימים) טיפולים פלאפידולדול מעניקה העלייה הדומה TEבהחלט-RNA פול השני פרופילים, המציין את התועלת של מעבר פלאופלאנאפידול מבוסס עיכוב כרונית של CDK9 תיווך תמלול התארכות ביצירת מודל קווי האדם אפילו ללמוד TEבהחלט.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
עבודה זו היתה בחלק נתמך על ידי NCI (CA193549) ו CCHMC חדשנות מחקר פיילוט פרסי Kakajan Komurov, ואת המחלקה להגנה (BC150484) הפרס על Navneet סינג. התוכן הוא אך ורק באחריות המחברים ואינו מייצג בהכרח את ההשקפות הרשמיות של המכון הלאומי לסרטן או של משרד הביטחון. לתורמים לא היה כל תפקיד בעיצוב הלמידה, איסוף נתונים וניתוח, החלטה לפרסם או הכנת כתב היד.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| hhis6FasL | Cell Signaling | 5452 | |
| 10X TBS | Bio-Rad | 170-6435 | |
| 12 well plates | Falcon | 353043 | |
| 20% methanol | Fisher Chemical | A412-4 | |
| 24-well plates | Falcon | 351147 | |
| 4–18% SDS polyacrylamide gel | Bio-Rad | 4561086 | |
| 4% Paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | AAJ19943K2 | |
| 5% dry milk | Bio-Rad | 170-6404 | |
| 7-Methylguanosine antibody | BioVision | 6655-30T | |
| 96-well plates | Cellstar | 655180 | |
| AF647-conjugated mouse CD8 | Biolegend | 100727 | |
| antibiotic and antimycotic | Gibco | 15240-062 | |
| anti-His antibody | Cell Signaling | 2366 P | |
| Anti-Rabit | Cell Signaling | 7074 | Dilution 1:5000 |
| Anti-Rat | Cell Signaling | 7077S | Dilution 1:5000 |
| Bradford assay Kit | Bio-Rad | 5000121 | |
| BSA | ACROS Organics | 24040-0100 | |
| BV421-conjugated mouse CD45 | Biolegend | 109831 | |
| crystal violet | Sigma | C3886-100G | |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | |
| Dynabeads Oligo (dT)25 | Ambion | 61002 | |
| FBS | Gibco | 45015 | |
| Fixable Live/Dead staining dye e780 | eBioscience | 65-0865-14 | |
| Flavopiridol | Selleckchem | S1230 | |
| H3k36me3 | Abcam | ab9050 | Dilution 1:2000 |
| IFN-α | R&D systems | 12100-1 | |
| IFN-γ | R&D systems | 485-MI-100 | |
| IMDM | Gibco | 12440053 | |
| Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate | Millipore | WBKLS0500 | |
| MojoSort Mouse CD8 T Cell Isolation Kit | Biolegend | 480007 | |
| NF-κB | Cell Signaling | 8242s | Dilution 1:1000 |
| PBS | Gibco | 14190-144 | |
| p-NF-κB | Cell Signaling | 3033s | Dilution 1:1000 |
| p-Ser2-RNAPII | Active Motif | 61083 | Dilution 1:500 |
| p-Ser5-RNAPII | Active Motif | 61085 | Dilution 1:1000 |
| p-STAT1 | Cell Signaling | 7649s | Dilution 1:1000 |
| RiboMinu Eukaryote Kit | Ambion | A10837-08 | |
| RIPA buffer | Santa Cruz Biotechnology | sc-24948 | |
| RNAPII | Active Motif | 61667 | Dilution 1:1000 |
| STAT1 | Cell Signaling | 9175s | Dilution 1:1000 |
| TNF-α | R&D systems | 410-MT-010 | |
| total H3 | Cell Signaling | 4499 | Dilution 1:2000 |
| Tri reagent | Sigma | T9424 | |
| Triton | Sigma | T8787-50ML | |
| Tween 20 | AA Hoefer | 9005-64-5 | |
| β-Actin | Cell Signaling | 12620S | Dilution 1:5000 |
| β-ME | G Biosciences | BC98 |
References
- Adelman, K., Lis, J. T. Promoter-proximal pausing of RNA polymerase II: emerging roles in metazoans. Nature Reviews Genetics. 13 (10), (2012).
- Margaritis, T., Holstege, F. C. Poised RNA polymerase II gives pause for thought. Cell. 133 (4), 581-584 (2008).
- Modur, V., et al. Defective transcription elongation in a subset of cancers confers immunotherapy resistance. Nature Communications. 9 (1), 4410 (2018).
- Hargreaves, D. C., Horng, T., Medzhitov, R. Control of inducible gene expression by signal-dependent transcriptional elongation. Cell. 138 (1), 129-145 (2009).
- Adelman, K., et al. Immediate mediators of the inflammatory response are poised for gene activation through RNA polymerase II stalling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (43), 18207-18212 (2009).
- van Stipdonk, M. J., Lemmens, E. E., Schoenberger, S. P. Naïve CTLs Require a Single Brief Period of Antigenic Stimulation for Clonal Expansion and Differentiation. Nature Immunology. 2 (5), 423-429 (2001).
- Gilchrist, D. A., et al. Regulating the regulators: the pervasive effects of Pol II pausing on stimulus-responsive gene networks. Genes & Development. 26 (9), 933-944 (2012).
- Danko, C. G., et al. Signaling pathways differentially affect RNA polymerase II initiation, pausing, and elongation rate in cells. Molecular Cell. 50 (2), 212-222 (2013).
- Nechaev, S., Adelman, K. Pol II waiting in the starting gates: Regulating the transition from transcription initiation into productive elongation. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Gene Regulatory Mechanisms. 1809 (1), 34-45 (2011).
- Zhou, M., et al. Tat modifies the activity of CDK9 to phosphorylate serine 5 of the RNA polymerase II carboxyl-terminal domain during human immunodeficiency virus type 1 transcription. Molecular and Cellular Biology. 20 (14), 5077-5086 (2000).
- Palancade, B., Bensaude, O. Investigating RNA polymerase II carboxyl‐terminal domain (CTD) phosphorylation. European Journal of Biochemistry. 270 (19), 3859-3870 (2003).
