Summary
O protocolo detalha um modelo in vitro da carcinoma murino do alongamento defeituoso não-genético da transcrição. Aqui, a inibição crônica do CDK9 é usada para reprimar o alongamento produtivo do RNA Pol II ao longo dos genes de resposta pró-inflamatória para imitar e estudar o fenômeno TEdefinitivamente superatendido, presente em cerca de 20% de todos os tipos de câncer.
Abstract
Nós temos relatado previamente que um subconjunto dos cancros é definido por desregulação transcricional globais com deficiências difundidas no alongamento da transcrição do mRNA (te)-nós chamamos tais cancros como tedefinitivamente. Notavelmente, TEdefinitivamente cânceres são caracterizados por transcrição espúria e processamento de mRNA defeituoso em um grande conjunto de genes, tais como INTERFERON/Jak/stat e TNF/NF-κB caminhos, levando à sua supressão. O TEdefinitivamente SubType dos tumores na carcinoma renal da pilha e em pacientes metastáticos da melanoma correlacionou-se significativamente com a resposta e o resultado pobres na imunoterapia. Dada a importância de investigar o tedefinitivamente cânceres — como ele prenuncia um obstáculo significativo contra a imunoterapia — o objetivo deste protocolo é estabelecer um modelo in vitro tedefinitivamente mouse para estudar estes generalizada, não-genética anormalidades transcricional em cânceres e obter novas percepções, novos usos para as drogas existentes, ou encontrar novas estratégias contra esses cânceres. Nós detalham o uso da inibição CDK9 mediada flavopiridol crônica para revogar o fosforilação do resíduo do serina 2 no domínio da repetição do C-terminal (CTD) do polymerase II do RNA (RNA Pol II), suprimindo a liberação de RNA Pol II na transcrição produtiva Alongamento. Dado que o tedefinitivamente os cânceres não são classificados nenhuma mutação somática específica, um modelo farmacológico é vantajoso, e melhor imita os defeitos transcricional e epigenéticas difundidos observados neles. O uso de uma dose subletal otimizada de flavopiridol é a única estratégia eficaz na criação de um modelo generalizável de ruptura generalizada não-genética no alongamento da transcrição e defeitos de processamento de mRNA, imitando de perto o TE clinicamente observado definitivamente características. Conseqüentemente, este modelo de TEdefinitivamente pode ser aproveitado para dissecar, fatores Cell-Autonomous permitindo os em resistir o ataque imune-negociado da pilha.
Introduction
Uma etapa chave-limitando da taxa na expressão de quase todos os genes ativos é a transição do RNA polymerase II (RNA Pol II) do promotor-pausando proximal ao alongamento produtivo1,2. Dado que o desregulação epigenéticas do alongamento transcricional auxilia na progressão de malignidades humanas múltiplas definidas como tedefinitivamente, conduzindo à sinalização suboptimal nos caminhos pró-inflamatórios da resposta que totalizam uma resposta pobre e o resultado à imunoterapia3, o objetivo abrangente deste protocolo é estabelecer um modelo in vitro útil para estudar estas anomalias transcricional não-genéticas difundidas nos cancros. Nesta luz, o uso da inibição farmacológica crônica de CDK9 é uma estratégia eficaz para criar um modelo generalizáveis do rompimento generalizado não-genético no alongamento da transcrição e em defeitos de processamento do mRNA. A lógica subjacente ao uso da inibição CDK9 crônica é que ela AB roga fosforilação do resíduo de serina 2 no domínio de repetição do C-terminal (CTD) do RNA Pol II, reprisando assim a liberação de RNA Pol II em alongamento produtivo da transcrição. Além disso, TEdefinitivamente cânceres, descritos anteriormente pelo nosso grupo3, não são classificados qualquer mutação somática específica. Conseqüentemente, um modelo não-genético (farmacológico) é vantajoso e melhor imita os defeitos transcricional e epigenéticas difundidos observados neles. O método aqui detalha a geração e caracterização do modelo crônico de tratamento com flavopiridol de células cancerosas murinas. Este método interrompe demonstravelmente o alongamento da transcrição ao longo de genes caracterizados por comprimentos genóricos mais longos, com promotores poizados e expressões induzível tais como TNF/NF-κB e sinalização de interferon/stat, profundamente controlados ao nível de alongamento de transcrição3,4,5. Globalmente, este modelo de linha de célula Murina otimizada de defeitos de alongamento transcricional — o único modelo ao nosso conhecimento para estudar os tumores recém-descritos do TEdefinitivamente — impulsiona a resistência ao ataque imunológico antitumoral, tornando um sistema útil para explorar e examinar as vulnerabilidades de defeitos não genéticos em máquinas de transcrição de núcleo em cânceres vis-à-vis ataque de células imunomediadas.
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Protocol
O Comitê institucional de cuidados e uso de animais e o Comitê de biossegurança institucional da Fundação de pesquisa para crianças de Cincinnati aprovaram todos os procedimentos experimentais animais (protocolo IACUC #2017-0061 e protocolo IBC #IBC2016-0,016), e estes experimentos foram realizados de acordo com as normas descritas no guia NIH para o cuidado e uso de animais de laboratório.
