Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

تحديد آثار أقدام RNA: مجمعات البروتين عن طريق الحمض النووي الريبي المناعيفية جنبا إلى جنب تليها التسلسل (RIPiT-Seq)

Published: July 10, 2019 doi: 10.3791/59913
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Molecular Genetics, Center for RNA Biology, The Ohio State University

Summary

هنا، نقدم بروتوكوللإثراء مواقع ربط الحمض النووي الريبي الذاتية أو "آثار أقدام" من RNA: البروتين (RNP) المجمعات من خلايا الثدييات. وينطوي هذا النهج على هطول يناهي الأمطار المناعية للوحدات الفرعية RNP، وبالتالي يطلق عليه اسم الترسيب المناعي للرنا جنبا إلى جنب (RIPiT).

Abstract

الحمض النووي الريبي المناعي الترسيب جنبا إلى جنب (RIPiT) هو وسيلة لإثراء آثار أقدام الحمض النووي الريبي من زوج من البروتينات داخل RNA: البروتين (RNP) مجمع. يستخدم RIPiT خطوتين تنقية. أولاً، يتبع الترسيب المناعي لوحدة فرعية RNP الموسومة هضم RNase معتدل وما يترتب على ذلك من عدم التنافر تقارب الإنحطاط. يسمح هطول الأمطار المناعي الثاني لوحدة فرعية أخرى RNP بإثراء مركب محدد. بعد إزالة التناطور من RNAs والبروتينات، يتم تحويل آثار أقدام الحمض النووي الريبي إلى مكتبات تسلسل الحمض النووي عالية الإنتاجية. على عكس الأشعة فوق البنفسجية الأكثر شعبية (UV) الربط المتصالب تليها المناعيةالتر (CLIP) نهج لإثراء مواقع الربط RBP، RIPiT هو الأشعة فوق البنفسجية crosslinking مستقلة. وبالتالي RIPiT يمكن تطبيقها على العديد من البروتينات الموجودة في interactome RNA وخارجها التي هي ضرورية لتنظيم RNA ولكن لا تتصل مباشرة الحمض النووي الريبي أو الأشعة فوق البنفسجية كروسلينك سيئة إلى RNA. توفر خطوتا التنقية في RIPiT ميزة إضافية لتحديد المواقع الملزمة التي يعمل فيها بروتين الاهتمام بالشراكة مع عامل مساعد آخر. كما تعمل استراتيجية التنقية المزدوجة على تعزيز الإشارة عن طريق الحد من الخلفية. هنا، نحن نقدم إجراء خطوة حكيمة لأداء RIPiT وتوليد مكتبات تسلسل عالية الإنتاجية من آثار أقدام RNA معزولة. كما نلخص مزايا وتطبيقات RIPiT ونناقش بعض قيودها.

Introduction

داخل الخلايا، يوجد الحمض النووي الريبي في مجمع مع البروتينات لتشكيل RNA: مجمعات البروتين (RNPs). يتم تجميع RNPs حول البروتينات الملزمة RNA (RBPs، تلك التي تربط مباشرة RNA) ولكن أيضا تتألف من غير RBPs (تلك التي تربط RBPs ولكن ليس RNA)، وغالبا ما تكون ديناميكية في الطبيعة. وتعمل الممارسات التجارية التقييدية وعواملها المساعدة بصورة جماعية في إطار الممارسات التجارية الوطنية من أجل تنفيذ الوظائف التنظيمية. على سبيل المثال، في مسار اضمحلال الحمض النووي الريبي (NMD) الذي يتم التوصل إلى هذا التسوس بوساطة هراء، تعترف بروتينات UPF (UPF1 وUPF2 وUPF3b) بالريبوسوم المنهي قبل الأوان. كل من البروتينات UPF يمكن ربط الحمض النووي الريبي، ولكن فقط عندما تجمع معا أن مجمع NMD نشط يبدأ في تشكيل. داخل هذا المجمع، يتم تنشيط UPF1 بشكل أكبر عن طريق الفسفورية من قبل SMG1 غير RBP، ومثل هذا التنشيط UPF1 يؤدي في نهاية المطاف إلى توظيف العوامل المسببة للاضمحلال mRNA1،2. وفي هذا المثال، تتطلب الممارسات التجارية التقييدية عوامل مساعدة غير من الممارسات التجارية التقييدية للتوظيف وتفعيل مجمع RNP الذي يؤدي إلى إجراء النُفِّم الوطني. ومع ذلك، فإن الخاصية الأخرى للـ RNPs هي عدم تجانسها التركيبي. النظر في spliceosome، الذي يوجد في المجمعات E أو A أو B أو C متميزة. المجمعات spliceosome مختلفة لديها البروتينات المتداخلة ومتميزة3. لدراسة وظائف RNP، من المهم توضيح أي RNAs ملزمة بالممارسات التجارية التقييدية والبروتينات المرتبطة بها. توجد العديد من الطرق لتحقيق ذلك، معكل نهج له مزاياه المميزة وعيوبه 4،5،6،7.

تعتمد الطرق الشائعة على نطاق واسع لتحديد مواقع ربط RBP — الربط المتبادل متبوعاً بالترسيب المناعي (CLIP) واختلافاته المختلفة - على الأشعة فوق البنفسجية (UV) للربط بين RBP وRNA8. غير أن هذا ليس نهجاً فعالاً للممارسات التجارية غير القائمة على النتائج في إطار الممارسات RNPs، التي لا تتصل مباشرة بالحمض النووي الريبي. وهنا، نوصف نهجاً بديلاً ينطبق على الممارسات التجارية التقييدية وغير الممارسات التجارية التقييدية على حد سواء، لعزل وتحديد مواقعها الملزمة بالحمض النووي الريبي. هذا النهج يسمى الحمض النووي الريبي المناعيالتر جنبا إلى جنب (RIPiT) يتكون من خطوتين منالي مناعي، والتي تساعد على تحقيق خصوصية أعلى بالمقارنة مع تنقية واحدة (الشكل 1)9،10. كما يمكن تنفيذ خطوات الترسيب المناعي الفردي (IP) في سلسلة أقل بالمقارنة مع CLIP، RIPiT لا يعتمد على توافر الأجسام المضادة التي يمكن أن تصمد أمام وجود المنظفات القوية أثناء الترسيب المناعي. الميزة الأكثر تفردا من RIPiT هو القدرة على استهداف اثنين من البروتينات المختلفة في خطوتين تنقية; وهذا يوفر وسيلة قوية لإثراء مجمع RNP متميزة تركيبيا من المجمعات المماثلة الأخرى11.

ويمكن للاختلافات الصغيرة في إجراء RIPiT أن تزيد من تعزيز إثراء RNP. على سبيل المثال، بعض تفاعلات الحمض النووي الريبي أو البروتين ية داخل RNPs عابرة وقد يكون من الصعب تنقية آثار أقدام مثل هذه المجمعات بكفاءة. لتثبيت هذه التفاعلات، يمكن ربط RNPs داخل الخلايا مع الفورمالديهايد قبل تحلل الخلايا وRIPiT. على سبيل المثال، لاحظنا أن التفاعل الضعيف بين عامل مجمع تقاطع exon (EJC) الأساسي، EIF4AIII وعامل التفكيك EJC، يمكن تثبيت PYM12 مع علاج الفورمالديهايد بحيث يتم إثراء المزيد من آثار الحمض النووي الريبي (البيانات لا يظهر). قبل حصاد الخلايا وRIPiT، يمكن أيضا أن تعامل الخلايا مع الأدوية لتحقيق الاستقرار أو إثراء RNPs في دولة معينة. على سبيل المثال، عند دراسة البروتينات التي تتم إزالتها من mRNA أثناء الترجمة (على سبيل المثال، EJC13، UPF114)، يمكن أن يؤدي العلاج مع مثبطات الترجمة مثل البوروميدسين أو السيكلوهيكسميد أو الهارينغتونين إلى زيادة شغل البروتينات على RNAs.

كمية الحمض النووي الريبي المستردة من RIPiT عادة ما تكون منخفضة (0.5-10 pmoles، أي 10-250 نانوغرام RNA النظر في متوسط طول RNA من 75 nt). السبب الرئيسي لهذا هو أن جزءا صغيرا فقط من بروتين معين موجود في مجمع مع البروتينات الأخرى داخل RNPs (يتم فقدان أي "حر" البروتين IP'ed في الخطوة الأولى خلال IP الثاني). لتوليد مكتبات RNA-Seq من هذا RNA، ونحن أيضا الخطوط العريضة هنا التكيف من بروتوكول نشرت سابقا مناسبة لمثل هذه المدخلات RNA منخفضة15،16 (الشكل2)، والتي تسفر عن عالية الإنتاجية تسلسل عينات جاهزة في 3 ايام.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إنشاء خطوط الخلية HEK293 مستقرة التعبير عن التتراسيكلين inducible العلم الموسومة بروتين الفائدة (POI)

  1. خلايا البذور HEK293 مع موقع إعادة تركيب فلب متكامل بشكل ملحوظ (FRT) في كثافة 10 × 104 خلايا / مل في متوسط النمو (دولبكو تعديل النسر المتوسطة [DMEM] + 10٪ مصل البقر الجنيني [FBS] + 1٪ البنسلين-ستربتوميسين [بن / العقدية]) في 6- لوحات جيدا. السماح للخلايا بالنمو بين عشية وضحاها في حاضنة رطبة في 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 (ظروف النمو القياسية لجميع الخطوات اللاحقة).
  2. في اليوم التالي، يجب أن تكون الخلايا ~ 70٪ مترافق. وفقا لبروتوكول الكاشف transfection، transfect FRT الموقع التي تحتوي على خلايا HEK293 مع نسبة 9:1 من pcDNA5-TETO-FLAG-POI:pOG44.
    ملاحظة: تحتوي علامة FLAG على عزر التسلسل DYKDDDDK (D = حمض الاسبارتاك، Y = التيروزين، وK = يسين).
  3. بعد 24 ساعة، تبدأ اختيار المضادات الحيوية. إزالة وسائل الإعلام وإضافة متوسط النمو الطازجة تكملها 100 ميكروغرام / مل هيغرومايسين. في غضون 72 ساعة، يجب أن تبدأ الخلايا غير المتطفلين في الموت.
  4. كل 48-72 ح, تغيير وسائل الإعلام النمو وتكملة مع الهيغرومايسين الطازجة.
  5. بعد حوالي 2 أسابيع من الاختيار، سوف تبدأ مستعمرات منفصلة من الخلايا المنقولة بشكل لا يُصَلِّب إلى الظهور. مرة واحدة المستعمرات مرئية للعين المجردة، إضافة 1 مل من التربسين إلى لوحة وحضانة لمدة 5 دقائق في 37 درجة مئوية. إعادة تعليق الخلايا في DMEM، ونقل الخلايا إلى لوحة جديدة 10 سم، وضبط حجم إلى 10 مل متوسط النمو الطازج تكملها 100 ميكروغرام / مل هيغروميسين. السماح لللوحة للوصول إلى ~ 80٪ من الملاءمة لزيادة توسيع الخلايا لإعداد المخزونات الدائمة.
  6. تحديد مقدار التتراسيكلين (Tet) المطلوبة للحصول على المستوى الأمثل من التعبير FLAG-POI للتجربة. تنمو الخلايا في شكل 12 جيدا وإجراء معايرة تيت بين 0-1000 نانوغرام /مل مجموعة لمدة 16-24 ح. أداء البقع الغربية على عينات المعايرة بالمعايرة مع الأجسام المضادة ضد POI.
    ملاحظة: للبروتينات تصل إلى ~ 60 كيلودا، يمكن حل العلم الموسومة والنسخة الذاتية من البروتين على كبريتات الصوديوم دوديسيل-بولياكريلاميد هلام الكهربائي (SDS-PAGE) لمقارنة مستويات التعبير من FLAG-POI إلى نظيره الذاتية. وبالنسبة للبروتينات الأكبر حجماً، يمكن مقارنة شدة الإشارة في العينات التي يسببها تيت بالعينة غير المستحثة. يمكن إعداد محلول مخزون التتراسيكلين في 1 ملغ / مل في الإيثانول 100٪. وينبغي أن تكون تخفيفات المخزون لعمل زراعة الخلايا في المياه المعقمة أو المالحة المخزنة بالفوسفات (PBS). وينبغي إعداد مخزون التتراسيكلين الطازجة مرة واحدة كل شهر.

2. خلايا الزراعة للتحريض التتراسيكلين وإجراء RIPiT

  1. البذور المتكاملة بشكل ملحوظ FLAG-POI HEK293 في كثافة 3 × 105 خلايا / مل في متوسط النمو في لوحات 15 سم. السماح للخلايا بالنمو عند 37 درجةمئوية و5% من ثاني أكسيد الكربون.
    ملاحظة: بشكل عام، فإن ثلاثة إلى خمسة لوحات 15 سم تسفر ~ 2-20 pmol من آثار الحمض النووي الريبي اعتمادا على وفرة RNP من الفائدة. إذا كانت RNPs سوف تكون الفورمالديهايد crosslinked وتنقيتها في ظل ظروف صارمة، ثم ضعف المدخلات قد تكون مطلوبة.
  2. إضافة التتراسيكلين إلى التركيز الأمثل المحدد مسبقا لوسائل الإعلام للحث على التعبير عن FLAG-POI (انظر الخطوة 1.6) 16-24 ساعة قبل أن يتم حصاد الخلايا.
    ملاحظة: ليس من الضروري تغيير متوسط النمو. يجب أن تكون الخلايا جاهزة لحصاد حوالي 72 ساعة بعد البذر أو عندما تكون الأطباق حوالي 80٪ مترافقة. من المهم تجنب الخلايا من أن تصبح مترافقة.

3. حصاد الخلايا، علاج الفورمالديهايد، وتحلل الخلية

  1. اغسل يُغسل الخلايا أحادية الطبقة برفق مع 15 مل من PBS المبردة لكل طبق بحجم 15 سم. ثم كشط قبالة الخلايا في 30 مل من PBS. إذا تم علاج الخلايا مع المخدرات قبل الحصاد, تكملة PBS مع المخدرات. جمع جميع الخلايا في أنبوب مخروطي 50 مل.
    ملاحظة: للحفاظ على التفاعلات الضعيفة، يمكن ربط الخلايا مع الفورمالديهايد: إضافة الفورمالديهايد إلى تعليق الخلية من الخطوة 3.1 إلى تركيز نهائي من 0.1٪ وحضانة على الروك في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة. ) والصخور لمدة 5 دقائق إضافية.
  2. خلايا بيليه في 400 × ز لمدة 10 دقائق في 4 درجة مئوية وتجاهل supernatant.
  3. خلايا الليس في 4 مل من الجليد الباردة تحت ضغط الدم العازلة (HLB; الجدول 1 استخدم ماصة P1000 لإعادة تعليق الخلايا. نقل إلى أنبوب 5 مل وحضانة lysate على الجليد لمدة 10 دقائق.
  4. وضع lysate في حمام الجليد وsonicate في 10٪ السعة لمدة 30 ثانية مع نبضات 1 ق مع توقف 2 ثانية. ثم، ضبط تركيز الملح إلى 150 mM عن طريق إضافة 108 درجة مئوية من 5 M NaCl.
    ملاحظة: يمكن أن تخضع عينات الفورمالديهايد المتقاطعة للتحلل وتنقية أكثر صرامة من خلال تضمين 0.1٪ كل من SDS وdeoxycholate الصوديوم في العازلة تحلل.
  5. مسح lysate عن طريق الطرد المركزي في 21،000 × ز لمدة 10 دقيقة في 4 درجة مئوية. جمع 20 ميكرولتر supernatant (استخراج الخلية) في أنبوب المسمى لتحليل وصمة عار الغربية من مستويات البروتين في المدخلات (انظر الشكل 3ألف).
    ملاحظة: في حين lysate هو في الطرد المركزي، يمكن غسل حبات AGArose FLAG (انظر الخطوة 4.1). يجب أن تكون حبات أغاروز العلم غسلها مسبقا 3X في 4 مل من الجليد الباردة isotonic غسل العازلة (IsoWB، الجدول1).

4. العلم المناعةه

  1. تطبيق supernatant المتبقية من الخطوة 3.5 إلى 750 درجة مئوية مسبقا غسلها الخرز أغاروز العلم في أنبوب 5 مل (حجم السرير من الخرز أغاروز العلم غسلها سيكون 375 درجة مئوية). احتضان الخرز أغاروز العلم واستخراج الخلية لمدة 1-3 ساعة في 4 درجة مئوية مع خلط لطيف.
    ملاحظة: هذا الحجم من الخرز أغاروز FLAG ينبغي أن تكون كافية لمجموعة واسعة من البروتينات، ولكن قد يكون الأمثل، إذا لزم الأمر.
  2. بيليه العلم الخرز أغاروز من قبل الطرد المركزي في 400 × ز لمدة 1 دقيقة في 4 درجة مئوية. جمع 20 ميكرولتر من supernatant في أنبوب المسمى لتحليل وصمة عار الغربية من مستويات البروتين في استخراج الخلية المستنفدة (انظر الشكل 3ألف). تجاهل الـ "سوبرناتانت" المتبقية.
  3. لغسل حبات الآغاروز FLAG، أضف 4 مل من IsoWB وتعليقها من قبل. الخرز بيليه في 400 × ز لمدة 1 دقيقة في 4 درجة مئوية. قم بإزالة الـ supernatant بعناية. كرر 4x.
    ملاحظة: للغسل الصارم من الانفاليديد عبر ربط هاب، 0.1٪ كل من SDS وديوكسيشولات الصوديوم يمكن تضمينها في العازلة غسل لأول خطوتين غسل.

5. RNase I الهضم

  1. تمييع RNase I إلى 0.002-0.01 وحدة/مل في 750 ميكرولتر من IsoWB (التركيز المناسب لأحجام البصمة المطلوبة يحتاج إلى تحديد تجريبي). أضف IsoWB-RNase I إلى حبات الآغاروز المغسولة وحضانة مع خلط لطيف عند 4 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
  2. الخرز بيليه في 400 × ز لمدة 1 دقيقة في 4 درجة مئوية. جمع 20 ميكرول سوبرناتانت (RNase I elution) في أنبوب المسمى لتحليل وصمة عار الغربية. تجاهل IsoWB-RNase الأول وغسل الخرز أغاروز العلم 4X مع IsoWB كما هو موضح في الخطوة 4.3.

6. التقارب Elution

  1. إعداد مخزون من العازلة elution (الببتيد العلم في 250 نانوغرام / مل في IsoWB). تطبيق 375 € L من العازلة elution لحبات أغاروز العلم ويهز بلطف في 4 درجة مئوية ل 1-2 ح. بيليه العلم أغاروز الخرز وجمع aliquot 15 €L من الإلتصاق لوصمة عار الغربية من البروتينات في الملكية الفكرية العلم (انظر الشكل 3A).
    ملاحظة: وعندما يكون الإنتذى التقارب يدار، يمكن تنفيذ القسم 7.

7. المغناطيسي حبة الأجسام المضادة للاقتران

  1. غسل الخرز المغناطيسي 50 درجة مئوية (أي، Dynabeads؛ جدول المواد) 3X في 1 مل IsoWB في أنبوب 1.5 مل. إعادة تعليق الخرز المغناطيسي في 100 درجة مئوية من العازلة الاقتران. إضافة كمية مناسبة من الأجسام المضادة (كمية دقيقة من الأجسام المضادة لاستخدامها للملكية الفكرية سوف تحتاج إلى تحديد تجريبي لكل جسم مضاد).
    ملاحظة: البروتين الخرز المغناطيسي هي الأمثل للأجسام المضادة المنتجة في الأرنب في حين أن الخرز المغناطيسي بروتين G هي أكثر ملاءمة للأجسام المضادة الماوس. الخرز المغناطيسي الرسم البياني التوافق متاح في موقع المورد لاختيار الخرز المناسب لكل الأجسام المضادة.
  2. غسل الخرز المغناطيسي 2X فيالعازلة الاقتران (الجدول 1). خليط الحضانة في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق على الأقل. يُحفظ على الجليد حتى الخطوة التالية.

8. الترسيب المناعي الثاني

  1. تطبيق ما تبقى من ELUTIon تقارب العلم من الخطوة 6.1 إلى الخرز المغناطيسي إلى جانب الأجسام المضادة ضد البروتين من الفائدة. حضانة مع خلط لطيف في 4 درجة مئوية ل1-2 ح. التقاط الخرز المغناطيسي على المغناطيس وجمع 15 ميكرولتر من supernatant لتحليل البروتينات غير المنضمة عبر وصمة عار الغربية. غسل الخرز المغناطيسي 7X مع 1 مل من IsoWB.

9. ديناتورينغ إلوتيون

  1. إضافة 100 درجة مئوية منالمخزن المؤقت عينة واضحة (الجدول 1) إلى الخرز المغناطيسي وإعادة تعليق مع ماصة P200. تحضن على الجليد لمدة 10 دقائق.
  2. التقاط الخرز المغناطيسي على المغناطيس وجمع 15 ميكرولتر من elution لتحليل البروتينات في elution RIPiT عبر وصمة عار الغربية (انظر الشكل 3A). نقل الإلوتيون المتبقية إلى أنبوب جديد المسمى 1.5 مل.
    ملاحظة: إذا كانت العينات من الفورمالديهايد عبر ربطها، ثم يجب أن يتم احتضان العينات في 65 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة لعكس الربط.
  3. تنفيذ البقع الغربية على العينات التي تم جمعها في خطوات مختلفة (المدخلات، واستنفاد الملكية الفكرية FLAG، والملكية الفكرية FLAG، واستنفاد الملكية الفكرية الثاني، وelution الملكية الفكرية الثانية). لطخة مع الأجسام المضادة ضد اثنين من البروتينات الطعم، والجهات الفاعلة الأخرى إذا كان معروفا، وواحد على الأقل غير المتفاعلة RBP كسيطرة سلبية (الشكل3A).

10. استخراج الحمض النووي الريبي والانتهاء من علاج

  1. إلى elution RIPiT، إضافة 320 ميكرولتر من RNase خالية ddH2O، 400 ميكرولتر من الكحول isoamyl الفينول الكلوروفورم (PCIAA، درجة الحموضة 4.5)، ودوامة لمدة 30 ثانية وتدور في درجة حرارة الغرفة في 12،000 × ز لمدة 5 دقائق. إضافة 35 ميكرولتر من خلات الصوديوم 3 M، 1ميكرولتر من 1 مكل 2، 10 ميكروغرام من الجليكوجين، و 1 مل من الإيثانول 100٪. الحضانة بين عشية وضحاها عند -20 درجة مئوية.
  2. إلى بيليه RNA، الطرد المركزي في 12،000 × ز لمدة 30 دقيقة في 4 درجة مئوية. غسل الحمض النووي الريبي في الإيثانول 70٪.
  3. لإزالة 3 'الفوسفات اليسار على الحمض النووي الريبي بعد RNase I الانقسام، وإعادة تعليق الحمض النووي الريبي بيليه في 17 ميكرولتر من RNase خالية من DDH2O، وإضافة 2 ميكرولتر من 10X T4 polynucleotide كيناز (PNK) العازلة (جدولالمواد)و 1 ميكرولتر من T4 PNK. حضانة في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
    ملاحظة: نشاط 3'phosphatase من T4 PNK لديه النشاط الأمثل في درجة الحموضة 617. يتم تحسين المخزن المؤقت رد فعل PNK لنشاط كيناز 5 'من T4 PNK ويحتوي على درجة الحموضة من 7.6. في حين تم محاولة ضبط درجة الحموضة من رد فعل نهاية علاج، يمكن تحسين هذه الخطوة.
  4. إضافة 380 درجة مئوية من RNase خالية ddH2O و 400 درجة مئوية من PCIAA درجة الحموضة 4.5 إلى الأنبوب. دوامة لمدة 30 ثانية، الطرد المركزي في 12،000 × ز لمدة 5 دقائق.
  5. الحضانة بين عشية وضحاها عند -20 درجة مئوية. بيليه وغسل الحمض النووي الريبي مع الإيثانول 70٪ على النحو الوارد أعلاه. إعادة تعليق الحمض النووي الريبي في 4.5 ميكرولتر من المياه الخالية من RNase.

11. تقدير حجم ووفرة بصمة الحمض النووي الريبي

  1. ومن المتوقع أن ينتج عن RIPiT الناجح 1 pmol أو أكثر من شظايا RNA. لتحديد العائد الفعلي، نقل 0.7 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي (~ 1/6 من إجمالي العائد) إلى أنبوب جديد. إضافة 2 ميكرولتر من 10x T4 PNK العازلة، 1 ميكرولتر من 1 mM ATP، 40 μCi γ32P-ATP (0.5−1.0 ميكرولتر من المخزون)، و1 ميكرولتر من T4 PNK. ضبط حجم إلى 10 درجة مئوية وحضانة في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
    1. في نفس الوقت ردود الفعل PNK، تسمية سلم الحمض النووي منخفضة المدى و 0.1 pmol من RNA الاصطناعية أو oligo الحمض النووي (20-40 nt) لاستخدام معايير الحجم والكمية.
  2. حل وصفت RNA / DNA على 26٪ هلام اليوريا PAGE (20 × 27 × 0.45 مم3). يجب أن يكون هلام قبل تشغيل لمدة 30 دقيقة في 35 W. الآبار دافق قبل تشغيل وقبل تحميل العينات وتشغيلها في 35 W حتى بروموفينول الأزرق صبغ الجبهة قد وصلت تقريبا نهاية الجل.
  3. قم بإزالة الجل بعناية من الصفائح الزجاجية إلى قطعة من ورق فلتر 8 × 11 بوصة. مع هلام على رأس الورق، ووضعها في جهاز تجفيف هلام وتغطية مع قطعة من البلاستيك التفاف. هلام جاف عند 80 درجة مئوية لمدة 1 ساعة مع فراغ.
  4. عرض هلام المجففة إلى فوسفيوالشاشة بين عشية وضحاها أو حتى يتم الكشف عن إشارة كافية. صورة فوسفوسكرين. نوعية جيدة RNA من RIPiT يجب أن تظهر كمسحة في الممر، مع الحد الأدنى من العصابات البارزة (الشكل3B). لتحديد الحمض النووي الريبي، قارن شدة الإشارة من شظايا RNA الحجم المطلوب في حارة RIPiT إلى الإشارة من 0.1 pmol من oligo الاصطناعية المسماة.
    ملاحظة: بدلا من ذلك، يمكن التحقق من حجم بصمة RNA وكميات باستخدام محلل حيوي عالي الحساسية (الشكل3C).

12. ربط المحول

  1. إعداد RIPiT RNA بحيث يتم حل ما لا يقل عن 3 pmol من الحمض النووي الريبي في 3.8 ميكرولتر من الماء.
  2. في أنبوب تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) بـ 0.2 مل، يجمع بين 3.8 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي، 1 ميكرولتر من محول miR-CAT-33 قبل الأندينيل (7 ميكرومتر) (جدولالمواد). احتضان المزيج على دورة الحرارية في 65 درجة مئوية لمدة 10 دقائق، 16 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، ثم عقد في 4 درجة مئوية.
    ملاحظة: يمكن أن يكون إما أمر الرابط قبل adenylated من خدمة توليف oligo، أو العرف oligo الحمض النووي unadenylated من أيخدمة توليف oligo يمكن أن يكون adenylated باستخدام Mth RNA ligase (جدول المواد) وهلام تنقية.
  3. إلى نفس الأنبوب، إضافة 1.5 ميكرولتر من 10X T4 RNA ligase العازلة، 7.5 ميكرولتر من 50٪ البولي ايثيلين غليكول 8000 (PEG-8000)، 0.75 ميكرولتر من 20 مليون ديثيوثريتول(DTT)، و 0.45 ميكرولتر من T4 RNL2 Tr. K227Q (جدول المواد).
    ملاحظة: 50٪ PEG-8000 يأتي مع الحمض النووي الريبي ligase والمخزن المؤقت التي تم شراؤها. PEG-8000 الحلول لزجة وينبغي أن يكون pipetted ببطء.
  4. حمل التفاعل في دورة الحرارية في 30 درجة مئوية لمدة 6 ساعة، والحرارة تعطيل الرباط عند 65 درجة مئوية لمدة 10 دقائق، ثم عقد في 4 درجة مئوية.

13. النسخ العكسي

  1. إلى الأنبوب مع مزيج الربط من الخطوة 12.4، إضافة 11.25 ميكرولتر من 4X ديوكسينوكليوتيد ثلاثي الفوسفات (dNTP) مزيج، والذي يحتوي على مزيج من dNTPs العادية وbiotinylated (انظر الجدول1)، 1.0 ميكرولتر من 10 μM RT التمهيديات (جدولالمواد)،و 6.8 ميكرولتر من مياه خالية من RNase. الحضانة عند 65 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، ثم عقد في 4 درجة مئوية.
  2. نقل الأنابيب إلى الجليد وإضافة 9.0 ميكرولتر من 5X أول حبلا (FS) العازلة دون MgCl2 (الجدول1)،2.25 ميكرولتر من 100 MM DTT، 1.2 ميكرولتر من إنزيم النسخ العكسي إلى حجم نهائي من 45 ميكرولتر (جدولالمواد).
  3. الحضانة في دورة الحرارية في 55 درجة مئوية لمدة 30-60 دقيقة.

14. تنقية المنتج RT

  1. إضافة 45 درجة مئوية من 2Xاليوريا تحميل العازلة (الجدول 1) إلى رد فعل RT. تخفيف 1 ميكروغرام من سلم الحمض النووي منخفض المدى في 45 درجة مئوية وإضافة 45 درجة مئوية من 2X اليوريا تحميل العازلة.
  2. إعداد 10٪ هلام اليوريا PAGE (20 × 28 × 0.15 سم3؛ الجدول1) مع مشط 8 جيدا. باستخدام حقنة أو pipet، اغسل الآبار مع 0.5x تريس / بورات / EDTA (TBE) العازلة.
    ملاحظة: المواد الهلامية محلية الصنع أعلاه تقدم دقة أفضل في فصل المنتج RT الموسعة من التمهيدي RT غير الموسعة. وكبديل لذلك، يمكن أيضا استخدام المواد الهلاميةاليوريا-PAGE مسبقة الصب (جدول المواد). كما المواد الهلامية قبل الصب تسمح وحدات التخزين القصوى أصغر لكل بئر، لذلك سوف تحتاج إلى تقسيم العينات إلى آبار متعددة. يجب تشغيل المواد الهلامية مسبقة الصب في الساعة 150-200 V.
  3. قبل تشغيل هلام في 35 W لمدة 30 دقيقة.
    ملاحظة: استخدام بالوعة الحرارة المعدنية خلال فترة ما قبل التشغيل والمدى النهائي لمنع ارتفاع درجة حرارة هلام.
  4. وصمة عار هلام لمدة 5 دقائق في 1X الذهب حمض نووي هلام وصمة عار الحل أعدت في 0.5x TBE. هذه الصبغة حساسة للضوء، لذلك تجنب التعرض للضوء.
  5. هلام الصورة على الماسح الضوئي الفلورسنت لأغراض التوثيق باستخدام 520 نانومتر الإثارة ومرشحات الانبعاثات 580 نانومتر. في حالة عدم توفر ماسح ضوئي فلورسنت، استخدم مُرِّض الضوء الأزرق. يجب أن يظهر المنتج RT كمسحة تبدأفوق التمهيدي RT غير الموسعة (الشكل 4).
    ملاحظة: على الرغم من أن الذهب حمض نووي هلام تلطيخ صبغ هو تصور بسهولة على وثيقة هلام مع مصدر الأشعة فوق البنفسجية الخفيفة، فمن الضروري عدم تعريض المنتج RT قيمة للأشعة فوق البنفسجية لمنع الضرر.
  6. تصور هلام على محول الضوء الأزرق ومكوس المنتج RT من هلام. فمن المستحسن لخفض الحمض النووي مع ملحقات تتراوح بين30-200 nt (الشكل 4). توضع قطع الجل المقتطعة على سطح نظيف وتُقطّع الشريحة إلى قطع صغيرة لزيادة المساحة السطحية. نقل بعناية إلى أنبوب 1.5 مل وإضافة 800 درجة مئويةمن الحمض النووي العازل elution (الجدول 1).
  7. احتضان قطع هلام مع خلط لطيف مع الحمض النووي العازل elution على مدى الليل في درجة حرارة الغرفة.
  8. فصل العازلة elution من هلام عن طريق تمرير الطين منخلال عمود مرشح خلات السليلوز (جدول المواد) وضعت في أنبوب جمع 2 مل.
  9. في أنبوب 1.5 مل، وغسل 10 ميكرولتر من الخرز المغناطيسي streptavidin مع 500درجة مئوية من streptavidin حبة غسل العازلة (الجدول 1). كرر لثلاث عمليات الإزالة الإجمالية. لا تدع الخرز يجف. إعادة تعليق الخرز في 10 ميكرولترمن الحمض النووي العازل elution (الجدول 1).
  10. نقل العازلة elution مفصولة عن قطع هلام في الخطوة 14.8 إلى أنبوب يحتوي على الخرز المغناطيسي streptavidin غسلها.
  11. الحضانة مع خلط لطيف لمدة 8 ساعة على الأقل في درجة حرارة الغرفة. التقاط الخرز على المغناطيس، وإزالة supernatant وإعادة تعليق الخرز المغناطيسي في 10 ميكرولتر من المياه الخالية من RNase ونقل إلى أنبوب PCR 0.2 مل.

15. تعميم المنتج RT

  1. يتم تعميم منتجات RT التي تم التقاطها على حبات streptavidin بينما ملزمة على الخرز. إلى الطين حبة المغناطيسي، إضافة 2.0 درجة مئوية من 10X التعميم رد فعل العازلة، 1.0 ميكرولتر من 1mM ATP، 1.0 ميكرولتر من 50 مليون متر من كل 2، 4.0 ميكرولتر من 5 M البيتين، 1.0 ميكرولتر من ssDNA ligase I (جدول المواد)، و 1.0 ميكرولتر من المياه الخاليةمنRNase.
  2. احتضان رد فعل التعميم على دورة الحرارية في 60 درجة مئوية لمدة 4 ح. الحرارة تعطيل ssDNA ligase I عن طريق التدفئة في 80 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة ثم عقد في 4 درجة مئوية.

16. اختبار PCR

  1. قبل الانتقال إلى PCR على نطاق واسع، استخدم جزءًا من المنتج الدائري لتحديد العدد المثالي لدورات التضخيم لكل عينة. تساعد هذه الخطوة على منع الإفراط في التضخيم والحد من قطع PCR حيث تصبح مكونات تفاعل PCR مقيدة في دورات PCR أعلى.
  2. إعداد تفاعل PCR 45 ميكرولتر مع 4.0-6.0 ميكرولتر من المنتج الدائري من الخطوة 15.2، 9.0 ميكرولتر من 5X رد الفعل العازلة، 0.9 ميكرولتر 10DNTPs، 2.25 ميكرولتر من 10 ميكرومتر PE1.0 التمهيدي (جدول المواد)، 2.25 ميكرولتر من 10 ميكرومتر PE2.0 التمهيدي (جدولالمواد) ، و0.045 درجة مئوية من بوليميرازالحمض النووي عالية الدقة (جدول المواد)، والماء.
  3. مزيج رد الفعل جيدا وتقسيمها إلى ثلاثة ردود الفعل 15 درجة مئوية. وسيخضع كل رد من هذه التفاعلات الثلاثة لعدد متغير من دورات تفاعل ثلاثي الكلور. ومن المتوقع أن يتراوح العدد المثالي للدورات بين 7 و 14 دورة. حتى إجراء اختبار PCRs لمدة 8 و 11 و 14 دورات.
  4. استخدام شروط PCR التالية: 98 درجة مئوية - 30 ق؛ 98 °C - 5 s; 65 درجة مئوية - 10 درجات؛ 72 °C - 15 s; 72 °C - 2 دقيقة; 12 درجة مئوية - عقد.
  5. إضافة 3 ميكرولتر من 6X هلام صبغ التحميل وحل على هلام الصفحة الأصلية 10٪ حتى الأزرق صبغ الجبهة قد هاجر 3/4 من هلام. وصمة عار هلام باستخدام الذهب حمض نووي هلام وصمة عار وصورة كماهو الحال في الخطوتين 14.4 و 14.5 (الشكل 5).
  6. لاختيار العدد المثالي من دورات PCR، قارن منتجات PCR من عدد متزايد من الدورات. اختيار رقم الدورة التي تنتج أكبر قدر من المنتج من الحجم المتوقع دون القطع الأثرية الإفراط في ampamplification (على سبيل المثال، مسحة الحمض النووي أكبر بكثير من المنتج المتوقع، وحيث لا يوجد استنفاد ملموس من PE1.0 وPE2.0 التمهيدية ينظر (انظر السهم الأحمر في الشكل5).

17- PCR على نطاق واسع

  1. إعداد رد فعل PCR 45 ميكرولتر، كما هو الحال في الخطوة 16.2 وكرر PCR. حل PCR على 10٪ الصفحة الأصلية في 150 V، وصمة عار مع 1X الذهب حمض نووي هلام وصمة عار وصورة على transilluminator الضوء الأزرق.
  2. قم باستئصال منتج PCR من الجل ونقلها إلى حقنة 3 مل. استخدام الحقنة لسحق هلام والبثق في أنبوب 1.5 مل.
    ملاحظة: ينتج منتج RT غير الموسع عند التعميم منتج PCR من 151 نقطة أساس. وهكذا، في هذه الخطوة ينبغي للمرء أن حجماختيار المنتجات التي هي أكبر من 151 نقطة أساس (الشكل 6).
  3. إضافة 900 درجة مئوية من الحمض النووي الرغوة العازلة وحضانة في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها مع خلط لطيف.
  4. نقل الطين هلام إلى عمود مرشح خلات السليلوز وضعت في أنبوب جمع 2 مل. تدور في 12،000 × ز لمدة 3 دقائق، وجمع supernatant في أنبوب جديد.
  5. إضافة آخر 400 درجة مئوية من الحمض النووي اللاتفي العازلة إلى هلام سحقت ونقلها إلى أنبوب 1.5 مل. الحضانة مع خلط لطيف لمدة 4 ساعات إضافية للتخفيف الثاني.
  6. تجمع جميع elutions وتنقسم إلى 3 أنابيب مع 400 ميكرولتر لكل منهما. يعجل الحمض النووي عن طريق إضافة 1 مل من الإيثانول 100٪ و 10 ميكروغرام من الجليكوجين. دوامة وحضانة ما لا يقل عن 2 ساعة في -20 درجة مئوية.
  7. بيليه الحمض النووي في 12،000 × ز لمدة 30 دقيقة في 4 درجة مئوية. غسل الحمض النووي بيليه مع الإيثانول 70٪.
  8. إزالة بعناية جميع الإيثانول عن طريق الأنابيب وبسرعة إعادة تعليق بيليه الحمض النووي في 20 درجة مئوية من الماء.
    ملاحظة: في هذه المرحلة، من المهم عدم السماح لبيليه الحمض النووي تصبح جافة، كما تجفيف الحمض النووي يمكن أن تشوه عليه.
  9. استخدام جزء صغير من عينة الحمض النووي لتحديد حجم وتركيز المنتج PCR عن طريق الفلورومتر وحساسية عالية محلل الحمض النووي الحيوي. ويمكن الآن تقديم العينات للتسلسل على إحدى المنصات.
  10. يمكن معالجة القراءات المتسلسلة (على سبيل المثال، إزالة المحول، التشذيب للحفاظ على التسلسلات >30 درجة Phred)، ومحاذاة إلى الجينوم المرجعي، وتصور على متصفح مثل متصفح الجينوم UCSC (الشكل7).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

وسيؤدي نجاح RIPiT إلى هطول الأمطار المناعية لكل من البروتينات ذات الأهمية وغيرها من البروتينات المعروفة المتفاعلة، وعدم وجود بروتينات غير متفاعلة. وكما هو مُرى في الشكل 3ألف،تم الكشف عن كل من ماغوه وEIF4AIII في الإلتليل RIPiT، ولكن HNRNPA1 لم يكن (الممر 6). وبالتوازي مع ذلك، تم الكشف عن آثار أقدام الحمض النووي الريبي التي تم تنقيتها بالكامل مع مجمعات RNP عن طريق التصوير الشعاعي التلقائي (الشكل3B) أو محلل حيوي (الشكل3C). ومن المتوقع أن يزيد علاج البورومايسين من شغل EJC على الحمض النووي الريبي، وقد لوحظ وجود إشارة بصمة أقوى من الحمض النووي الريبي في البورومسين المعالجة RIPiT في الشكل 3B (مقارنة الممرات 2 و 3). يتطلب إنشاء عينات للتسلسل العميق ربط محول بالحمض النووي الريبي، ثم عكس كتابة الحمض النووي الريبي في الحمض النووي باستخدام التمهيدي الذي صلب إلى تسلسل المحول. تتضمن خطوة النسخ العكسي النيوكليوتيدات الحيوية، لتنقية منتج النسخ العكسي. بعد النسخ العكسي، يجب فصل المنتج عن المحول غير الموسع بواسطةurea-PAGE (الشكل 4). ثم يتم تعميم المنتج النسخ العكسي وPCR تضخيم. يجب أن لا يبالغ العدد المناسب لدورات PCR في تضخيم المنتج الدائري. وسيؤدي الإفراط في التضخيم إلى استنفاد التمهيدي ومنتج PCR الشاذ (انظر الشكل5، حارة 4). عدد الدورات مع أكبر تضخيم دون دليل على الإفراط في التضخيم هو الأنسب للاستخدام لPCR على نطاق واسع (الشكل5 حارة 3 والشكل 6).

Figure 1
الشكل 1 مخطط يحدد الخطوات الرئيسية في RIPiT. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3

الشكل 2 مخطط يصور سير العمل لتحويل RIPiT RNA إلى مكتبات لتسلسل الإنتاجية العالية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2

الشكل 3 تقدير الحمض النووي الريبي وغلة البروتين من RIPiT. (أ) وصمة عار الغربية من البروتينات تنقية من كل خطوة رئيسية في إجراء RIPiT. (B) صورة أوتوراديوغراف من آثار أقدام الحمض النووي الريبي من FLAG-MAGOH:EIF4AIII RIPiT مقارنة الخلايا المعالجة وغير المعالجة البورومسين. يشير المربع الأحمر إلى حجم بصمة RNA التي سيتم تحويلها في نهاية المطاف إلى مكتبات التسلسل. (C) لمحة عن الحمض النووي الريبي من RIPiT كما هو الحال في حارة 2 في لوحة B عندما تصور باستخدام محلل حيوي. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4 عكس النسخ (RT) المنتج حل على هلام اليوريا-PAGE 10٪ وملطخة الذهب هلام حمض نووي وصمة عار. مربع أحمر يشير إلى منطقة هلام مقتطعة لتنقية هلام من منتجات RT الموسعة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5 اختبار PCR حلها على 8٪ غير denaturing الصفحة: لاحظ منتجات PCR الكبيرة بشكل شاذ والتي تظهر في 14 دورة (المربع الأحمر) والاستنفاد الموازي للالتمهيديات (السهم الأحمر) مما يدل على الإفراط في التضخيم. بالنسبة لهذه العينة، تم اختيار 11 دورة لPCR على نطاق واسع (المربع الأزرق). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 6
الشكل 6 حل PCR على نطاق واسع على 8٪ غير denaturing PAGE. مربع أحمر يشير إلى قطعة هلام مقتطعة لتنقية هلام. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 7
الشكل 7 لقطة من مستعرض الجينوم لجين MAPK1 تظهر توزيع آثار أقدام FLAG-MAGOH:EIF4AIII كنتائج تمثيلية من RIPiT. تشير الأسهم الحمراء إلى مواقع الربط المسموح بها لـ EJC الكنسية المتوقعة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

برنامج تلفزيوني 137 مليون متر
2.7 مليون متر مربع
10 m Na2HPO4·7H2O
KH2PO4
الحموضة 7.4
مخزن مؤقت للتبريد 2.5 مليون غليسين
2.5 mM تريس القاعدية
عازل اللمعات تحت التوتر (HLB) 20 m Tris-HCl درجة الحموضة 7.5
15 مليون متر
10 مليون متر مربع EDTA
0.5% إيجيبال
0.1٪ تريتون-X-100
1x أبروتينين*
1x ليوبيبين*
1x بيبستاتين*
1 mM PMSF (فلوريد فينيل ميثيل سلفونيل)*		 * يجب أن تضاف طازجة في كل مرة
عازل الغسيل متساوي التوتر (IsoWB) 20 m Tris-HCl درجة الحموضة 7.5
150 مليون متر مربع
0.1% [جبل]
المخزن المؤقت للاقتران 0.02٪ بوليسوربات-20
1x PBS
مسح نموذج المخزن المؤقت 100 m Tris-HCl درجة الحموضة 6.8
4% SDS
10 مليون متر مربع EDTA
4xdNTPmix 0.25 مليون متر مربع
0.25 مليون متر مربع
0.175 مليون متر من طراز dATP
0.1625 مليون متر مربع
0.075 mM البيوتين-dATP
0.0875 mM البيوتين-dCTP
5x أول ستراند العازلة ث / س MgCl2 250 m Tris-HCl درجة الحموضة 8
375 مليون متر مربع
المخزن المؤقت للتخفيف RIPiT (1 مل) 1 مل إيزووب
5 ميكرولتر 200x BSA
20 ميكرولتر 10٪ تريتون-X-100
20 ميكرولتر 0.5 مليون EDTA
1x أبروتينين*
1x ليوبيبين*
1x بيبستاتين*
1 مليون متر مكعب*		 * يجب أن تضاف طازجة في كل مرة
2x ديناتوريينغ تحميل المخزن المؤقت 3 مل 5x TBE
1.8 غرام فيكول نوع 400
6.3 غ من اليوريا
3 ملغ بروموفينول أزرق
3 ملغ إكسيلين سيانول
ضبط حجم الصوت إلى 15 مل ddH2O		 للوصول إلى الحل، ضع الأنبوب في الماء في كوب ويغلي على طبق ساخن لمدة 10-15 دقيقة.
هلام اليوريا-بيج 6 م اليوريا
أكريلاميد: بيساكريلاميد (40٪ [ث / v]) إلى النسبة المئوية المناسبة
0.5x TBE
0.01% تمد
الحمض النووي الإلوطي العازلة 300 مليون متر مربع
1 مليون متر مربع
ستربتفيدين حبة غسل العازلة 0.5 M هيدروكسيد الصوديوم
20 m Tris-HCl درجة الحموضة 7.5
1 مليون متر مربع

الجدول 1: المخازن المؤقتة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

نناقش هنا بعض الاعتبارات الرئيسية لتنفيذ RIPiT بنجاح. وقبل كل شيء، يجب تحسين الخطوات التقديمية الفردية لتحقيق أعلى كفاءة ممكنة في كل خطوة. وقد ثبت أن كمية الخرز agarose FLAG لعدد المدخلات من الخلايا الموصوفة هنا لتكون قوية لمجموعة واسعة من البروتينات التي اختبرناها. كما أن جزءا صغيرا فقط من البروتينات الشريكة هو مشترك المناعة مع بروتين FLAG، فإن كمية الأجسام المضادة اللازمة للملكية الفكرية الثانية الفعالة عادة ما تكون منخفضة (أقل من 10 ميكروغرام). RIPiT على نطاق صغير (من لوحة واحدة 10 سم) تليها التحقق من وصمة عار الغربية من البروتينات في كل جزء خلال خطوتي هطول الأمطار المناعية تثبت مفيدة للغاية لتقييم كفاءة وخصوصية الإجراء قبل الارتقاء. وينبغي الكشف عن كل من البروتينات المستهدفة، فضلا عن أي البروتينات الأخرى المتوقعة التفاعل في المجمع في elution. ومن المفيد أيضا أن يكون اختبار للبروتينات في lysates المنضب (غير ملزمة إلى FLAG-agarose أو الخرز المغناطيسي) أن يكون تقديرا جيدا لكفاءة هطول الأمطار المناعية والنسبة المئوية للبروتينات تجميعها في مجمع. وعلاوة على ذلك، فإن هذا التحليل يعلم أيضا إذا كانت ظروف الهضم RNase كافية لفصل التفاعلات تعتمد على الحمض النووي الريبي من التفاعلات المستقلة RNA داخل RNP. ولذلك، من المهم بنفس القدر إدراج عنصر تحكم سلبي، من الناحية المثالية، إجراء إدارة للممارسات التجارية التقييدية لا علاقة له بالبرنامج الوطني للممارسات التجارية ذات الأهمية. على سبيل المثال، في الشكل 3A، HNRNPA1 موجود في الإدخال ولكن لم يتم الكشف عنه في elution RIPiT. HNRNPA1 هو RBP التي لا تتفاعل مباشرة مع EJC ولكن يتفاعل بشكل غير مباشر مع EJC عندما ترتبط EJC وHNRNPA1 إلى نفس جزيء RNA. الكشف عن بروتين التحكم السلبي في elution يشير إما ضعف خصوصية RIPiT أو عدم كفاية تأثير الحمض النووي الريبي. في مثل هذه الحالة، فإن آثار أقدام الحمض النووي الريبي التي تم الحصول عليها لن تعكس تماما آثار أقدام البروتين من الفائدة. ينصح ببصمة بحجم 50-200 nt لRNA-Seq اللاحقة. لاحظ أن أفضل سيناريو سيكون الحصول على إشارة جيدة في نطاق الحجم المطلوب، وأنه لا مفر من أن يكون RNAs أطول وأقصر حتى في الظروف المثلى. كما يمكن استخدام RIPiT للحصول على مواقع ربط لـ RBP واحد. في مثل هذه الحالة ، يمكن أن يكون نفس البروتين مناعة مع اثنين من الأجسام المضادة المختلفة ، أولا باستخدام جسم مضاد ضد علامة تقارب ثم مع الأجسام المضادة ضد البروتين نفسه18. وأخيرا، يمكن إجراء التحكم السلبي RIPiT بالتوازي من الخلايا التي تعبر عن بروتين التحكم الموسومة FLAG (على سبيل المثال، بروتين الفلورسنت الأخضر) في تركيبة مع الأجسام المضادة ضد البروتين ضد بروتين غير ذي صلة في IP الثاني.

وعلى الرغم من مزاياه العديدة، من المهم النظر في بعض القيود المفروضة على نهج RIPiT، وسبل الانتصاف الممكنة. شرط الإلتاءب التقارب بعد التنقية الأولى يتطلب المصدر البيولوجي للتعبير عن البروتين الموسومة. إذا لم يكن نظام إعادة التركيب الخاص بالموقع متوفرًا في خط الخلية أو الكائن الحي ذي الأهمية، يمكن إدخال علامة تقارب قصيرة مثل علامة FLAG (8 أحماض أمينية) في موضع الجينات الذاتية باستخدام نهج تحرير الجينوم القائم على CRISPR/Cas19. علامة العلم هو epitope مثالية لهذا النهج، لأن الأجسام المضادة FLAG هو مناسب تماما لelution التقارب ويمكن أن تصمد أمام نقاط القوة الأيونية العالية وظروف الإزالة خفيفة التي يمكن استخدامها في تركيبة مع الربط بين الفورمالديهايد. وثمة قيد آخر لنهج RIPiT هو الحاجة إلى إدخال كبير من المواد الخلوية. وقد يظل ذلك أمراً لا مفر منه إلى حد ما لأن نسبة مئوية صغيرة فقط من الممارسات التجارية التقييدية تتفاعل على الأرجح مع البروتينات الأخرى في البرنامج الوطني للممارسات التجارية. ويمكن أن تساعد نُهج إعداد المكتبات المحسنة التي لا تزال في خفض متطلبات الإدخال الكبيرة. وتشمل الأفكار الممكنة لزيادة تبسيط هذه الخطوات تنفيذ إزالة الفوسفور الحمض النووي الريبي 3'-نهاية والربط محول على الخرز المغناطيسي مباشرة بعد الشهي IP الثاني وقبل الإنعلاث النهائي من RNP. يتم تنفيذ هذا النهج بنجاح في الإجراءات الحالية CLIP-Seq وفي الاختلاف الذي تم وصفه مؤخرا من RIPiT20. كما ستزيل هذه التغييرات عدة خطوات لتنقية الحمض النووي الريبي تستغرق وقتاً طويلاً من المراحل الأولى من إجراءات إعداد المكتبة. وعلاوة على ذلك، على عكس CLIP، الذي يوفر دقة مستوى النيوكليوتيد من موقع الربط عبر موقع RBP على الحمض النووي الريبي، فإن حل آثار أقدام RIPiT سيبقى على مستوى عشرات النيوكليوتيدات. وأخيراً، وبما أن الملوثات التي يمكن أن تشمل هذه الممارسات التجارية الوطنية العديدمن الممارسات التجارية التقييدية، فإن مواقع الحمض النووي الريبي الغنية بـ RIPiT تشمل مزيجاً من مواقع الربط للعديد من الممارسات التجارية التقييدية. كما يتم الكشف عن تسلسل توافق الآراء ملزمة الممارسات التجارية التقييدية الفردية بوتيرة متزايدة بسرعة، والآن متاحة بسهولة21،22،23،ويمكن الاستفادة من هذه المعلومات لdeconvolve مجموعة متنوعة من مواقع RBP المخصب في نواتج RIPiT. على الرغم من هذه التحديات، RIPiT-Seq هو إجراء فعال لالتقاط آثار الحمض النووي الريبي من المجمعات RNP ديناميكية وغير متجانسة، وحتى عابرة، والتي يمكن أن توفر رؤى فريدة من نوعها في الأعمال الداخلية لآلات RNA التي تتحكم في الخلوية وظيفه.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

وقد تم دعم هذا العمل بمنحة المعاهد القومية للصحة GM120209 (GS). يشكر المؤلفون ال [أوسوك] [جنوميكس] [كر] موارد مقدّمة لخدماته ([كّك] دعم منحة [نك] [ك] [ب30] [ك16058]).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-FLAG Affinity Gel Sigma A2220
ATP, [γ-32P]- 3,000 Ci/mmol 10 mCi/mL EasyTide, 250 µCi PerkinElmer BLU502A250UC
BD Disposable Syringes with Luer-Lok Tips (200) Fisher 14-823-435
Betaine 5M Sigma B0300
biotin-dATP TriLink N-5002
biotin-dCTP Perkin Elmer NEL540001EA
Branson Sonifier, Model SSE-1 Branson
CircLigase I VWR 76081-606 ssDNA ligase I
DMEM, High Glucose ThermoFisher 11995-065
DNA load buffer NEB NEB
Dynabeads Protein A LifeTech 10002D
Flp-In-T-REx 293 Cell Line ThermoFisher R78007
GeneRuler Low Range DNA Ladder ThermoScientific FERSM1203
Hygromycin B ThermoFisher 10687010
Mini-PROTEAN TBE Gel 10 well Bio-Rad 4565013
Mini-PROTEAN TBE-Urea Gel Bio-Rad 4566033
miRCAT-33 adapter 5′-TGGAATTCTCGGGTGCCAAGGddC-3′ Any this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform
Mirus transIT-X2 transfection reagent Mirus MIR 6004
Mth RNA ligase NEB E2610S
PE1.0 5′-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACT
CTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC*T-3′		 Any this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform
PE2.0 5′-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGGTCTC
GGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATC*T-3′		 Any this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform
Phenol/Chloroform/Isoamyl Alcohol (25:24:1, pH 6.7, 100 mLl) Fisher BP1752I-100
Purple Gel Loading Dye (6x) NEB NEB #7025
Q5 DNA Polymerase NEB M0491S/L
RNase I, E. coli, 1,000 U Eppicenter N6901K
SPIN-X column Corning CLS8160-24EA
Streptavidin beads ThermoFisher 60210
Superscript III (SSIII) ThermoScientific 18080044 reverse transcriptase enzyme
SybrGold ThermoFisher S11494 gold nucleic acid gel stain
T4 Polynucleotide Kinase-2500U NEB M0201L
T4RNL2 Tr. K227Q NEB M0351S
Tetracycline Sigma 87128
Thermostable 5´ App DNA/RNA Ligase NEB M0319S
TruSeq_SE1 5′-pGGCACTANNNNNAGATCGGAAGA
GCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTC
TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′		 Any this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform
TruSeq_SE10 5′-pGGTGTTCNNNNNAGATCGGAAG
AGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCT
CTTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′		 Any this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform
TruSeq_SE11 5′-pGGTAAGTNNNNNAGATCGGAA
GAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTC
TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′		 Any this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform
TruSeq_SE12 5′-pGGAGATGNNNNNAGATCGGAAGA
GCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTC
TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′		 Any this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform
TruSeq_SE2 5′-pGGGTAGCNNNNNAGATCGGAAGAG
CGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCT
CTTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′		 Any this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform
TruSeq_SE35′-pGGTCGATNNNNNAGATCGGAAG
AGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCT
CTTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′		 Any this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform
TruSeq_SE4 5′-pGGCCTCGNNNNNAGATCGGAAGA
GCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTC
TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′		 Any this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform
TruSeq_SE5 5′-pGGTGACANNNNNAGATCGGAAGA
GCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTC
TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′		 Any this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform
TruSeq_SE6 5′-pGGTAGACNNNNNAGATCGGAAGAG
CGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTC
CGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′		 Any this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform
TruSeq_SE7 5′-pGGGCCCTNNNNNAGATCGGAAG
AGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCT
TCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′		 Any this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform
TruSeq_SE8 5′-pGGATCGGNNNNNAGATCGGAAGAG
CGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTT
CCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′		 Any this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform
TruSeq_SE9 5′-pGGACTGANNNNNAGATCGGAAGAG
CGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTC
CGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′		 Any this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform
Typhoon 5 Bimolecular Imager GE Healthcare Life Science 29187191

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Karousis, E. D., Nasif, S., Mühlemann, O. Nonsense-mediated mRNA decay: novel mechanistic insights and biological impact. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 7 (5), 661-682 (2016).
  2. Ivanov, P. V., Gehring, N. H., Kunz, J. B., Hentze, M. W., Kulozik, A. E. Interactions between UPF1, eRFs, PABP and the exon junction complex suggest an integrated model for mammalian NMD pathways. The EMBO Journal. 27 (5), 736-747 (2008).
  3. Papasaikas, P., Valcárcel, J. The Spliceosome: The Ultimate RNA Chaperone and Sculptor. Trends in Biochemical Sciences. 41 (1), 33-45 (2016).
  4. Jensen, K. B., Darnell, R. B. CLIP: Crosslinking and ImmunoPrecipitation of In Vivo RNA Targets of RNA-Binding Proteins. Methods in Molecular Biology. 488, Clifton, N.J. 85-98 (2008).
  5. Garzia, A., Morozov, P., Sajek, M., Meyer, C., Tuschl, T. PAR-CLIP for Discovering Target Sites of RNA-Binding Proteins. mRNA Decay: Methods and Protocols. 1720, 55-75 (2018).
  6. Konig, J., et al. iCLIP - Transcriptome-wide Mapping of Protein-RNA Interactions with Individual Nucleotide Resolution. Journal of Visualized Experiments. (50), e2638 (2011).
  7. Sibley, C. R. Individual Nucleotide Resolution UV Cross-Linking and Immunoprecipitation (iCLIP) to Determine Protein-RNA Interactions. RNA Detection: Methods and Protocols. 1649, 427-454 (2018).
  8. Wheeler, E. C., Van Nostrand, E. L., Yeo, G. W. Advances and challenges in the detection of transcriptome‐wide protein-RNA interactions. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 9 (1), (2018).
  9. Singh, G., et al. The Cellular EJC Interactome Reveals Higher-Order mRNP Structure and an EJC-SR Protein Nexus. Cell. 151, 750-764 (2012).
  10. Singh, G., Ricci, E. P., Moore, M. J. RIPiT-Seq: A high-throughput approach for footprinting RNA:protein complexes. Methods. 65, 320-332 (2014).
  11. Mabin, J. W., et al. The Exon Junction Complex Undergoes a Compositional Switch that Alters mRNP Structure and Nonsense-Mediated mRNA Decay Activity. Cell Reports. 25 (9), 2431-2446 (2018).
  12. Gehring, N. H., Lamprinaki, S., Kulozik, A. E., Hentze, M. W. Disassembly of Exon Junction Complexes by PYM. Cell. 137 (3), 536-548 (2009).
  13. Dostie, J., Dreyfuss, G. Translation Is Required to Remove Y14 from mRNAs in the Cytoplasm. Current Biology. 12 (13), 1060-1067 (2002).
  14. Zünd, D., Gruber, A. R., Zavolan, M., Mühlemann, O. Translation-dependent displacement of UPF1 from coding sequences causes its enrichment in 3' UTRs. Nature Structural & Molecular Biology. 20 (8), 936-943 (2013).
  15. Gangras, P., Dayeh, D. M., Mabin, J. W., Nakanishi, K., Singh, G. Cloning and Identification of Recombinant Argonaute-Bound Small RNAs Using Next-Generation Sequencing. Argonaute Proteins: Methods and Protocols. 1680, 1-28 (2018).
  16. Heyer, E. E., Ozadam, H., Ricci, E. P., Cenik, C., Moore, M. J. An optimized kit-free method for making strand-specific deep sequencing libraries from RNA fragments. Nucleic Acids Research. 43 (1), 2 (2015).
  17. Cameron, V., Uhlenbeck, O. C. 3'-Phosphatase activity in T4 polynucleotide kinase. Biochemistry. 16 (23), 5120-5126 (1977).
  18. Ricci, E. P., et al. Staufen1 senses overall transcript secondary structure to regulate translation. Nature Structural & Molecular Biology. 21 (1), 26-35 (2014).
  19. Lackner, D. H., et al. A generic strategy for CRISPR-Cas9-mediated gene tagging. Nature Communications. 6, 10237 (2015).
  20. Metkar, M., et al. Higher-Order Organization Principles of Pre-translational mRNPs. Molecular Cell. 72 (4), 715-726 (2018).
  21. Giudice, G., Sánchez-Cabo, F., Torroja, C., Lara-Pezzi, E. ATtRACT-a database of RNA-binding proteins and associated motifs. Database: The Journal of Biological Databases and Curation. 2016, (2016).
  22. Paz, I., Kosti, I., Ares, M., Cline, M., Mandel-Gutfreund, Y. RBPmap: a web server for mapping binding sites of RNA-binding proteins. Nucleic Acids Research. 42, Web Server issue 361-367 (2014).
  23. Sundararaman, B., et al. Resources for the Comprehensive Discovery of Functional RNA Elements. Molecular Cell. 61 (6), 903-913 (2016).

Tags

علم الوراثة، العدد 149، بصمة الحمض النووي الريبي، RIPiT، البروتين الملزم الحمض النووي الريبي، RBP، RNA: مجمعات البروتين، RNP
تحديد آثار أقدام RNA: مجمعات البروتين عن طريق الحمض النووي الريبي المناعيفية جنبا إلى جنب تليها التسلسل (RIPiT-Seq)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Woodward, L., Gangras, P., Singh, G. … More

Woodward, L., Gangras, P., Singh, G. Identification of Footprints of RNA:Protein Complexes via RNA Immunoprecipitation in Tandem Followed by Sequencing (RIPiT-Seq). J. Vis. Exp. (149), e59913, doi:10.3791/59913 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter