Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

कैंसर में क्रोनिक CDK9 निषेध के एक Murine सेल लाइन आधारित मॉडल व्यापक गैर-आनुवंशिक ट्रांसक्रिटिकल दीर्घीकरण दोष (टीईनिश्चित रूप से) का अध्ययन करने के लिए

Published: September 26, 2019 doi: 10.3791/59910
Automatic Translation
1, 1, 1
1Division of Experimental Hematology and Cancer Biology, Cancer and Blood Diseases Institute, Cincinnati Children's Hospital Medical Center (CCHMC)

Summary

प्रोटोकॉल में गैर-आनुवंशिक दोषपूर्ण प्रतिलेखन दीर्घीकरण के इन विट्रो मर्निएन कार्सिनोमा मॉडल का विवरण दिया गया है। यहाँ, CDK9 की पुरानी निषेध समर्थक भड़काऊ प्रतिक्रिया जीन के साथ आरएनए पोल द्वितीय के उत्पादक दीर्घीकरण को दबाने के लिए प्रयोग किया जाता है नकल और नैदानिक overserved TEनिश्चित रूप से घटना का अध्ययन, सभी कैंसर प्रकार के बारे में 20% में मौजूद.

Abstract

हम पहले की सूचना दी है कि कैंसर का एक सबसेट वैश्विक प्रतिलेखन deregulations द्वारा परिभाषित किया गया है MRNA प्रतिलेखन दीर्घीकरण में व्यापक कमी के साथ (टीई) -हम इस तरह के कैंसर के रूप में TEनिश्चित रूप सेकहते हैं. विशेष रूप से, तेनिश्चित रूप से कैंसर नकली प्रतिलेखन और जीन के एक बड़े सेट में दोषपूर्ण MRNA प्रसंस्करण की विशेषता है, जैसे interferon/JAK/STAT और TNF/NF-जेडबी रास्ते, उनके दमन के लिए अग्रणी. टीनिश्चित रूप से गुर्दे सेल कार्सिनोमा और मेटास्टैटिक मेलेनोमा रोगियों में ट्यूमर के उपप्रकार काफी प्रतिरक्षा चिकित्सा में गरीब प्रतिक्रिया और परिणाम के साथ सहसंबंधित. TE निश्चित रूपसे कैंसर की जांच के महत्व को देखते हुए-के रूप में यह इम्यूनोथेरेपी के खिलाफ एक महत्वपूर्ण बाधा portends-इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य इन विट्रो TEनिश्चित रूप से माउस मॉडल स्थापित करने के लिए इन व्यापक, गैर-आनुवंशिक अध्ययन है कैंसर में प्रतिलेखन असामान्यताएं और नई अंतर्दृष्टि हासिल, मौजूदा दवाओं के लिए उपन्यास का उपयोग करता है, या इस तरह के कैंसर के खिलाफ नई रणनीति मिल. हम आरएनए पॉलिमरेज II (आरएनए पोल II) के सी-टर्मिनल दोहराने डोमेन (सीटीडी) पर सी-टर्मिनल दोहराने डोमेन (सीटीडी) पर सेरीन 2 अवशेषों के फॉस्फोरिएशन को समाप्त करने के लिए पुरानी फ्लेवोपिरिडॉल मध्यस्थता CDK9 अवरोध के उपयोग का विस्तार से, उत्पादक प्रतिलेखन में आरएनए पोल II की रिहाई को दबा रहे हैं बढ़ाव. यह देखते हुए कि TEनिश्चित रूप से कैंसर किसी भी विशिष्ट दैहिक उत्परिवर्तन के तहत वर्गीकृत नहीं कर रहे हैं, एक औषधीय मॉडल लाभप्रद है, और सबसे अच्छा व्यापक प्रतिलेखनीय और epigenetic दोष उन में मनाया नकल. flavopiridol की एक अनुकूलित sublethal खुराक का उपयोग ट्रांसक्रिप्शन दीर्घीकरण और MRNA प्रसंस्करण दोष में गैर आनुवंशिक व्यापक व्यवधान का एक सामान्य मॉडल बनाने में केवल प्रभावशाली रणनीति है, बारीकी से नैदानिक मनाया TE नकल निश्चित रूप से विशेषताओं. इसलिए, TE के इस मॉडलनिश्चित रूप से विच्छेदन करने के लिए leveraged किया जा सकता है, सेल-स्वायत्त कारकों उन्हें प्रतिरक्षा मध्यस्थता सेल हमले का विरोध करने में सक्षम करने के लिए.

Introduction

लगभग सभी सक्रिय जीनों की अभिव्यक्ति में एक प्रमुख दर-सीमा-निर्धारण कदम आरएनए पॉलिमरेज II (आरएनए पोल II) को प्रवर्तक-प्रोक्सिमल ठहराव से उत्पादक दीर्घीकरण1,2में संक्रमण है। यह देखते हुए कि ट्रांसपेरेंसी लम्बन के epigenetic dysgation TEनिश्चित रूप सेके रूप में परिभाषित कई मानव द्रोह की प्रगति में सहायता करता है , एक गरीब प्रतिक्रिया के लिए राशि समर्थक भड़काऊ प्रतिक्रिया रास्ते में suboptimal संकेतन के लिए अग्रणी और इम्यूनोथेरेपीकेलिए परिणाम 3 , इस प्रोटोकॉल के व्यापक लक्ष्य कैंसर में इन व्यापक गैर आनुवंशिक प्रतिलेखन असामान्यताओं का अध्ययन करने के लिए इन व्यापक गैर-आनुवंशिक ट्रांसक्रिप्शनल असामान्यताओं का अध्ययन करने के लिए इन विट्रो मॉडल में एक उपयोगी स्थापित करने के लिए है। इस प्रकाश में, CDK9 की पुरानी औषधीय निषेध का उपयोग प्रतिलेखन दीर्घीकरण और MRNA प्रसंस्करण दोष में गैर आनुवंशिक व्यापक व्यवधान का एक सामान्य योग्य मॉडल बनाने के लिए एक प्रभावशाली रणनीति है. पुरानी CDK9 निषेध का उपयोग करने के पीछे तर्क यह है कि यह आरएनए पोल द्वितीय के सी-टर्मिनल दोहराने डोमेन (सीटीडी) पर सेरीन 2 अवशेषों के फॉस्फोरिलेशन को समाप्त करता है, इस प्रकार उत्पादक प्रतिलेखन दीर्घीकरण में आरएनए पोल द्वितीय की रिहाई को दबा रहा है। इसके अलावा, TEनिश्चित रूप से कैंसर, हमारे समूह3द्वारा पहले वर्णित, किसी भी विशिष्ट दैहिक उत्परिवर्तन के तहत वर्गीकृत नहीं कर रहे हैं. इसलिए, एक गैर-आनुवंशिक (फार्माकोलॉजिकल) मॉडल लाभप्रद है और सबसे अच्छा उनमें मनाया व्यापक प्रतिलेखनीय और एपिजेनेटिक दोषों की नकल करता है। विधि इसमें murine कैंसर कोशिकाओं की पुरानी flavopiridol उपचार मॉडल की पीढ़ी और लक्षण का विवरण. इस विधि में स्पष्ट रूप से जीन ों के साथ प्रतिलेखन दीर्घीकरण को बाधित किया जाता है, जिसमें लंबे समय तक जीनोमिक लंबाई की विशेषता होती है, जिसमें तैयार प्रमोटर और प्रेरक अभिव्यक्ति जैसे TNF/NF-$B और इंटरफेरॉन/स्टेट संकेतन, गहराई से नियंत्रित स्तर पर नियंत्रित होता है प्रतिलेखन दीर्घीकरण3,4,5. कुल मिलाकर, ट्रांसक्रिप्शनल दीर्घीकरण दोष के इस अनुकूलित murine सेल लाइन मॉडल-हमारे ज्ञान के लिए केवल मॉडल नव वर्णित TEनिश्चित रूप से ट्यूमर का अध्ययन करने के लिए विरोधी ट्यूमर प्रतिरक्षा हमले के लिए प्रतिरोध ड्राइव, शोषण करने के लिए एक उपयोगी प्रणाली प्रतिपादन और प्रतिरक्षा-मध्यस्थ कोशिका हमले की तुलना में कैंसर में कोर प्रतिलेखन मशीनरी में गैर-आनुवंशिक दोषों की कमजोरियों की जांच करें।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति और सिनसिनाटी बाल अनुसंधान फाउंडेशन के संस्थागत जैव सुरक्षा समिति सभी पशु प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं को मंजूरी दे दी (IACU प्रोटोकॉल #2017-0061 और IBC प्रोटोकॉल #IBC2016-0016), और इन प्रयोगशाला पशुओं की देखभाल और उपयोग के लिए NIH गाइड में वर्णित के रूप में मानकों के अनुसार प्रयोग किए गए थे.