1. inibição crónica do RNA Pol II por tratamento com flavopiridol — estratégia básica
- Células de melanoma de camundongo B16/F10 de semente em baixa densidade (0,2 x 106) em uma placa de cultura de 10 cm em seu meio correspondente (meio de águia modificada de Dulbecco [DMEM], soro bovino fetal a 10% [FBS], 1% de penicilina e estreptomicina [Pen/Strep]) e incubar durante a noite em um 37 ° c, 5% co2 umidificado incubadora.
- No dia seguinte, lave as células com soro fisiológico com tampão de fosfato 1x (PBS) e adicione um novo lote de meios de cultura com uma dose subletal (estimada em 25 nM) de flavopiridol — um inibidor do fator de alongamento RNA Pol II p-TEFb (cyclin T/CDK9) — durante uma semana sem mais subculturação.
- Após uma semana de tratamento com flavopiridol, realize ensaios confirmatórios para avaliar a capacidade do modelo de recapitular vários atributos de defeitos de alongamento transcricional observados nos cânceres de TEdefinitivamente .
2. ensaio de immunoblot confirmatório para avaliar a função defeituosa do RNA Pol II e o prejuízo da via do interferon (IFN) e da sinalização do caminho do fator de necrose tumoral (TNF) do rato gerado TEdefinitivamente modelo
- Número de cultura igual (105) de flavopiridol tratados células de melanoma de rato B16/F10 e células de melanoma de rato B16/F10 parental em dois conjuntos diferentes de 12 placas de poço (um conjunto para a caracterização funcional de RNA Pol II e o outro conjunto para a citocina estimulação) a 37 ° c em uma incubadora humidificada de 5% CO2 durante a noite.
- No dia seguinte, trate as células no conjunto de estimulação de citocinas com o mouse IFN-γ, IFN-α (5 ng/mL), ou TNF-α (5 ng/mL) para 45 min a 37 ° c.
- Agora, extraia a proteína das pilhas em ambos os conjuntos da caracterização funcional do citocinas e do RNA Pol II usando um amortecedor do lysis do ensaio da radioimunoprecipitação (Ripa) na seguinte maneira:
- Lave as células com 1X PBS e lise-a com 50 μL de tampão de Lise por poço. Raspe e, em seguida, pellet as células lisadas a 4 ° c, 21.130 x g.
- Meça a proteína em sobrenadantes de lisado celular usando um ensaio colorimétrico padrão para a concentração proteica Após solubilização de detergente (Bradford ou um ensaio similar).
- Carregue a quantidade igual de proteína medida (15 μg) de cada amostra para funcionar em um gel do poliacrilamida do dodecil do sódio de 4% − 18% (SDS), e transfira-os para membranas do difluluoreto do polyvinylidene (PVDF).
- Bloqueie as membranas de PVDF em 5% de leite seco em soro fisiológico com tampão Tris-polissorbato 20 (TBST) por 1 h seguido de uma incubação durante a noite a 4 ° c com anticorpos primários (RNA Pol II 1:1000; p-SER2 RNA Pol II 1:1000; p-SER5 RNA Pol II 1:1000; H3K36me3 1:2000; total H3 1:2000; STAT1 1:1000; p-STAT1 1:1000; NFκB 1:1000; p-NFκB 1:1000; β-actina 1:5000) em 5% de albumina sérica bovina.
- Após o dia, lave as membranas de PVDF com 1x TBST durante 15 min à temperatura ambiente (RT), e incubar-os com anticorpos secundários apropriados (anti-Rat [1:5000] para RNA Pol II, p-SER2 RNA Pol II e p-SER5 RNA Pol II; anti-coelho (1:5000) para H3K36me3, total H3, STAT1, p-STAT1, NFκB, e p-NFκB) para 50 min em RT. detecte os sinais da proteína usando a carcaça comercialmente disponível da peroxidase do rábano (HRP) com Chemiluminescence realçado.
Nota: o β-Actin preliminar usado é HRP-conjugado, conseqüentemente pode ser desenvolvido sem um secundário.
3. ensaio confirmatório para avaliar defeitos de processamento de mRNA no rato gerado TEdefinitivamente modelo
- O número igual da semente (0,2 x 106) de flavopiridol tratou pilhas do melanoma do rato de B16/F10 e pilhas de melanoma do rato de B16/F10 parental em 6 placas do poço em 37 ° c em uma incubadora humidificada de 5% co2 durante a noite.
- Extraia o RNA total das células cultivadas em 60% de confluência usando um reagente de extração de RNA ou Kit (tabela de materiais).
- Esgote o rRNA do RNA extraído total da seguinte maneira:
Nota: um protocolo de baixa entrada foi cooptado de um kit comercialmente disponível para esgotar o rRNA- Ajuste um banho de água ou um bloco de calor a 70 − 75 ° c, e um outro banho de água ou bloco de calor em 37 ° c.
- Adicione o RNA total (100 − 500 ng em 2 μL de água nuclease-livre) com 1 μL de sonda seletiva de depleção de rRNA e 30 μL de tampão de hibridação em um tubo de microcentrífuga, misture suavemente por vortexing e incubar-os a 70 − 75 ° c por 5 min.
- Agora, transfira os tubos a um banho de água de 37 ° c/bloco de calor, e permita que a amostra esfrie a 37 ° c durante um período de 30 minutos.
- Ressuscitem os grânulos magnéticos da sonda de depleção de rRNA seletivo por vortexing e alíquota 75 μL de grânulos em um tubo de microcentrífuga 1,5 mL RNase livre.
- Coloc a suspensão do grânulo em um separador magnético por 1 minuto. permita que os grânulos se instalem. Aspirar suavemente e descartar o sobrenadante. Repita a lavagem dos grânulos mais uma vez adicionando 75 μL da água nuclease-livre e descartando o sobrenadante que segue a separação magnética.
- Suspender os grânulos lavados em 75 μL de tampão de hibridação e alíquota de 25 μL para outro tubo e mantê-lo a 37 ° c para uso posterior.
- Coloque os restantes 50 μL de grânulos num separador magnético durante 1 min e elimine o sobrenadante. Ressuspender os grânulos em 20 μL de tampão de hibridação e mantê-lo a 37 ° c para uso posterior.
- Após o resfriamento da mistura de sonda de depleção de RNA/rRNA seletiva para 37 ° c por 30 min, centrifugue brevemente o tubo para coletar a amostra para a parte inferior do tubo.
- Transfira 33 μL da mistura de sonda de depleção de RNA/rRNA seletiva para as esferas magnéticas preparadas da etapa 3.3.7. Misture por vortexing de baixa velocidade.
- Incubar o tubo a 37 ° c durante 15 min. Durante a incubação, misture suavemente o conteúdo ocasionalmente. Seguido por breve centrifugação para recolher a amostra para o fundo do tubo.
- Coloque o tubo em um separador magnético por 1 min para pellet o complexo rRNA-Probe. Desta vez não descarte o sobrenadante. O sobrenadante contém RNA empobrecido por rRNA.
- Coloque o tubo de 25 μL de grânulos do passo 3.3.6 em um separador magnético por 1 min. aspirar e descartar o sobrenadante. Adicione o sobrenadante da etapa 3.3.11 ao novo tubo de grânulos. Misture por vortexing de baixa velocidade.
- Incubar o tubo a 37 ° c durante 15 min. Durante a incubação, misture suavemente o conteúdo ocasionalmente. Centrifugue momentaneamente o tubo para recolher a amostra à parte inferior do tubo.
- Coloque o tubo em um separador magnético por 1 min para pellet o complexo rRNA-Probe. Não descarte o sobrenadante. Transfira o sobrenadante (cerca de 53 μL) contendo ARN empobrecido de rRNA para um novo tubo.
- Meça a concentração do rendimento do RNA por um espectrofotômetro.
- Use uma metade das amostras esgotadas por rRNA como entrada para grânulos magnéticos contendo oligo (dT) 25 para extrair polyA+ RNA da seguinte maneira:
Nota: Este protocolo de isolar o RNA do mensageiro da cauda de Polya usando as seqüências do DT do oligo limitados à superfície de grânulos magnéticos foi cooptado de um jogo comercialmente disponível (tabela dos materiais).- Ressuspender os grânulos de oligo dT no frasco por um breve vortexing por > 30 s e transferir 200 μL de grânulos de oligo dT para um tubo. Adicione o mesmo volume (200 μL) de buffer de ligação e ressuscitem.
- Coloque o tubo em um ímã por 1 min e descarte o sobrenadante. Agora, retire o tubo do íman e ressuspender as esferas de oligo dT lavadas em 100 μL de tampão de ligação.
- Ajuste o volume da amostra total de RNA de entrada rRNA esgotada para 100 μL com 10 mM de Tris-HCl pH 7,5. Agora, adicione 100 μL de buffer de ligação.
- Aqueça ao ° c 65 por 2 minutos para interromper estruturas secundárias do RNA. Agora, imediatamente coloque no gelo.
- Adicione o 200 μL do RNA total ao 100 μL de grânulos lavados. Misture completamente e permita a ligação girando continuamente em um rotor por 5 minutos em RT.
- Coloque o tubo no íman durante 1-2 min e Retire cuidadosamente todo o sobrenadante e Retire cuidadosamente todo o sobrenadante.
- Retire o tubo do íman e adicione 200 μL de tampão de lavagem.
- Meça a pureza e a concentração da polyA+ RNA extraída por um espectrofotômetro.
Nota: uma relação 260/280 de 1.90 − 2.00, e uma relação 260/230 de 2.00 − 2.20 para todas as amostras do RNA são consideradas aceitáveis. - Use a metade restante das amostras esgotadas por rRNA da seção 3,3 como entrada para proteínas a colunas (fornecidas no kit de imunoprecipitação de RNA [RIP], tabela de materiais) para imunoprecipitados cinco-Prime tampado RNAs usando monoclonal 7-metilguanosina anticorpo da seguinte forma:
Nota: Este protocolo de isolar m7G tampou o RNA do mensageiro usando um jogo comercialmente disponível da imunoprecipitação do RNA foi cooptado e modificado mais.- Lave a proteína a grânulos magnéticos obtidos a partir do kit RIP de acordo com o protocolo do fabricante para pré-ligar o anticorpo para as contas.
- Transferência de 3 μg de 7-metilguanosina anticorpo (coelho IgG fornecido no kit pode ser usado o controle negativo) para os grânulos em um tubo de microcentrífuga suspenso em 100 μL tampão de lavagem do kit.
- Incubar com rotação de baixa velocidade por 30 min em RT. tubos de centrifugação brevemente e, em seguida, coloque os tubos em um separador magnético, retire e descarte o sobrenadante.
- Retire os tubos e adicione 500 μL de tampão de lavagem do kit e do vórtice brevemente. Centrifugue os tubos brevemente seguidos pela separação magnética mais uma vez, retire e descarte o sobrenadante.
- Repita o passo 3.6.4 novamente.
- Adicione ao redor 120 ng do rRNA esgotado (da seção 3,3) aos grânulos ligados do anticorpo da 7-methylguanosine pré-lavado. Adicionar 1 μL de inibidor de RNase. Incubar em RT para 1 − 1,5 h com agitação ligeira.
- Gire para baixo os grânulos em 300 x g para 10 s e remova o sobrenadante que contem o mRNA (non-7-methylguanosine) untampado a um tubo novo do microcentrifugador.
- Adicionar 100 μL de tampão de lavagem e lavá-lo mais duas vezes da mesma forma. Piscina o sobrenadante coletado no mesmo tubo de microcentrífuga rotulado de mRNA (não-7-metilguanosina) sem tampos. Guarde no gelo.
- Elute o mRNA tampado (7-methylguanosine) dos grânulos com 300 μL do tampão do lysis do Urea (ULB) que contem a ureia de 7 M, o SDS de 2%, o NaCl de 0,35 M, o EDTA de 10 milímetros e o Tris de 10 milímetros, pH 7,5 aquecendo os grânulos em 65 ° c por 2 − 3 minutos
- Misturar 300 μL das amostras eluidas (mRNA tampado e não tampado) com 300 μL de fenol: clorofórmio: álcool isoamílico (25:24:1; disponível comercialmente) (armazenado a 4 ° c). Misture bem invertendo e deixe por cerca de 10 min, em seguida, misture novamente suavemente.
- Centrifugue a 18.928 x g durante 2 min e Pipete cuidadosamente a camada superior para o tubo fresco e elimine a camada inferior.
- Adicionar 300 μL de fenol: clorofórmio: álcool isoamílico (25:24:1; armazenado a 4 ° c) nas amostras. Misture bem invertendo e Centrifugue então em 18.928 x g por 1 minuto. com cuidado, pipeta a camada superior a um tubo fresco e descarte a camada inferior.
- Adicionar 300 μL de 2-porpanol e 30 μL de acetato de sódio a 3 M (pH 5,2) ao RNA tampado e não tampado. Inverta a amostra algumas vezes e colocá-lo em-20 ° c por 20 h.
- Agora, Centrifugue as amostras em 18.928 x g por 10 min a 4 ° c. Retire cuidadosamente o sobrenadante e adicione 500 μL de 70% de etanol.
- Centrifugue novamente a 18.928 x g durante 10 min a 4 ° c. Elimine cuidadosamente o sobrenadante e seque o pellet em RT por menos de 5 min. ressuscitem o pellet em água sem nuclease.
- Meça a pureza e a concentração do rendimento do RNA por um espectrofotômetro. A relação 260/280 deve estar na escala de 1.90 − 2.00, e a relação 260/230 na escala de 2.00 − 2.20 para todas as amostras do RNA.
4. ensaio confirmatório para avaliar a resposta do rato TEdefinitivamente modelo para a morte celular mediada FasL
- Semente número igual (30.000 células) de flavopiridol tratados células de melanoma de rato B16/F10 e células de melanoma de rato B16/F10 parental numa placa de cultura 96-well no respectivo meio correspondente (DMEM), e incubar durante a noite num 37 ° c, 5% CO2 humidificado Incubadora.
- Trate as células em uma capa de cultura com diferentes concentrações de hhis6fasl (0.1 − 1000 ng/ml) na presença de 10 μg/ml anti-his anticorpo e incubar para 24 h em 37 ° c, 5% co2 umidificado incubadora.
- Remova as pilhas inoperantes lavando com tampão de PBS 1x. Fixar as células anexadas em 4% paraformaldeído por 20 min em RT. descarte o paraformaldeído a 4% (sem necessidade de lavagem), e mancha com solução de violeta cristalina (20% metanol, 0,5% cristal violeta em 1X PBS) por 30 min.
- Retire o excesso de mancha delicadamente enxaguando as placas em água da torneira. Mantenha as placas para secar no RT.
- Re-dissolver a violeta de cristal em 100 μL de 1x surfactante nonionic dissolvido em 1X PBS, e medir a densidade celular medindo a absorvência em 570 nm em um leitor de microplacas.
5. ensaio exploratório para avaliar a resposta do rato TEdefinitivamente modelo de ataque de células T citotóxicas específicas do antígeno
- Isolamento e ativação do ataque de células T citotóxicas OT-I CD8 + (CTL)
- Purify pilhas de CD8 + dos baços de OT-I TCR TG RAG-1 −/− ratos pela separação da pilha magnética usando um jogo de isolação da pilha de T CD8 do rato como segue:
- Colha dois baços de dois camundongos OT-I TCR TG RAG-1 −/− em meios completos de RPMI.
- Mash os baços em um filtro de 70 μm mantido em um tubo de 50 mL enchido com 20 mL de RPMI, usando a parte traseira de uma seringa até que somente a gordura esteja deixada para trás no filtro.
- Centrifugue o fluxo através de 220 x g por 5 min a 4 ° c. Descarte o sobrenadante.
- Adicione 1 mL de tampão de lise de glóbulos vermelhos (RBC) à pelota do baço da etapa de centrifugação anterior e Pipete a mistura durante 1 min.
- Neutralize a solução adicionando até 10 mL de RPMI.
- Centrifugador a 220 x g durante 5 min a 4 ° c. Descartar o sobrenadante e ressuscitará em 10 mL de RPMI.
- Pegue uma pequena alíquota para contar. Centrifugue o restante a 220 x g durante 5 min a 4 ° c.
- Para cada milhão de células contados, Ressuspender a pelota em 1 mL de buffer de sistema de separação magnética comercialmente disponível (buffer Mojo ou um buffer semelhante).
- Prepare um coquetel de anticorpos de volume 100 μL para cada 1 mL de células peletizadas na etapa 5.1.1.8. O coquetel de anticorpos inclui: biotina anti-CD4, CD105, CD45R/B220, CD11c, CD49b, TER-119, CD19, CD11b, TCR γ/δ e CD44.
- Adicione este cocktail às 1 mL de células peletizadas e mantenha-se no gelo durante 15 min.
- Adicionar 100 μL de grânulos magnéticos (streptavidin) a cada 100 μL do cocktail de anticorpos adicionado às células do baço com resuspensão de 1 mL. Mantenha no gelo por 15 min.
- Adicione 7 mL de amortecedor de sistema de separação magnética comercialmente disponível. Agora, alíquota aproximadamente 3 − 4 ml da mistura a um tubo fresco. Misture bem e corrigi-lo para o ímã por 5 min.
- Decantar o líquido (contém células CD8 +) a um tubo fresco no gelo. Agora, alíquota os 3 − 4 ml restantes da mistura da etapa 5.1.1.12 ao tubo e fixá-lo ao ímã por 5 min. decantar o líquido (segundo lote de células CD8 + isoladas) para o mesmo tubo contendo o primeiro lote de células CD8 + mantidas no gelo.
- Fibroblastos aderentes projetados para sementes APC-(MEC. B7. Sigova) linha para expressar um específico ovalbumina (OVA)-derivado, H-2KB-restrito peptídeo epítopo mapeado OVA257-264 (siinfekl), juntamente com a molécula co-estimulatória b 7.1, em 75.000 células por poço em 24-placas bem, a 37 ° c, 5% co2 humidificada incubadora.
Nota: o fibroblasto aderente utilizado é um presente do laboratório do Dr. Edith Janssen na CCHMC. A linha foi criada originalmente no laboratório do Dr. Stephen P. Schoenberger no Instituto La Jolla para alergia e Imunologia6. - Após 24 h, lave a monocamada de APC uma vez com o meio de Dulbecco modificado de Iscove (IMDM) comercialmente disponível com tampão de HEPES, piruvato de sódio, L-glutamina e glicose elevada), e adicione 0,5 x 106 pilhas de OT-I CD8 + ingênuas (da etapa 5.1.1.13) em 2 ml de imdm suplementado com 50 mM β-ME, 2 mL de EDTA, 4 mM L-glutamina e HEPES e 10% FBS.
- Após 20 h, colher suavemente as células OT-I não aderentes (coletando a mídia no prato de cultura com células de OT-I flutuantes e granulação das células em 191 x g por 2 min; contar as células OT-i viáveis) e transferi-las para a cocultura.
- Purify pilhas de CD8 + dos baços de OT-I TCR TG RAG-1 −/− ratos pela separação da pilha magnética usando um jogo de isolação da pilha de T CD8 do rato como segue:
- Co-cultura de células CD8 + com células B16/F10-OVA
- Células CD8 + derivadas de sementes de OT-I em uma proporção de 1:1 (300.000 células cada) em uma cocultura com B16/F10 (faltando o ovalbumin do antígeno), B16/F10-OVA não tratada e células B16/F10-OVA pré-tratadas com flavopiridol (25 nM) por 1 semana, em pratos de 6 poços com DMEM completo mídia por 20 h a 37 ° c em uma incubadora de 5% CO2 humidificada.
- Após 20 h, remova as células CD8 + derivadas de OT-I (coletando a mídia no prato de cultura com células CD8 + derivadas de OT-I flutuantes). Lave as células B16/F10-OVA aderentes em 1X PBS.
- Trypsinize os três grupos de células B16/F10-ova anexadas em 0, 5% EDTA contendo tripsina por 5 min. pellet as células tripsinizadas em 191 x g por 5 min.
- Manchar as células B16/F10-OVA colhidas incubando-as em PBS frio (contendo 0,5% de FBS e 0, 5% de azida sódica) com corante de viabilidade e anticorpos rotulados relevantes (viabilidade fixável coloração corante E780, rato AF647-conjugado CD8 e BV421-conjugated mouse CD45 ).
- Analisar a viabilidade dos três grupos de células B16/F10-OVA por citometria de fluxo.
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Representative Results
Aqui, fornecemos um esquema detalhado (Figura 1) para estabelecer um modelo tedefinitivamente celular obtido por um tratamento subletal crônico (Figura 2) com flavopiridol a 25 nm. Na Figura 3, em 3 dias de tratamento com flavopiridol, células de ova B16 apresentam características parciais de tedefinitivamente , mas após uma semana de tratamento, as células de ova B16/F10 mostram uma perda profunda de fosforilação na posição de serina 2 no CTD de RNA Pol II ao longo com uma diminuição significativa em H3K36me3 — uma modificação do histona implicada em definir limites do exon e em um inibidor de transcrições crípticas Run-Away. Como consequência, o modelo TEdefinitivamente celular mostra defeitos críticos de processamento de mRNA com proporções manifestamente aumentadas de mRNAs não-poli-adenilados de forma inadequada (figura 4a, B). Além disso, a repressão específica dos genes-chave da via de resposta inflamatória e a via de morte celular mediada pelo FasL são observadas na Figura 5 e Figura 6. A resistência imposta ao interferon (IFN-α, IFNγ) e ao TNF-α estimulou o fosforilação de STAT1 e de NFκB, e a resistência à morte de pilha pelo FasL do ligante do receptor da morte reduz drasticamente a citotoxicidade de um ataque imune da pilha de encontro a tedefinitivamente Tumores. Essas técnicas confirmatórias são projetadas para testar a extensão da influência que a perturbação crônica do alongamento da transcrição tem sobre uma ampla variedade de genes responsivos ao estímulo, e se tal perturbação em um determinado modelo de linha celular do mouse é suficientemente adequada para Alerte um escassez agudo do mRNA funcional na resposta inflamatório que sinaliza genes, imitando as essencialidades básicas de cancro da TAdefinitivamente clìnica. Baseado em nosso estudo do tratamento do flavopiridol, a supressão do fosforilação no segundo resíduo do serina (pSER2) do RNA Pol II CTD é crítica, porque marca o alongamento da transcrição. Uma dose subletal para qualquer linha celular de carcinoma de camundongo deve atingir uma redução nos níveis de pSER2, além de ter um efeito insignificante sobre a taxa de crescimento e viabilidade da linha celular. Embora consistentemente vejamos uma redução nos níveis de pSER2 e H3K36me3 em tratamentos flavopiridol 25 nM, não garante uma repressão dos níveis de pSTAT1 e pNFκB (nas estimulações IFN-α, IFNγ e TNF-α, respectivamente). Cada linha celular de carcinoma de camundongo é única (B16/F10 OVA ou CT26 células cultivadas em diferentes laboratórios durante um período de tempo pode ter efeitos ligeiramente alterados) e eles podem ter JAK1 ou CCNT1 parcialmente resgatando os efeitos de flavopiridol em suprimir o genes da via de resposta inflamatória. Nesses casos, a cinética dos níveis de pSTAT1 e pNFκB pode precisar ser verificada em diferentes pontos temporais (5 − 70 min) para compreender a temporalidade dos efeitos mediados por flavopiridol e seu resgate por JAK1 ou CCNT1. Consequentemente, JAK1 e/ou CCNT1 podem precisar de ser derrubado para estabelecer este modelo.
Uma vez que o modelo de flavopiridol é estabelecido e caracterizado usando os ensaios acima mencionados, nós fornecemos um ensaio exploratório para testar se o tedefinitivamente o modelo da pilha confere a resistência ao ataque citotóxica da T-pilha (CTL). Baseado em nosso protocolo aperfeiçoado, as pilhas B16/F10 tratadas flavopiridol que overexpressam estàvel o gene de OVA (B16 OVA) co-incubated com o CD8 + ativado CTLs (específico para o epítopo OVA257-264) que tem a toxicidade seletiva às pilhas OVA-expressando (um presente do Dr. O laboratório6de Stephen P. Schoenberger) não era suscetível ao lysis do tumor de OT-I CTL-negociado. As células de OVA B16/F10 (não pré-tratadas com flavopiridol) foram submetidas a morte maciça de células neste sistema, enquanto as células parentais de B16/F10 sobreviveram, pois não expressam antígeno de óvulos (Figura 7). É desobstruído do resultado do ensaio exploratório sugerido que o TE flavopiridol-induzido crônicodefinitivamente pode conceder meios escapar do ataque imune do anti-tumor mesmo in vivo. Isto pode ser testado mais em modelos in vivo do tumor para verific a propensão de modelos do tedefinitivamente para escapar respostas imunes inata e adaptáveis do anti-tumor. Os tratamentos anti-asialo podiam ser usados para regular a atividade de células NK in vivo em camundongos portadores de tumor. Também, a terapia imune do ponto de verificação (anti-CTLA4 e anti-PD1) pode ser administrada aos ratos do rolamento do tumor do TEdefinitivamente .
Na totalidade, o TEdefinitivamente os ensaios confirmatórios junto com o ensaio exploratório sugerido junto demonstram a utilidade de incorporar este tedefinitivamente modelo da pilha em um anfitrião inteiro de outras condições de teste tumor-imunes. Este modelo pode ajudar a analisar os detalhes moleculares resultantes do alongamento transcripcional defeituoso nas células tumorais e sua resposta às interações de células imunes.
Figura 1: representação esquemática do fluxo de trabalho. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: características de crescimento celular de células B16 ova tratadas cronicamente com flavopiridol de baixa dose: viabilidade (medida por reagente de viabilidade) de controle e células tratadas com flavopiridol B16 ova nos dias indicados após o tratamento. Este número foi modificado de Modur et al.3. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: ensaio confirmatório para avaliar o RNA Pol II e o perfil histona: immunoblots das marcas indicadas do histona e do RNA Pol II em pilhas de B16 ova tratadas com o flavopiridol para 72 h ou 1 semana. Este número foi modificado de Modur et al.3. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: ensaio confirmatório para avaliar defeitos graves no processamento de mRNA. Rácios de 5 ′-untampados a 5 ′-tampado (a) e 3 ′-não-poliadenylated a 3 ′-concentrações do mRNA de Polyadenylated (B) após a prostração do rRNA nas linhas de pilha indicadas. As barras de erro representam o desvio padrão com base em três repetições técnicas. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: ensaio confirmatório para avaliar o perfil de estimulação da citocinas. Immunoblots de STAT1, de pSTAT1, de NFκB e de p NFκB no controle e em pilhas pre-tratadas flavopiridol do óvulo de B16 estimulados com IFN-α, IFNγ ou TNF-α por 30 minutos em (5 ng/mL). Este número foi modificado de Modur et al.3. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: ensaio confirmatório para avaliar a resistência à morte celular mediada pelo FasL in vitro. Controle e flavopiridol pré-tratados B16 ova células tratadas com FasL para 24 h leitura medido por ensaio de viabilidade. Este número foi modificado de Modur et al.3. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: ensaio exploratório para avaliar a resistência do TEdefinitivamente o modelo ao ataque negociado citotóxico antígeno-restrito da pilha T in vitro. Esquerda: esquema diagramático do ensaio exploratório. Direita: viabilidade relativa de células B16/F10-OVA cocultivadas com CD8 + CTLs ativada (proporção 1:1) isolada dos baços de camundongos OT-I. P: teste tde duas amostras da Welch. Este número foi modificado de Modur et al.3. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O controle de alongamento do RNA Pol II surgiu como uma alavanca decisiva para a regulação da expressão gênica responsiva ao estímulo ao benefício das células malignas5,7,8. Superar o promotor-a pausa proximal ao alongamento e subsequente produção de mRNA requer a atividade da quinase de P-tefb9,10,11. Nosso modelo utiliza flavopiridol (25 nanômetro), um inibidor da quinase cicinófica-dependente essencial CDK9, para imitar os defeitos observados durante o alongamento de pol II no TEdefinitivamente cancros — um phenotype previamente desconhecido nos cânceres descobertos por nosso grupo anteriormente3.
A atividade da quinase de CDK9 tem sido sabida por muito tempo para ser essencial para o fosforilação de resíduos do serina 2 no CTD da grande subunidade de pol II. Criticamente, conseguimos otimizar a inibição crônica tratada com flavopiridol de CDK9 (25 nM por 1 semana) em B16/F10 OVA, de forma que, além de inibir a fosforilação da CTD, o tratamento com flavopiridol 25 nM por 1 semana previne a modificações do mRNA de forma imprevista e efetivamente AB roga alongamento produtivo dependente de p-tefb ao longo de genes longos, como genes de sinalização de resposta pró-inflamatória, alterando significativamente seus padrões de expressão tanto no mRNA e níveis proteicos. Ao melhor de nosso conhecimento, não há nenhum outro modelo descrito na literatura que alcança eficazmente o mesmos.
Este fácil estabelecer, modelo generalizáveis de tedefinitivamente pode conseqüentemente ser leveraged para dissecar, as modificações transcricional e epigenéticas permitindo tedefinitivamente cancros adaptar-se ao ataque imune-negociado da pilha. Além disso, este modelo murino retém seu TEdefinitivamente-como a redução de níveis totais e do PHOSPHO-RNA Pol II 21 dias após a liberação do flavopiridol no ensaio in vivo3 do crescimento (não mencionado no protocolo aqui), sugerindo a extensão da estabilidade deste modelo não-genético para mais experimentação in vivo. No entanto, deve-se tomar cuidado para otimizar a dose subletal exata de flavopiridol para outras linhas murinas (por exemplo, cerca de 20 nM tratamento flavopiridol para 1 semana é a dose subletal para MC38 linha de carcinoma murino; não utilizado neste protocolo), o impacto da variação na célula a densidade do chapeamento, as condições da cultura, e as condições da estimulação do citocinas podem variar para linhas murino diferentes. O protocolo descrito aqui dá uma estrutura básica para minimizar as variáveis conhecidas para ser críticas para a geração de TEdefinitivamente-como características pela inibição CDK9 crônica. Além, as linhas de pilha humanas da carcinoma, tais como T47D e CAL51 foram testadas com os tratamentos flavopiridol a curto prazo (de 3 dias) que dão origem a similar TEdefinitivamente-como os perfis do RNA Pol II, indicando a utilidade da inibição crônica baseada flavopiridol de alongamento de transcrição mediada CDK9 na criação de linhas humanas mesmo modelo para estudar TEdefinitivamente.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi em parte apoiado por NCI (CA193549) e CCHMC Research Innovation Pilot Awards para Kakajan Komurov, e departamento de defesa (BC150484) prêmio de Navneet Singh. O conteúdo é unicamente da responsabilidade dos autores e não representa necessariamente os pontos de vista oficiais do Instituto Nacional do câncer ou do departamento de defesa. Os financiadores não tiveram papel no desenho do estudo, coleta e análise de dados, decisão de publicação ou preparação do manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| hhis6FasL | Cell Signaling | 5452 | |
| 10X TBS | Bio-Rad | 170-6435 | |
| 12 well plates | Falcon | 353043 | |
| 20% methanol | Fisher Chemical | A412-4 | |
| 24-well plates | Falcon | 351147 | |
| 4–18% SDS polyacrylamide gel | Bio-Rad | 4561086 | |
| 4% Paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | AAJ19943K2 | |
| 5% dry milk | Bio-Rad | 170-6404 | |
| 7-Methylguanosine antibody | BioVision | 6655-30T | |
| 96-well plates | Cellstar | 655180 | |
| AF647-conjugated mouse CD8 | Biolegend | 100727 | |
| antibiotic and antimycotic | Gibco | 15240-062 | |
| anti-His antibody | Cell Signaling | 2366 P | |
| Anti-Rabit | Cell Signaling | 7074 | Dilution 1:5000 |
| Anti-Rat | Cell Signaling | 7077S | Dilution 1:5000 |
| Bradford assay Kit | Bio-Rad | 5000121 | |
| BSA | ACROS Organics | 24040-0100 | |
| BV421-conjugated mouse CD45 | Biolegend | 109831 | |
| crystal violet | Sigma | C3886-100G | |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | |
| Dynabeads Oligo (dT)25 | Ambion | 61002 | |
| FBS | Gibco | 45015 | |
| Fixable Live/Dead staining dye e780 | eBioscience | 65-0865-14 | |
| Flavopiridol | Selleckchem | S1230 | |
| H3k36me3 | Abcam | ab9050 | Dilution 1:2000 |
| IFN-α | R&D systems | 12100-1 | |
| IFN-γ | R&D systems | 485-MI-100 | |
| IMDM | Gibco | 12440053 | |
| Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate | Millipore | WBKLS0500 | |
| MojoSort Mouse CD8 T Cell Isolation Kit | Biolegend | 480007 | |
| NF-κB | Cell Signaling | 8242s | Dilution 1:1000 |
| PBS | Gibco | 14190-144 | |
| p-NF-κB | Cell Signaling | 3033s | Dilution 1:1000 |
| p-Ser2-RNAPII | Active Motif | 61083 | Dilution 1:500 |
| p-Ser5-RNAPII | Active Motif | 61085 | Dilution 1:1000 |
| p-STAT1 | Cell Signaling | 7649s | Dilution 1:1000 |
| RiboMinu Eukaryote Kit | Ambion | A10837-08 | |
| RIPA buffer | Santa Cruz Biotechnology | sc-24948 | |
| RNAPII | Active Motif | 61667 | Dilution 1:1000 |
| STAT1 | Cell Signaling | 9175s | Dilution 1:1000 |
| TNF-α | R&D systems | 410-MT-010 | |
| total H3 | Cell Signaling | 4499 | Dilution 1:2000 |
| Tri reagent | Sigma | T9424 | |
| Triton | Sigma | T8787-50ML | |
| Tween 20 | AA Hoefer | 9005-64-5 | |
| β-Actin | Cell Signaling | 12620S | Dilution 1:5000 |
| β-ME | G Biosciences | BC98 |
References
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