1. flavopiridol उपचार द्वारा आरएनए पोल द्वितीय के जीर्ण निषेध-बुनियादी रणनीति

  1. बीज B16/F10 माउस मेलेनोमा कोशिकाओं कम घनत्व में (0.2 x 106) उनके इसी माध्यम में एक 10 सेमी संस्कृति प्लेट में (Dulbecco के संशोधित ईगल मध्यम [DMEM], 10% भ्रूण गोजातीय सीरम [FBS], 1% पेनिसिलिन और streptomycin [पेन / एक 37 डिग्री सेल्सियस में, 5% सीओ2 humidified इनक्यूबेटर.
  2. दिन के बाद, 1x फॉस्फेट-बफर नमकीन (पीबीएस) के साथ कोशिकाओं को धोने और एक sublethal खुराक के साथ संस्कृति मीडिया का एक नया बैच जोड़ें (के रूप में अनुमानित 25 एनएम) FLAvoidolpir-एक अवरोध कनेरा के आरएनए पोल द्वितीय बढ़ाना कारक p-TEFb (cyclin T/CDK9) आगे के बिना एक सप्ताह के लिए उप-कुलीकरण.
  3. flavopiridol उपचार के एक सप्ताह के बाद, TEनिश्चित रूप से कैंसर में देखा प्रतिवर्तन दीर्घीकरण दोष के विभिन्न विशेषताओं recapitulate करने के लिए मॉडल की क्षमता का मूल्यांकन करने के लिए confirmatory assays प्रदर्शन.

2. Confirmatory इम्यूनोब्लॉट परख दोषपूर्ण आरएनए पोल द्वितीय समारोह और interferon की हानि का आकलन करने के लिए (IFN) मार्ग और ट्यूमर नेक्रोसिस कारक (TNF) मार्ग उत्पन्न माउस TEनिश्चित रूप से मॉडल में संकेत

  1. संस्कृति बराबर संख्या (105) flavopiridol इलाज B16/F10 माउस मेलेनोमा कोशिकाओं और माता पिता का B16/F10 माउस मेलेनोमा कोशिकाओं के दो अलग अलग सेट में 12 अच्छी तरह से प्लेटों (एक सेट आरएनए पोल द्वितीय कार्यात्मक लक्षण के लिए सेट और cytokine के लिए अन्य सेट उत्तेजना) एक 5% सीओ2 आर्द्र इनक्यूबेटर में रात भर में 37 डिग्री सेल्सियस पर।
  2. अगले दिन, cytokine उत्तेजना में कोशिकाओं माउस IFN-$, IFN-$ (5 ng/mL), या TNF-$ (5 ng/mL) के साथ सेट की कोशिकाओं का इलाज 37 डिग्री सेल्सियस पर 45 मिनट के लिए.
  3. अब, दोनों साइटोकीन और आरएनए पोल द्वितीय कार्यात्मक लक्षणीकरण में कोशिकाओं से प्रोटीन निकालने के लिए निम्नलिखित तरीके से एक radioimmunoiformiation परख (RIPA) lysis बफर का उपयोग कर सेट:
    1. 1x पीबीएस के साथ कोशिकाओं को धो एंबर और इसे 50 डिग्री सेल्सियस के साथ lysis बफर प्रति अच्छी तरह से धोएं। स्क्रैप, और फिर 4 डिग्री सेल्सियस, 21,130 x gपर lysed कोशिकाओं गोली।
    2. सेल lysate supernatants में प्रोटीन उपाय डिटर्जेंट solubilization के बाद प्रोटीन एकाग्रता के लिए एक मानक colorimetric परख का उपयोग कर (ब्रैडफोर्ड या एक समान परख).
  4. मापा प्रोटीन की बराबर मात्रा लोड (15 डिग्री) प्रत्येक नमूने से एक 4% $18% सोडियम dodecyl सल्फेट (एसडीएस) polyacrylamide जेल में चलाने के लिए, और उन्हें polyvinylidene difluoride (PVDF) झिल्ली पर स्थानांतरित.
  5. पीवीडीएफ झिल्ली को tris-buffered saline-polysorbate 20 (TBST) में 5% सूखी दूध में ब्लॉक 1 एच के लिए एक रात में इनक्यूबेशन के बाद 4 डिग्री सेल्सियस पर प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ (RNA पोल द्वितीय 1:1000; p-SER2 आरएनए पोल II 1:1000; p-SER5 आरएनए पोल II 1:1000; H3K36me3 1:2000; कुल H3 1:2000; STAT1 1:1000; p-STAT1 1:1000; एन एफ जेडबी 1:1000; च-एनएफजेडबी 1:1000; $-Actin 1:5000) में 5% गोजातीय सीरम एल्बुमिन.
  6. दिन के बाद, कमरे के तापमान (आरटी) पर 15 मिनट के लिए 1x TBST के साथ PVDF झिल्ली धोने, और उन्हें उचित माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेट (विरोधी rat [1:5000] आरएनए पोल द्वितीय के लिए, पी-SER2 आरएनए पोल द्वितीय, और p-SER5 आरएनए पोल द्वितीय; विरोधी रैबिट (1:5000) H3K36me3, कुल, H3K3me3 के लिए, कुल, H3K36me3, के लिए STAT1, p-STAT1, NF$B, और p-NF$B) आरटी पर 50 मिनट के लिए. बढ़ी हुई केमियुमिनेंस के साथ व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हॉर्सराडिश peroxidase (एचआरपी) सब्सट्रेट का उपयोग कर प्रोटीन संकेतों का पता लगाएँ।
    नोट: जेड-Actin प्राथमिक इस्तेमाल किया HRP-संयुग्मी है, इसलिए यह एक माध्यमिक के बिना विकसित किया जा सकता है.

3. जनरेट किया माउस TEनिश्चित रूप से मॉडल में MRNA प्रसंस्करण दोष का आकलन करने के लिए Confirmatory परख

  1. बीज बराबर संख्या (0.2 x 106) flavopiridol इलाज B16/F10 माउस मेलेनोमा कोशिकाओं और माता पिता B16/F10 माउस मेलेनोमा कोशिकाओं में 6 अच्छी तरह से प्लेटों में 37 डिग्री सेल्सियस में एक 5% सीओ2 humidified इनक्यूबेटर रात भर.
  2. आरएनए निष्कर्षण अभिकर्मक या किट(सामग्री की तालिका) का उपयोग करके 60% संगम पर सुसंस्कृत कोशिकाओं से कुल आरएनए निकालें ।
  3. निम्नलिखित तरीके से कुल निकाले गए आरएनए से आरएनए को कम करें:
    नोट: एक कम निवेश प्रोटोकॉल rRNA को कम करने के लिए एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट से सह-opted किया गया है
    1. एक पानी स्नान या गर्मी ब्लॉक को 70 डिग्री 75 डिग्री सेल्सियस, और एक अन्य पानी स्नान या गर्मी ब्लॉक 37 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें।
    2. कुल आरएनए (100 डिग्री 500 एनजी में जोड़ें 2 $L nuclease-मुक्त पानी के) के साथ 1 $L चयनात्मक rRNA कमी जांच के और एक microcentrifuge ट्यूब में संकरीकरण बफर के 30 $L के साथ, धीरे से भ्रमिल द्वारा मिश्रण और उन्हें 70 डिग्री 75 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए.
    3. अब, ट्यूबों को 37 डिग्री सेल्सियस जल स्नान/हीट ब्लॉक में स्थानांतरित करें, और नमूने को 30 मिनट की अवधि में 37 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा करने की अनुमति दें।
    4. वरीय तांडव द्वारा चयनात्मक RRNA कमी जांच चुंबकीय मोती को पुन: निलंबित करें, और एक 1.5 एमएल RNase मुक्त microcentrifuge ट्यूब में मोती के alicot 75 डिग्री एल.
    5. मनका निलंबन को 1 मिनट के लिए चुंबकीय विभाजक पर रखें. मनकों को व्यवस्थित होने दें. धीरे से aspirate और supernatant त्याग दें. एक बार फिर से मोती धोने nuclease मुक्त पानी के 75 डिग्री सेल्सियस जोड़ने और चुंबकीय जुदाई के बाद supernatant discarding द्वारा दोहराएँ.
    6. 75 डिग्री सेल्सियस संकरीकरण बफर में धोया मोती को पुन: निलंबित करें, और एक अन्य ट्यूब के लिए इसे के alicot 25 डिग्री सेल्सियस और बाद में उपयोग के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखने के।
    7. शेष 50 डिग्री सेल्सियस मोती को चुंबकीय विभाजक पर 1 मिनट के लिए रखें और सुपरनेंट को त्याग दें। 20 डिग्री सेल्सियस बफर में मोती को पुन: निलंबित करें और बाद में उपयोग के लिए इसे 37 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखें।
    8. RNA/चयनात्मक RRNA कमी जांच मिश्रण को 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस के लिए ठंडा करने के बाद, ट्यूब के नीचे करने के लिए नमूना इकट्ठा करने के लिए संक्षेप में ट्यूब centrifuge।
    9. चरण 3-3-7 से तैयार चुंबकीय मोतियों में आरएनए/चयनात्मक आरएनए कमी जांच मिश्रण का 33 डिग्री सेल्सियस स्थानांतरण। कम गति भंवर द्वारा मिक्स.
    10. ट्यूब को 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। ऊष्मायन के दौरान, धीरे सामग्री कभी कभी मिश्रण. ट्यूब के नीचे करने के लिए नमूना इकट्ठा करने के लिए संक्षिप्त centrifugation द्वारा पीछा किया.
    11. RNA-प्रोब परिसर गोली करने के लिए 1 मिनट के लिए एक चुंबकीय विभाजक पर ट्यूब रखें. इस बार महादलित को मत छोड़ें। अधिनांत में आरएनए-विक्षत आरएनए होता है।
    12. 1 मिनट के लिए एक चुंबकीय विभाजक पर चरण 3.3.6 से मोती के 25 डिग्री एल की ट्यूब प्लेस और supernatant त्यागें. मनकों की नई ट्यूब के लिए चरण 3.3.11 से supernatant जोड़ें. कम गति भंवर द्वारा मिक्स.
    13. ट्यूब को 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। ऊष्मायन के दौरान, धीरे सामग्री कभी कभी मिश्रण. ट्यूब के नीचे करने के लिए नमूना इकट्ठा करने के लिए ट्यूब को संक्षिप्त रूप से अपकेंद्रण।
    14. RNA-प्रोब परिसर गोली करने के लिए 1 मिनट के लिए एक चुंबकीय विभाजक पर ट्यूब रखें. महादलित को मत छोड़ें। सुपरनेटेंट (लगभग 53 डिग्री सेल्सियस) को आर.एन.ए.ए.-डिक्ट ्ड आरएनए को एक नई नली में स्थानांतरित करें।
    15. एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर द्वारा आरएनए उपज की एकाग्रता को मापने.
  4. ओलिगो (डीटी)25 युक्त चुंबकीय मोती के लिए इनपुट के रूप में rRNA-depleted नमूनों में से एक आधा का उपयोग करें polyA+ आरएनए निम्नलिखित तरीके से निकालने के लिए:
    नोट: चुंबकीय मोती की सतह के लिए बाध्य ओलिगो डीटी दृश्यों का उपयोग कर polyA पूंछ दूत आरएनए अलग करने के इस प्रोटोकॉल एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट (सामग्री की तालिका)से सह-opted किया गया है।
    1. शीशी में ओलिगो डीटी मोती को संक्षेप में भ्रमिल करके , 30 s के लिए और एक ट्यूब के लिए ओलिगो डीटी मोती के 200 $L हस्तांतरण द्वारा शीशी में resuspend. बाइंडिंग बफ़र की एक ही मात्रा (200 $L) जोड़ें, और पुन: निलंबित करें।
    2. ट्यूब को चुंबक में 1 मिनट के लिए रखें और सुपरनेंट को त्याग दें। अब, चुंबक से ट्यूब को हटा दें और बाइंडिंग बफर के 100 डिग्री एल में धोया ओलिगो डीटी मोती को पुन: निलंबित करें।
    3. 10 उम त्रिस-एचसीएल चह 7ण्5 के साथ 100 डिग्री सेल्सियस के इनपुट rRNA-depleted कुल आरएनए नमूने की मात्रा को समायोजित करें। अब, बाइंडिंग बफर के 100 $L जोड़ें।
    4. माध्यमिक आरएनए संरचनाओं को बाधित करने के लिए 2 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस गर्मी। अब, तुरंत बर्फ पर जगह है.
    5. कुल आरएनए के 200 $L को 100 डिग्री सेल्सियस धोया मोती में जोड़ें। अच्छी तरह से मिलाएं और आरटी में 5 मिनट के लिए एक रोटर पर लगातार घूर्णन द्वारा बाध्यकारी अनुमति देते हैं।
    6. 1-2 मिनट के लिए चुंबक पर ट्यूब प्लेस और ध्यान से सभी supernatant हटा दें और ध्यान से सभी supernatant हटा दें.
    7. चुंबक से ट्यूब निकालें और धोने बफर के 200 डिग्री सेल्सियस जोड़ें.
  5. एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर द्वारा निकाले गए polyA+ आरएनए की शुद्धता और एकाग्रता को मापने।
    नोट: एक 260/280 अनुपात 1.90 डिग्री 2.00, और सभी आरएनए नमूनों के लिए 2.00 डिग्री 2.20 के 260/230 अनुपात स्वीकार्य माना जाता है।
  6. धारा 3.3 से आर.एन.ए.ए. से प्राप्त नमूनों के शेष आधे का उपयोग प्रोटीन ए कॉलम में इनपुट के रूप में करें (आरएनए इम्यूनोप्रिसिएरिटेशन [आरआईपी] किट में प्रदान किया गया है, सामग्री की तालिका) मोनोक्लोनल 7-मेथिलगुआनोसाइन का उपयोग करके पांच-प्राइम कैप्ड आरएनए को प्रतिरक्षा के लिए निम्नलिखित तरीके से एंटीबॉडी:
    नोट: एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध आरएनए इम्यूनोप्रीसिप्शन किट का उपयोग करके m7G छाया हुआ दूत आरएनए को अलग करने के इस प्रोटोकॉल को सह-opted और आगे संशोधित किया गया है।
    1. मोती के लिए एंटीबॉडी पूर्व-बाइंड करने के लिए निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार आरआईपी किट से प्राप्त प्रोटीन एक चुंबकीय मोती धोएं।
    2. 7-मेथिलगुआनोसिन एंटीबॉडी (रैबिट आईजीजी किट में प्रदान की गई) के 3 डिग्री ग्राम को किट से 100 डिग्री एल धोने बफर में निलंबित माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में मोती के लिए नकारात्मक नियंत्रण किया जा सकता है।
    3. RT. Centrifuge ट्यूबों पर 30 मिनट के लिए कम गति रोटेशन के साथ इनक्यूबेट संक्षेप में और फिर एक चुंबकीय विभाजक पर ट्यूबों जगह, हटाने और supernatant त्यागदें.
    4. ट्यूब निकालें और किट और भंवर संक्षेप से धोने बफर के 500 $L जोड़ें. ट्यूबों को संक्षिप्त रूप से एक बार फिर से चुंबकीय पृथक्करण के बाद, अति-नाटिका को हटा दें और छोड़ दें।
    5. चरण 3.6.4 एक बार फिर दोहराएँ.
    6. लगभग 120 एनजी आरएनए समाप्त (अनुभाग 3.3 से) को पूर्ववाश ित 7-मेथिलगुआनोसाइन एंटीबॉडी बाउंड मोती में जोड़ें। RNase अवरोध करनेवाला के 1 $L जोड़ें. हल्के आंदोलन के साथ 1 $ 1.5 एच के लिए आरटी में इनक्यूबेट।
    7. 10 s के लिए 300 x ग्राम पर मोती नीचे स्पिन और एक नया microcentrifuge ट्यूब करने के लिए uncapped (गैर-7-मिथाइलguanosine) MRNA युक्त supernatant हटा दें।
    8. 100 डिग्री सेल्सियस का वॉश बफर डालें और इसे इसी तरह दो बार धो लें। एकत्र किए गए सुपरनेंट को उसी माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में पूल करें, जिसका लेबल अनकेप्ड (गैर-7-मेथिलगुआनोसाइन) एमआरएनए। बर्फ पर स्टोर.
    9. Elute छाया हुआ (7-मेथिलगुआनोसाइन) यूरिया lysis बफर (ULB) जिसमें 7 एम यूरिया, 2% एसडीएस, 0.35 एम NaCl, 10 एम एम EDTA और 10 एम एम Tris, पीएच 7.5 के साथ मोती गर्म करके mrna 2 3 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर मोती गर्म करके.
    10. फीनोल के 300 डिग्री सेल्सियस के साथ एल्यूटेड नमूनों (कैप्ड और अनकैप्ड एमआरएनए) के 300 डिग्री एल के मिक्स 300 डिग्री सेल्सियस:क्लोरोफॉर्म:आइसोमिल अल्कोहल (25:24:1; वाणिज्यिक रूप से उपलब्ध) (4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत)। उलटा द्वारा अच्छी तरह से मिलाएं और के बारे में 10 मिनट के लिए छोड़ तो फिर धीरे मिश्रण.
    11. 2 मिनट के लिए 18,928 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज और ध्यान से ताजा ट्यूब के लिए शीर्ष परत pippette और नीचे परत त्याग.
    12. नमूनों में 300 डिग्री सेल्सियस फीनॉल जोड़ें:क्लोरोफॉर्म:आइसोमिल अल्कोहल (25:24:1; 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत)। 1 मिनट के लिए 18,928 x g पर उलटा करके अच्छी तरह से मिलाएं और फिर सेंट्रीफ्यूज करें। ध्यान से, शीर्ष परत को एक ताजा ट्यूब और डिस्कार्ड नीचे परत में पिपेट करें।
    13. छाया हुआ और अनकेप्ड आरएनए में 300 डिग्री सेल्सियस 2-पोरपैनॉल और 3 एम सोडियम ऐसीटेट (पीएच 5.2) के 30 डिग्री सेल्सियस जोड़ें। नमूने को कई बार उलटा करें और इसे 20 डिग्री सेल्सियस के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
    14. अब, 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 18,928 x g पर नमूने centrifuge. ध्यान से supernatant निकालें और 70% इथेनॉल के 500 $L जोड़ें.
    15. सेंट्रीफ्यूज फिर से 18,928 x g पर 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर। ध्यान से supernatant त्याग ें और कम से कम 5 मिनट के लिए आरटी पर गोली सूखी. nuclease मुक्त पानी में गोली resuspend.
  7. एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर द्वारा आरएनए उपज की शुद्धता और एकाग्रता को मापने। 260/280 अनुपात 1.90 डिग्री 2.00 की सीमा में होना चाहिए, और सभी आरएनए नमूनों के लिए 2.00 डिग्री 2.20 की श्रेणी में 260/230 अनुपात होना चाहिए।

4. पुष्टित्मक परख माउस TEकी प्रतिक्रिया का आकलन करने के लिए निश्चित रूप से FasL मध्यस्थता सेल मौत के लिए मॉडल

  1. बीज बराबर संख्या (30,000 कोशिकाओं) flavopiridol इलाज B16/F10 माउस मेलेनोमा कोशिकाओं और माता पिता B16/F10 माउस मेलेनोमा कोशिकाओं में एक 96 अच्छी तरह से संस्कृति प्लेट में उनके इसी माध्यम (DMEM), और एक 37 डिग्री सेल्सियस में रात भर इनक्यूबेट, 5% सीओ2 humidified मशीन.
  2. एक संस्कृति हुड में कोशिकाओं को एच की विभिन्न सांद्रता के साथ व्यवहार करेंउसके6FasL (0.1 डिग्री 1000 एनजी/एमएल) की उपस्थिति में 10 डिग्री/
  3. 1x पीबीएस बफर के साथ धोने से मृत कोशिकाओं को निकालें। आरटी पर 20 मिनट के लिए 4% पैराफॉर्मेल्डिहाइड में संलग्न कोशिकाओं को ठीक करें। 30 मिनट के लिए 4% पैराफॉर्मेल्डिहाइड (धोने की कोई जरूरत नहीं) को त्यागें, और क्रिस्टल वायलेट समाधान (20% मेथनॉल, 0.5% क्रिस्टल बैंगनी में 1x पीबीएस) के साथ दाग को छोड़ दें।
  4. नल के पानी में प्लेटों को धीरे से rinsing द्वारा अतिरिक्त दाग निकालें. प्लेटों को आरटी पर सूखने के लिए रखें।
  5. 1x nonionic सर्फैक्टेंट के 100 $L में क्रिस्टल बैंगनी को फिर से भंग 1x पीबीएस में भंग कर दिया, और एक माइक्रोप्लेट रीडर में 570 एनएम पर अवशोषण को मापने के द्वारा सेल घनत्व को मापने।

5. अन्वेषणात्मक परख माउस TE की प्रतिक्रिया का आकलन करने के लिएनिश्चित रूप से एंटीजन विशिष्ट साइटोटॉक्सिक टी सेल हमले के लिए मॉडल

  1. अलगाव और ओटी-I CD8 + cytotoxic टी सेल हमले (CTL) के सक्रियण
    1. ओटी-I TCR Tg RAG-1/] चूहों की तिल्ली से CD8 + कोशिकाओं को शुद्ध चुंबकीय सेल जुदाई द्वारा एक माउस CD8 टी सेल अलगाव किट का उपयोग कर इस प्रकार है:
      1. पूर्ण RPMI मीडिया में दो ओटी-I TCR Tg RAG-1 से दो तिल्ली फसल।
      2. एक 70 m फिल्टर में तिल्ली मैश एक 50 एमएल RPMI के 20 एमएल से भरा ट्यूब पर रखा, एक सिरिंज के पीछे का उपयोग कर जब तक केवल वसा फिल्टर में पीछे छोड़ दिया है.
      3. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 220 x ग्राम पर प्रवाह के माध्यम से सेंट्रीफ्यूज। महादलित को त्याग दें।
      4. पिछले अपकेंद्रण कदम से तिल्ली गोली के लिए लाल रक्त कोशिका (आरबीसी) lysis बफर के 1 एमएल जोड़ें और 1 मिनट के लिए मिश्रण पिपेट।
      5. आरपीएमआई के 10 एमएल तक जोड़कर समाधान को निष्क्रिय करें।
      6. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 220 x g पर सेंट्रीफ्यूज। सुपरनेंट को त्याग ें और आरपीएमआई के 10 एमएल में फिर से निलंबित करें।
      7. गिनती के लिए एक छोटा सा alicot ले लो. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 220 x ग्राम पर शेष सेंट्रीफ्यूज।
      8. गिना हर लाख कोशिकाओं के लिए, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध चुंबकीय जुदाई प्रणाली बफर (मोजो बफर या एक समान बफर) के 1 एमएल में गोली resuspend.
      9. चरण 5.1.8 में गोलीमार कोशिकाओं के हर 1 एमएल के लिए मात्रा 100 $L का एक एंटीबॉडी कॉकटेल तैयार करें। एंटीबॉडी कॉकटेल में शामिल हैं: बायोटिन एंटी-सीडी 4, CD105, CD45R/B220, CD11c, CD49b, TER-119, CD19, CD11b, TCR /
      10. 1 एमएल छर्रों दारे कोशिकाओं के लिए इस कॉकटेल जोड़ें और 15 मिनट के लिए बर्फ पर रहते हैं.
      11. एंटीबॉडी कॉकटेल के हर 100 डिग्री सेल्सियस के लिए चुंबकीय (streptavidin) मोती के 100 डिग्री एल जोड़ें 1 एमएल resuspended छर्रों तिल्ली कोशिकाओं को जोड़ा. 15 मिनट के लिए बर्फ पर रखें.
      12. व्यावसायिक रूप से उपलब्ध चुंबकीय पृथक्करण प्रणाली बफर के 7 एमएल जोड़ें। अब, एक ताजा ट्यूब के लिए मिश्रण के बारे में 3 डिग्री 4 एमएल के बारे में aliquot. अच्छी तरह से मिलाएं और यह 5 मिनट के लिए चुंबक को ठीक.
      13. बर्फ पर एक ताजा ट्यूब के लिए तरल (CD8 + कोशिकाओं को शामिल करता है) decant. अब, एलिकोट शेष 3 डिग्री 4 एमएल मिश्रण के चरण 5.1.1.12 से ट्यूब के लिए और इसे 5 मिनट के लिए चुंबक को ठीक करें। तरल (CD8+ कोशिकाओं के दूसरे बैच को अलग) उसी ट्यूब में, जिसमें CD8+ कोशिकाओं के पहले बैच को बर्फ पर रखा गया था।
    2. बीज इंजीनियर अनुयायी फाइब्रोब्लास्ट एपीसी-(एमईसी। B7. सिगोवा) लाइन एक विशिष्ट ovalbumin व्यक्त करने के लिए (OVA)-व्युत्पन्न, एच-2Kb-प्रतिबंधित पेप्टाइड epitope OVA257-264 (SIINFEKL), सह उत्तेजक अणु B7.1 के साथ, 75,000 कोशिकाओं पर अच्छी तरह से 24-अच्छी प्लेटों में, 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 आर्द्र इनक्यूबी इनक्यूबामेंड पर।
      नोट: इस्तेमाल किया अनुयायी फाइब्रोब्लास्ट CCHMC में डॉ Edith Janssen की प्रयोगशाला से एक उपहार है। लाइन एलर्जी और इम्यूनोलॉजी6के लिए ला Jolla संस्थान में डॉ स्टीफन पी Schoenberger प्रयोगशाला में मूल रूप से बनाया गया था.
    3. 24 ज के बाद, एक बार Iscove के संशोधित Dulbecco के माध्यम (IMDM) के साथ एक बार aPC के मोनोलेयर धोने HEPES बफर, सोडियम pyruvate, एल-ग्लूटामाइन और उच्च ग्लूकोज के साथ व्यावसायिक रूप से उपलब्ध है), और जोड़ें 0.5 x 106 भोले ओटी-I CD8 + कोशिकाओं (चरण 5.1.1.13 से) IMDM के 2 एमएल में 50 एम एम जेड-एमई, 2 एमएल EDTA, 4 एमएम एल-ग्लूटामाइन और HEPES और 10% FBS के साथ पूरक।
    4. 20 ज के बाद, धीरे से गैर-अनुरूप ओटी-I कोशिकाओं को फसल (उड़ान ओटी-I कोशिकाओं के साथ संस्कृति डिश में मीडिया इकट्ठा करके और 2 मिनट के लिए 191 x g पर कोशिकाओं को छर्रने के द्वारा; व्यवहार्य ओटी-I कोशिकाओं की गणना करें) और उन्हें सह-संस्कृति के लिए स्थानांतरित करें।
  2. B16/F10-OVA कोशिकाओं के साथ CD8 + कोशिकाओं की सह-संस्कृति
    1. बीज OT-I व्युत्पन्न CD8 + कोशिकाओं के अनुपात में 1:1 (300,000 कोशिकाओं प्रत्येक) के साथ एक सह संस्कृति में B16/F10 (एंटीजन ovalbumin, अनुपचारित B16/F10-OVA, और B16/F10-OVA कोशिकाओं के साथ पूर्व इलाज flavopiridol (25 nM) 1 सप्ताह के लिए, अच्छी तरह से 6 बर्तन के साथ पूरा, अच्छी तरह से 6 बर्तन के साथ एक 5% सीओ2 humidified इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर 20 एच के लिए मीडिया।
    2. 20 ज के बाद, ओटी-I व्युत्पन्न CD8 + कोशिकाओं को निकालें (चल ओटी-I व्युत्पन्न CD8 + कोशिकाओं के साथ संस्कृति डिश में मीडिया को इकट्ठा करके)। 1x पीबीएस में अनुयायी B16/F10-OVA कोशिकाओं को धो लें।
    3. 0.05% EDTA में संलग्न B16/F10-OVA कोशिकाओं के तीन समूहों trypsinize 5 मिनट के लिए trypsinized कोशिकाओं को 191 x ग्राम पर गोली 5 मिनट के लिए.
    4. उन्हें ठंड पीबीएस में incubating द्वारा काटा B16/F10-OVA कोशिकाओं दाग ( 0.5% FBS और 0.05% सोडियम azide युक्त) व्यवहार्यता डाई और प्रासंगिक लेबल एंटीबॉडी के साथ (स्थिर व्यवहार्यता दाग डाई e780, AF647-संयुग्मी माउस 8 और BV421-संयुग्मी माउस CD45 ).
    5. प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा B16/F10-OVA कोशिकाओं के तीन समूहों की व्यवहार्यता का विश्लेषण करें।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

यहाँ, हम एक विस्तृत योजना प्रदानकरते हैं( चित्र 1 ) पुरानी उप-घातक द्वारा प्राप्त एक टीनिश्चित रूप से सेल मॉडल स्थापित करने के लिए ( चित्र2) 25 नृ दें पर फ्लेवोपिरिडॉल के साथ उपचार। चित्रा 3में , flavopiridol के साथ उपचार के 3 दिनों पर, B16 OVA कोशिकाओं TE की आंशिक विशेषताओंको निश्चित रूप से दिखाने के लिए, लेकिन उपचार के एक सप्ताह के बाद, B16/F10 OVA कोशिकाओं के साथ आरएनए पोल द्वितीय के सीटीडी पर serine 2 स्थिति में फॉस्फोरिलेशन का एक गहरा नुकसान दिखा H3K36me3 में एक महत्वपूर्ण कमी के साथ-एक हिस्टोन संशोधन exon सीमाओं को परिभाषित करने में फंसा हुआ है और रन-अवे गुप्त transcriptions के एक अवरोध करनेवाला. एक परिणामके रूप में, TE निश्चित रूप से सेल मॉडल अनुचित तरीके से छाया हुआ और गैर-पॉली-adenylated MRNAs के प्रकट रूप से वृद्धि अनुपात के साथ महत्वपूर्ण MRNA प्रसंस्करण दोष से पता चलता है (चित्र 4ए, बी)। इसके अलावा, मुख्य भड़काऊ प्रतिक्रिया पथ जीनों और फाएसएल मध्यस्थता कोशिका मृत्यु पथ का विशिष्ट दमन चित्र 5 और चित्र 6में देखा गया है। इंटरफेरॉन के लिए लगाया प्रतिरोध (IFN-जेड, IFN$) और TNF-[उत्तेजित STAT1 और एन एफ जेडबी के फॉस्फोरिलेशन, और मौत रिसेप्टर ligand FasL द्वारा सेल मौत के लिए प्रतिरोध काफी तेजी से TE के खिलाफ एक प्रतिरक्षा सेल हमले की साइटोटॉक्सिसिटी कम कर देता हैनिश्चित रूप से ट्यूमर. इन पुष्टि तकनीकों को प्रतिलेखन दीर्घीकरण के लंबे क्षोभ के प्रभाव की सीमा का परीक्षण करने के लिए डिज़ाइन किया गया है उत्तेजना-प्रतिक्रियाशील जीन की एक विस्तृत सरणी पर है, और क्या किसी दिए गए माउस सेल लाइन मॉडल में इस तरह के एक क्षोभ पर्याप्त है सूजन प्रतिक्रिया संकेत जीन में कार्यात्मक MRNA की एक तीव्र कमी का संकेत, टीनिश्चित रूप से कैंसर चिकित्सकीय की बुनियादी अनिवार्यताओं की नकल. flavopiridol उपचार के हमारे अध्ययन के आधार पर, आरएनए पोल द्वितीय सीटीडी के दूसरे serine अवशेषों (pSER2) पर फॉस्फोरिलेशन के दमन महत्वपूर्ण है, के रूप में यह प्रतिलेखन बढ़ाव के निशान. किसी भी माउस कार्सिनोमा सेल लाइन के लिए एक sublethal खुराक वृद्धि और सेल लाइन की व्यवहार्यता पर एक तुच्छ प्रभाव होने के अलावा pSER2 के स्तर में कमी हासिल करना चाहिए. यद्यपि हम लगातार 25 एनएम flavopiridol उपचार पर pSER2 और H3K36me3 के स्तर में कमी देखते हैं, यह दोनों pSTAT1 और pNF]B के स्तर पर एक दमन की गारंटी नहीं है (IFN-जेड, IFN] और TNF-उत्तेजनाओं, क्रमशः). प्रत्येक माउस कार्सिनोमा सेल लाइन अद्वितीय है (B16/F10 OVA या CT26 समय की अवधि में विभिन्न प्रयोगशालाओं में सुसंस्कृत कोशिकाओं थोड़ा बदल प्रभाव हो सकता है) और वे या तो हो सकता है JAK1 या CCNT1 आंशिक रूप से दबाने में flavopiridol के प्रभाव को बचाने भड़काऊ प्रतिक्रिया पथ जीन. ऐसे मामलों में, pSTAT1 और pNF]B स्तरों की गतिजता को अलग-अलग समय बिंदुओं (5 डिग्री 70 मिनट) पर जांच करने की आवश्यकता हो सकती है ताकि फ्लेवोपिरिडोल मध्यस्थता प्रभावों की लौकिकता और या तो JAK1 या CCNT1 द्वारा इसके बचाव को समझा जा सके। तदनुसार, JAK1 और/या CCNT1 इस मॉडल को स्थापित करने के लिए नीचे खटखटाया जा करने की आवश्यकता हो सकती है.

एक बार flavopiridol मॉडल की स्थापना की है और ऊपर उल्लिखित परख का उपयोग कर विशेषता है, हम एक अन्वेषणात्मक परख प्रदान करने के लिए परीक्षण अगर TEनिश्चित रूप से सेल मॉडल cytotoxic टी सेल (CTL) हमले के लिए प्रतिरोध प्रदान करता है. हमारे अनुकूलित प्रोटोकॉल के आधार पर, flavopiridol इलाज B16/F10 कोशिकाओं stably OVA जीन overexpressing (B16 OVA) सह सक्रिय CD8 + CTLs के साथ इनक्यूबेट (OVA257-264 epitope के लिए विशिष्ट) OVA-expressing कोशिकाओं के लिए चयनात्मक विषाक्तता होने (डॉ. स्टीफन पी Schoenberger प्रयोगशाला6)ओटी-I CTL मध्यस्थता ट्यूमर lysis के लिए अतिसंवेदनशील नहीं थे. B16/F10 OVA कोशिकाओं (flavopiridol के साथ पूर्वउपचारित नहीं) इस प्रणाली में बड़े पैमाने पर सेल मौत हुई है, जबकि B16/F10 माता पिता की कोशिकाओं बच गया, क्योंकि वे OVA प्रतिजन व्यक्त नहीं करते (चित्र 7). यह सुझाव दिया अन्वेषणात्मक परख के परिणाम से स्पष्ट है कि पुरानी flavopiridol प्रेरितटीई निश्चित रूप से एक साधन के लिए विरोधी ट्यूमर प्रतिरक्षा हमले से बचने के लिए भी vivo में प्रदान कर सकते हैं. यह आगे में vivo ट्यूमर मॉडल में परीक्षण किया जा सकता है टीई की प्रवृत्ति की जांच करने के लिएनिश्चित रूप से मॉडल सहज और अनुकूली विरोधी ट्यूमर प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं से बचने के लिए. विरोधी asialo उपचार ट्यूमर असर चूहों में विवो में एनके कोशिकाओं की गतिविधि को विनियमित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इसके अलावा, प्रतिरक्षा जांच की चौकी चिकित्सा (विरोधी CTLA4 और विरोधी PD1) TEनिश्चित रूप से ट्यूमर असर चूहों के लिए प्रशासित किया जा सकता है.

समग्रता में, TEनिश्चित रूप से सुझाव दिया अन्वेषणात्मक परख के साथ पुष्टि यता कश एक साथ अन्य ट्यूमर प्रतिरक्षा परीक्षण की स्थिति की एक पूरी मेजबान में इस TE निश्चित रूपसे सेल मॉडल को शामिल करने की उपयोगिता का प्रदर्शन. इस मॉडल को ट्यूमर कोशिकाओं में दोषपूर्ण ट्रांसक्रिप्शनल दीर्घीकरण और प्रतिरक्षा सेल बातचीत के लिए उनकी प्रतिक्रिया से उत्पन्न आणविक विवरण को पार्स करने में मदद कर सकते हैं।

Figure 1
चित्र 1: कार्य प्रवाह का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: बी 16 OVA कोशिकाओं की सेल वृद्धि विशेषताओं लंबे समय से कम खुराक flavopiridol के साथ इलाज किया: व्यवहार्यता (जीवन क्षमता अभिकर्मक द्वारा मापा) नियंत्रण और flavopiridol इलाज कोशिकाओं B16 OVA संकेत दिनों के बाद उपचार पर. यह आंकड़ा मोदुर एट अल 3 से संशोधित किया गयाहै। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: आरएनए पोल द्वितीय और हिस्टोन प्रोफाइल का आकलन करने के लिए पुष्टि यता: 72 एच या 1 सप्ताह के लिए flavopiridol के साथ इलाज किया B16 OVA कोशिकाओं में संकेत histone और आरएनए पोल द्वितीय के निशान के इम्यूनोब्रोलॉट्स। यह आंकड़ा मोदुर एट अल 3 से संशोधित किया गयाहै। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4: MRNA प्रसंस्करण में गंभीर दोषों का आकलन करने के लिए पुष्टित्मक आमापन। 5 के अनुपात -अनकैप्ड से 5"-कैप्ड (ए) और 3 "गैर-पॉलीऐडेनीलेट 3]-पॉलीऐडेनीलेट(बी) एमआरएनए सांद्रता संकेतित सेल लाइनों में आरएनए कमी के बाद। त्रुटि पट्टियाँ तीन तकनीकी प्रतिकृतियां पर आधारित मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करती हैं. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्र 5: पुष्टित्मक परख साइटोकिन उत्तेजना प्रोफ़ाइल का आकलन करने के लिए। नियंत्रण और flavopiridol पूर्व इलाज B16 OVA कोशिकाओं में STAT1, pSTAT1, PSTAT1, NF$B और पी एन एफ जेडबी के इम्यूनोब्लॉट्स IFN-जेड, IFN के साथ प्रेरित या TNF-जेड पर 30 मिनट के लिए (5 एनजी / यह आंकड़ा मोदुर एट अल 3 से संशोधित किया गयाहै। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्र 6: पुष्टिय परख इन विट्रो में FasL मध्यस्थता सेल मौत के प्रतिरोध का आकलन करने के लिए. नियंत्रण और flavopiridol पूर्व इलाज B16 OVA कोशिकाओं के लिए FasL के साथ इलाज 24 h readout व्यवहार्यता परख द्वारा मापा. यह आंकड़ा मोदुर एट अल 3 से संशोधित किया गयाहै। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 7
चित्र 7: विस्तार कए गए ती के प्रतिरोध का आकलन करने के लएनिश्चित रूप से प्रतिजन-प्रतिबंधित साइटोटॉक्सिक टी सेल मध्ये आक्रमण इन विट्रो में मॉडलका आकलन करने के लिए । वाम: अन्वेषणात्मक परख की आरेखात्मक योजना. दाएँ: B16/F10-OVA कोशिकाओं की सापेक्ष व्यवहार्यता सक्रिय CD8 + CTLs (1:1 अनुपात) ओटी-I चूहों की तिल्ली से अलग के साथ सह-संस्कृत. पी:वेल्च दो नमूना टीपरीक्षण. यह आंकड़ा मोदुर एट अल 3 से संशोधित किया गयाहै। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

आरएनए पोल द्वितीय दीर्घीकरण नियंत्रण घातक कोशिकाओं5,7,8 के लाभ के लिए उत्तेजना-प्रतिक्रियाशील जीन अभिव्यक्ति को विनियमित करने के लिए एक निर्णायक लीवर के रूप में उभराहै। प्रवर्तक-आसन्न ठहराव को बढ़ावा देने और बाद में एम आर एन ए उत्पादन पर काबू पाने के लिए पी-टीईएफबी9,10,11के काइनेज गतिविधि की आवश्यकता होती है . हमारे मॉडल flavopiridol (25 एनएम), आवश्यक cyclin पर निर्भर kinase CDK9 के एक अवरोध करनेवाला का इस्तेमाल करता है, TE में पोल द्वितीय दीर्घीकरण के दौरान मनाया दोषों की नकल करने के लिएनिश्चित रूप से कैंसर में एक पहले से अज्ञात phenotype हमारे समूह द्वारा की खोज की कैंसर में पहले3|

सीडीके9 काइनाज गतिविधि लंबे समय से पोल II की बड़ी उपइकाई के सीटीडी में सेरीन 2 अवशेषों के फॉस्फोरिलेशन के लिए आवश्यक माना जाता रहा है। गंभीर रूप से, हम Flavopiridol इलाज CDK9 के पुराने निषेध (25 nM 1 सप्ताह के लिए) B16/F10 OVA में इस तरह के अनुकूलन में सफल रहा है कि, CTDd phosphorylation को रोकने के अलावा, 25 एनएम flavopiridol उपचार 1 सप्ताह के लिए उचित पोस्ट-ट्रांसक्रिप्शनल रोकता है एक अप्रत्याशित तरीके से MRNA के संशोधनों और प्रभावी ढंग से इस तरह के समर्थक भड़काऊ प्रतिक्रिया संकेत जीन के रूप में लंबे समय जीन के साथ पी-TEFb-निर्भर उत्पादक दीर्घीकरण को समाप्त करता है, काफी दोनों MRNA पर अभिव्यक्ति के अपने पैटर्न बदलने और प्रोटीन का स्तर. हमारे ज्ञान का सबसे अच्छा करने के लिए, वहाँ कोई अन्य मॉडल साहित्य में वर्णित है जो प्रभावी ढंग से एक ही प्राप्त है.

यह आसान स्थापित करने के लिए, TE के generalizable मॉडलनिश्चित रूप से इसलिए विच्छेदन करने के लिए leveraged किया जा सकता है, दोनों transcriptional और epigenetic संशोधनों को सक्षम करने TE निश्चित रूपसे कैंसर प्रतिरक्षा मध्यस्थता सेल हमले के लिए अनुकूल है. इसके अलावा, इस murine मॉडल अपने TEनिश्चित रूप सेबरकरार रखता है - कुल और फॉस्फो- आरएनए पोल द्वितीय स्तर की तरह 21 दिन vivo विकास परख में flavopiridol रिलीज के बाद (यहाँ प्रोटोकॉल में उल्लेख नहीं), इस की स्थिरता की सीमा का सुझाव विवो प्रयोग में आगे के लिए गैर आनुवंशिक मॉडल. हालांकि, देखभाल अन्य murine लाइनों के लिए flavopiridol की सटीक sublethal खुराक का अनुकूलन करने के लिए लिया जाना चाहिए (उदाहरण के लिए, के बारे में 20 एनएम flavopiridol उपचार के लिए 1 सप्ताह MC38 murine कार्सिनोमा लाइन के लिए sublethal खुराक है; इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल नहीं), सेल में भिन्नता का प्रभाव चढ़ाना घनत्व, संस्कृति की स्थिति, और साइटोकिन उत्तेजना की स्थिति अलग murine लाइनों के लिए भिन्न हो सकते हैं. प्रोटोकॉल यहाँ वर्णित एक बुनियादी रूपरेखा देता है चर TE की पीढ़ी के लिए महत्वपूर्ण होने के लिए जाना जाता है कम से कमनिश्चित रूप से- पुरानी CDK9 निषेध द्वारा सुविधाओं की तरह. इसके अलावा, मानव कार्सिनोमा सेल लाइनों, जैसे T47D और CAL51 अल्पकालिक (3 दिन) flavopiridol उपचार के साथ परीक्षण किया गया है इसी तरह TE करने के लिए वृद्धि देनिश्चित रूप से- जैसे आरएनए पोल द्वितीय प्रोफाइल, flavopiridol आधारित पुरानी निषेध की उपयोगिता का संकेत CDK9 की मध्यस्थता प्रतिलेखन के लिए भी मॉडल मानव लाइनों बनाने में TEनिश्चित रूप सेअध्ययन करने के लिए .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

यह काम एनसीआई (CA193549) और सीसीएचएमसी रिसर्च इनोवेशन पायलट पुरस्कार काकाजन कोमुराव और रक्षा विभाग (बीसी 150484) ने नवनीत सिंह को प्रदान किया। सामग्री पूरी तरह से लेखकों की जिम्मेदारी है और जरूरी राष्ट्रीय कैंसर संस्थान या रक्षा विभाग के आधिकारिक विचारों का प्रतिनिधित्व नहीं करता है. funders अध्ययन डिजाइन, डेटा संग्रह और विश्लेषण, प्रकाशित करने का निर्णय, या पांडुलिपि की तैयारी में कोई भूमिका नहीं थी.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
hhis6FasL Cell Signaling 5452
10X TBS Bio-Rad 170-6435
12 well plates Falcon 353043
20% methanol Fisher Chemical A412-4
24-well plates Falcon 351147
4–18% SDS polyacrylamide gel Bio-Rad 4561086
4% Paraformaldehyde Thermo Fisher Scientific AAJ19943K2
5% dry milk Bio-Rad 170-6404
7-Methylguanosine antibody BioVision 6655-30T
96-well plates Cellstar 655180
AF647-conjugated mouse CD8 Biolegend 100727
antibiotic and antimycotic Gibco 15240-062
anti-His antibody Cell Signaling 2366 P
Anti-Rabit Cell Signaling 7074 Dilution 1:5000
Anti-Rat Cell Signaling 7077S Dilution 1:5000
Bradford assay Kit Bio-Rad 5000121
BSA ACROS Organics 24040-0100
BV421-conjugated mouse CD45 Biolegend 109831
crystal violet Sigma C3886-100G
DMEM Gibco 11965-092
Dynabeads Oligo (dT)25 Ambion 61002
FBS Gibco 45015
Fixable Live/Dead staining dye e780 eBioscience 65-0865-14
Flavopiridol Selleckchem S1230
H3k36me3 Abcam ab9050 Dilution 1:2000
IFN-α R&D systems 12100-1
IFN-γ R&D systems 485-MI-100
IMDM Gibco 12440053
Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate Millipore WBKLS0500
MojoSort Mouse CD8 T Cell Isolation Kit Biolegend 480007
NF-κB Cell Signaling 8242s Dilution 1:1000
PBS Gibco 14190-144
p-NF-κB Cell Signaling 3033s Dilution 1:1000
p-Ser2-RNAPII Active Motif 61083 Dilution 1:500
p-Ser5-RNAPII Active Motif 61085 Dilution 1:1000
p-STAT1 Cell Signaling 7649s Dilution 1:1000
RiboMinu Eukaryote Kit Ambion A10837-08
RIPA buffer Santa Cruz Biotechnology sc-24948
RNAPII Active Motif 61667 Dilution 1:1000
STAT1 Cell Signaling 9175s Dilution 1:1000
TNF-α R&D systems 410-MT-010
total H3 Cell Signaling 4499 Dilution 1:2000
Tri reagent Sigma T9424
Triton Sigma T8787-50ML
Tween 20 AA Hoefer 9005-64-5
β-Actin Cell Signaling 12620S Dilution 1:5000
β-ME G Biosciences BC98

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Adelman, K., Lis, J. T. Promoter-proximal pausing of RNA polymerase II: emerging roles in metazoans. Nature Reviews Genetics. 13 (10), (2012).
  2. Margaritis, T., Holstege, F. C. Poised RNA polymerase II gives pause for thought. Cell. 133 (4), 581-584 (2008).
  3. Modur, V., et al. Defective transcription elongation in a subset of cancers confers immunotherapy resistance. Nature Communications. 9 (1), 4410 (2018).
  4. Hargreaves, D. C., Horng, T., Medzhitov, R. Control of inducible gene expression by signal-dependent transcriptional elongation. Cell. 138 (1), 129-145 (2009).
  5. Adelman, K., et al. Immediate mediators of the inflammatory response are poised for gene activation through RNA polymerase II stalling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (43), 18207-18212 (2009).
  6. van Stipdonk, M. J., Lemmens, E. E., Schoenberger, S. P. Naïve CTLs Require a Single Brief Period of Antigenic Stimulation for Clonal Expansion and Differentiation. Nature Immunology. 2 (5), 423-429 (2001).
  7. Gilchrist, D. A., et al. Regulating the regulators: the pervasive effects of Pol II pausing on stimulus-responsive gene networks. Genes & Development. 26 (9), 933-944 (2012).
  8. Danko, C. G., et al. Signaling pathways differentially affect RNA polymerase II initiation, pausing, and elongation rate in cells. Molecular Cell. 50 (2), 212-222 (2013).
  9. Nechaev, S., Adelman, K. Pol II waiting in the starting gates: Regulating the transition from transcription initiation into productive elongation. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Gene Regulatory Mechanisms. 1809 (1), 34-45 (2011).
  10. Zhou, M., et al. Tat modifies the activity of CDK9 to phosphorylate serine 5 of the RNA polymerase II carboxyl-terminal domain during human immunodeficiency virus type 1 transcription. Molecular and Cellular Biology. 20 (14), 5077-5086 (2000).
  11. Palancade, B., Bensaude, O. Investigating RNA polymerase II carboxyl‐terminal domain (CTD) phosphorylation. European Journal of Biochemistry. 270 (19), 3859-3870 (2003).

Tags

जेनेटिक्स अंक 151 प्रतिलेखन दीर्घीकरण ट्यूमर इम्यूनोलॉजी CDK9 MRNA प्रसंस्करण flavopiridol आरएनए पोल द्वितीय
कैंसर में क्रोनिक CDK9 निषेध के एक Murine सेल लाइन आधारित मॉडल व्यापक गैर-आनुवंशिक ट्रांसक्रिटिकल दीर्घीकरण दोष (टीई<sup>निश्चित रूप से</sup>) का अध्ययन करने के लिए
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Modur, V., Singh, N., Muhammad, B. A … More

Modur, V., Singh, N., Muhammad, B. A Murine Cell Line Based Model of Chronic CDK9 Inhibition to Study Widespread Non-Genetic Transcriptional Elongation Defects (TEdeff) in Cancers. J. Vis. Exp. (151), e59910, doi:10.3791/59910 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter