Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Identifisering av fotavtrykk av RNA: protein komplekser via RNA-Immunutfelling i tandem etterfulgt av sekvensering (RIPiT-SEQ)

Published: July 10, 2019 doi: 10.3791/59913
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Molecular Genetics, Center for RNA Biology, The Ohio State University

Summary

Her presenterer vi en protokoll for å berike endogene RNA bindende nettsteder eller "fotavtrykk" av RNA: protein (RNP) komplekser fra pattedyrceller. Denne tilnærmingen innebærer to immunoprecipitations av RNP under enheter og er derfor kalt RNA immunutfelling i tandem (RIPiT).

Abstract

RNA-immunutfelling i tandem (RIPiT) er en metode for å berike RNA-avtrykk av et par proteiner i et RNA: protein (RNP)-kompleks. RIPiT sysselsetter to rensing trinn. Først immunutfelling av en kodet RNP delenhet etterfølges av mild RNase fordøyelse og påfølgende ikke-denaturering affinitet eluering. En annen immunutfelling av et annet RNP delenhet tillater berikelse av et definert kompleks. Etter en denaturering eluering av RNAs og proteiner omdannes RNA-overføringene til biblioteker med høy gjennomstrømming for DNA-sekvenser. I motsetning til de mer populære ultrafiolette (UV) Cross Linking etterfulgt av immunutfelling (CLIP) tilnærming til å berike RBP bindende områder, er RIPiT UV-Cross Linking uavhengig. Derfor kan RIPiT brukes på en rekke proteiner som finnes i RNA-interactome, og utover det som er avgjørende for RNA-regulering, men ikke direkte kontakt RNA-eller UV-krysskobling dårlig til RNA. De to rensing trinnene i RIPiT gir en ekstra fordel av å identifisere bindende områder der et protein av interesse opptrer i samarbeid med en annen kofaktor. Den doble rensing strategien tjener også til å forbedre signalet ved å begrense bakgrunnen. Her gir vi en trinnvis fremgangsmåte for å utføre RIPiT og generere høy gjennomstrømming sekvensering biblioteker fra isolerte RNA fotavtrykk. Vi har også skissere RIPiT fordeler og programmer og diskutere noen av sine begrensninger.

Introduction

I cellene finnes RNA i komplekse med proteiner for å danne RNA: protein komplekser (RNPs). RNPs er satt sammen rundt RNA-bindende proteiner (RBPs, de som direkte binder RNA), men også består av ikke-RBPs (de som binder RBPs, men ikke RNA), og som ofte er dynamiske i naturen. RBPs og deres kofaktorer funksjon kollektivt innenfor RNPs å utføre regulatoriske funksjoner. For eksempel gjenkjenner UPF-proteinene (UPF1, UPF2 og UPF3b) den for tidlig avsluttet ribosom i den nonsense-mediert mRNA forfallet (NMD)-veien. Hvert av UPF-proteinene kan bindes til RNA, men det er først når de monterer sammen at et aktivt NMD-kompleks begynner å dannes. Innenfor dette komplekset blir UPF1 videre aktivert av fosforylering av en ikke-RBP SMG1, og slike UPF1 aktivisering fører til slutt til rekruttering av mRNA forfall inducing faktorer1,2. I dette eksempelet krever RBPs ikke-RBP kofaktorer for rekruttering og aktivering av RNP-komplekset som utløser NMD. Enda en eiendom av RNPs er deres heterogenitet. Vurder spliceosome, som finnes i distinkte E, A, B eller C komplekser. Ulike spliceosome komplekser har overlappende og distinkte proteiner3. For å studere RNP-funksjoner er det viktig å belyse hvilke RNAs som er bundet av en RBP og tilhørende proteiner. Mange metoder finnes for å oppnå dette, med hver tilnærming har sine distinkte fordeler og ulemper4,5,6,7.

Den allment populære metoder for å identifisere RBP bindende nettsteder-Cross Linking etterfulgt av immunutfelling (CLIP) og dens ulike variasjoner-stole på ultrafiolett (UV) lys for å krysskobling en RBP til RNA8. Dette er imidlertid ikke en effektiv tilnærming for ikke-RBPs innen RNPs, som ikke kontakter RNA direkte. Her beskriver vi en alternativ tilnærming som gjelder for både RBPs og ikke-RBPs, for å isolere og identifisere deres RNA bindende nettsteder. Denne tilnærmingen kalles RNA immunutfelling i tandem (RIPiT) består av to immunutfelling trinn, som bidrar til å oppnå høyere spesifisitet i forhold til en enkelt rensing (figur 1)9,10. Som individuelle immunutfelling (IP) trinnene kan utføres ved en lavere stringens i forhold til CLIP, RIPiT ikke avhengig av tilgjengeligheten av antistoffer som tåler tilstedeværelsen av sterke vaskemidler under immunutfelling. Den mest unike fordelen med RIPiT er evnen til å målrette to forskjellige proteiner i to rensing trinn; Dette gir en effektiv måte å berike en sammensetningsmessig distinkt RNP kompleks fra andre lignende komplekser11.

Små variasjoner i RIPiT prosedyren kan ytterligere forsterke RNP berikelse. For eksempel, noen RNA-protein eller protein-protein interaksjoner innen RNPs er forbigående, og det kan være vanskelig å effektivt rense overføringene av slike komplekser. For å stabilisere slike interaksjoner, kan RNPs være krysskoblet i celler med formaldehyd før cellelyse og RIPiT. For eksempel har vi observert at en svak interaksjon mellom ekson Junction kompleks (EJC) kjerne faktor, EIF4AIII og EJC demontering faktor, PYM12 kan stabiliseres med formaldehyd behandling slik at mer RNA fotavtrykk er beriket (data ikke vises). Før celle høsting og RIPiT, celler kan også behandles med medikamenter for å stabilisere eller berike RNPs i en bestemt tilstand. For eksempel, når du studerer proteiner som er fjernet fra mRNA under oversettelsen (f. eks, EJC13, UPF114), behandling med oversettelse hemmere som puromycin, cycloheximide eller harringtonine kan føre til økt belegg av proteiner på RNAs.

Mengden av RNA utvinnes fra RIPiT er vanligvis lav (0,5-10 pmoles, dvs, 10-250 ng RNA vurderer en gjennomsnittlig RNA lengde på 75 NT). Den primære årsaken til dette er at bare en liten brøkdel av et gitt protein er til stede i komplekse med andre proteiner i RNPs (noen "gratis" protein IP'ed i første trinn er tapt under den andre IP). For å generere RNA-SEQ-bibliotekene fra denne RNA-en, skisserer vi også her en tilpasning av tidligere utgitte protokoll egnet for slike lave RNA-innganger15,16 (figur 2), som gir klare prøver med høy gjennomstrømming i 3 Dager.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. etablering av stabil HEK293 Cell Lines uttrykke Tetracycline-induserbart FLAG-Tagged protein av interesse (POI)

  1. Seed HEK293 celler med et stabilt integrert FLP rekombinasjon Target (FRT) område ved en tetthet på 10 x 104 celler/ml i vekstmedium (Dulbecco ' s modifiserte Eagle medium [DMEM] + 10% fosterets storfe serum [FBS] + 1% penicillin-Streptomycin [penn/strep]) i 6- brønn plater. Tillat at cellene vokser over natten i en fuktet inkubator ved 37 ° c og 5% CO2 (standard vekstbetingelser for alle etterfølgende trinn).
  2. Neste dag, celler bør være ~ 70% confluent. Ifølge transfeksjoner reagens protokoll, transfect den FRT området som inneholder HEK293 celler med en 9:1 ratio av pcDNA5-TETO-FLAG-POI: pOG44.
    Merk: FLAGGET tag har sekvensen motivet DYKDDDDK (D = aspartic syre, Y = tyrosin, og K = lysin).
  3. Etter 24 timer, begynner antibiotika valg. Fjern medier og Legg til frisk vekstmedium supplert med 100 μg/mL hygromycin. Innen 72 h, untransfected celler skal begynne å dø.
  4. Hver 48-72 h, endre vekst Media og supplere med frisk hygromycin.
  5. Etter ~ 2 uker med valg, vil diskrete kolonier av stabilt transfekterte celler begynner å vises. Når koloniene er synlige for blotte øye, tilsett 1 mL Trypsin til platen og ruge i 5 min ved 37 ° c. Resuspend cellene i DMEM, Overfør celler til en ny 10 cm plate, og juster volumet til 10 mL frisk vekstmedium supplert med 100 mikrogram/mL hygromycin. La platen for å nå ~ 80% confluency å ytterligere utvide celler for å forberede permanente aksjer.
  6. Bestem hvor mye Tetracycline (tet) som kreves for å få det optimale nivået av FLAG-POI uttrykk for eksperimentet. Vokse celler i 12-brønn format og gjennomføre en titrering av tet mellom 0-1000 ng/mL rekkevidde for 16-24 h. Utfør vestlig blots på titrering prøvene med antistoff mot POI.
    Merk: For proteiner opp til ~ 60 kDa, den FLAG-Tagged og den endogene kopien av proteinet kan løses på natrium natriumdodecylsulfat sulfat-polyakrylamid gel elektroforese (SDS-side) for å sammenligne uttrykket nivåer av FLAG-POI til endogene motstykket. For større proteiner, kan signal intensitet i tet-indusert prøver sammenlignes med uninduced prøven. Den Tetracycline lager løsningen kan tilberedes ved 1 mg/mL i 100% etanol. Fortynninger av aksjen for cellekultur arbeid bør være i sterilt vann eller fosfat-bufret saltvann (PBS). Tetracycline lager bør tilberedes friskt en gang hver måned.

2. dyrking celler for Tetracycline induksjon og RIPiT prosedyre

  1. Seed stabilt integrert FLAG-POI HEK293 i en tetthet på 3 x 105 celler/ml i vekstmedium i 15 cm plater. Tillat at cellene vokser ved 37 ° c og 5% CO2.
    Merk: Generelt vil tre til 5 15 cm plater gir ~ 2-20 pmol av RNA fotavtrykk avhengig av overflod av RNP av interesse. Hvis RNPs vil bli formaldehyd krysskoblet og renset under strenge forhold, så dobbelt så mye innspill kan være nødvendig.
  2. Legg Tetracycline til pre-bestemt optimal konsentrasjon til media for å indusere uttrykk for FLAG-POI (se trinn 1,6) 16-24 h før celler vil bli høstet.
    Merk: Det er ikke nødvendig å endre vekstmedium. Celler skal være klar til å høste ca 72 h etter såing eller når platene er ~ 80% confluent. Det er viktig å unngå at cellene blir confluent.

3. celle høsting, formaldehyd behandling, og Cell lyse

  1. Vask monolag cellene forsiktig med 15 mL kjølt PBS for hver 15 cm plate. Deretter skrape av celler i 30 mL PBS. Hvis cellene ble behandlet med narkotika før høsting, supplere PBS med stoffet. Samle alle cellene i 50 mL konisk rør.
    Merk: For å bevare svake interaksjoner, kan celler bli krysskoblet med formaldehyd: tilsett formaldehyd til celle suspensjonen fra trinn 3,1 til en endelig konsentrasjon på 0,1% og ruge på en rocker ved romtemperatur i 10 min. Tilsett 3 mL slukke bufferen (tabell 1 ) og rock i 5 ekstra minutter.
  2. Pellet celler ved 400 x g for 10 min ved 4 ° c og kast supernatanten.
  3. Lyse celler i 4 mL iskald hypotonisk lyseringsbuffer (HLB; Tabell 1). Bruk en P1000 pipette for å resuspend celler. Overføring til 5 mL rør og ruge lysat på is i 10 min.
  4. Plasser lysat i et is bad og sonikere ved 10% amplitude for 30 s med 1 s pulser med 2 s pauser. Juster deretter salt konsentrasjonen til 150 mM ved å tilsette 108 μL av 5 M NaCl.
    Merk: Formaldehyd krysskoblet prøver kan være gjenstand for strengere lyse Rings-og rensing ved å inkludere 0,1% hver av SDS og natrium natriumdeoksykolat i lyseringsbufferen.
  5. Fjern lysat ved å sentrifugering ved 21 000 x g i 10 min ved 4 ° c. Samle 20 μL supernatanten (celle ekstrakt) i et merket rør for vestlig blot analyse av proteinnivåer i input (se Figur 3a).
    Merk: Mens lysat er i sentrifuge, kan FLAG agarose perler vaskes (se trinn 4,1). FLAG agarose perler bør være pre-vasket 3x i 4 mL iskald isoton vaskebuffer (IsoWB, tabell 1).

4. flagg-Immunutfelling

  1. Påfør gjenværende supernatanten fra trinn 3,5 til 750 μL pre-vasket flagg agarose perler i et 5 mL rør (seng volum av vasket FLAG agarose perler vil være 375 μL). Ruge FLAG agarose perler og celle ekstrakt for 1-3 h ved 4 ° c med skånsom miksing.
    Merk: Dette volumet av FLAG agarose perler bør være tilstrekkelig for et bredt spekter av proteiner, men kan være optimalisert, hvis nødvendig.
  2. Pellet FLAG agarose perler ved sentrifugering ved 400 x g for 1 min ved 4 ° c. Samle 20 μL av supernatanten i et merket rør for Western Blot analyse av proteinnivåer i utarmet celle ekstrakt (se Figur 3a). Kast de resterende supernatanten.
  3. For å vaske FLAG agarose perler, tilsett 4 mL IsoWB og resuspend. Pellet perler ved 400 x g for 1 min ved 4 ° c. Forsiktig fjerne supernatanten. Gjenta 4X.
    Merk: For strenge vasker av formaldehyd krysskoblet IPs, kan 0,1% hver av SDS og natrium natriumdeoksykolat inkluderes i vaskebuffer for de første to vasketrinn.

5. RNase jeg fordøyelse

  1. Fortynne RNase i å 0.002-0,01 enheter/mL i 750 μL av IsoWB (passende konsentrasjon for ønsket fotavtrykk størrelser må empirisk bestemmes). Legg IsoWB-RNase jeg til vasket FLAG agarose perler og ruge med skånsom miksing ved 4 ° c i 10 min.
  2. Pellet perler ved 400 x g for 1 min ved 4 ° c. Samle 20 μL supernatanten (RNase i eluering) i et merket rør for Western Blot-analyse. Kast IsoWB-RNase I og vask FLAG agarose perler 4X med IsoWB som beskrevet i trinn 4,3.

6. affinitet eluering

  1. Forbered et lager av eluering buffer (FLAG peptid på 250 ng/mL i IsoWB). Påfør 375 μL av eluering buffer til FLAG agarose perler og rist forsiktig ved 4 ° c for 1-2 h. pellet FLAG agarose perler og samle en 15 μL alikvot av eluering for Western Blot av proteiner i flagg IP (se Figur 3a).
    Merk: Når affinitet eluering er underveis, kan § 7 utføres.

7. magnetisk perle-antistoff Bøyning

  1. Vask 50-Dynabeads μL magnetiske perler (dvs. Tabell med materialer) 3x i 1 mL IsoWB i 1,5 mL rør. Resuspend magnetiske perler i 100 μL av Bøyning buffer. Legg passende mengde antistoff (nøyaktig mengde antistoff som skal brukes for IP må empirisk bestemmes for hvert antistoff).
    Merk: Protein en magnetisk perler er optimale for antistoffer som produseres i kanin mens protein G magnetiske perler er mer hensiktsmessig for mus antistoffer. Magnetiske perler kompatibilitet diagram er tilgjengelig på leverandørens nettsted for å velge perler egnet for hvert antistoff.
  2. Vask magnetiske perler 2x i Bøyning (tabell 1). Ruge blanding ved romtemperatur i minst 10 min. Resuspend magnetiske perler i 375 μL av RIPiT fortynning buffer. Lagre på isen til neste trinn.

8. andre Immunutfelling

  1. Påfør gjenværende FLAG affinitet eluering fra trinn 6,1 til magnetiske perler koplet til antistoffer mot protein av interesse. Ruge med skånsom miksing ved 4 ° c for 1-2 h. Fang magnetiske perler på en magnet og samle 15 μL av supernatanten for analyse av ubundne proteiner via Western Blot. Vask magnetiske perler 7x med 1 mL IsoWB.

9. denaturering eluering

  1. Tilsett 100 μL av klar prøve buffer (tabell 1) til magnetiske perler og resuspend med en P200 pipette. Ruge på isen i 10 min. knips forsiktig for å resuspend perler med jevne mellomrom.
  2. Fang magnetiske perler på en magnet og samle 15 μL av eluering for analyse av proteiner i RIPiT eluering via Western Blot (se Figur 3a). Overfør gjenværende eluering til et nytt merket 1,5 mL rør.
    Merk: Hvis prøvene var formaldehyd krysskoblet, så prøver må være inkubert ved 65 ° c for 1 t for å reversere Cross Linking.
  3. Utfør vestlige blots på prøver som er samlet inn ved ulike trinn (input, flagg IP-tømming, flagg-IP, andre IP-eluering). Blot med antistoffer mot de to agn proteiner, deres andre interaktører hvis kjent, og minst en ikke-samspill RBP som en negativ kontroll (Figur 3a).

10. RNA-ekstraksjon og slutt herding

  1. Til RIPiT-eluering legger du 320 μL av RNase-Free ddH2O, 400 μL av fenol-kloroform isoamylacetat alkohol (PCIAA, pH 4,5) og Vortex for 30 s og spinner ved romtemperatur ved 12 000 x g i 5 min. samle inn 350 μL av vandig fase i et separat rør. Tilsett 35 μL av 3 M natrium acetate, 1 μL av 1 M MgCl, 10 μg av glykogen og 1 ml 100% etanol. Ruge over natten ved-20 ° c.
  2. Til pellet RNA, sentrifuge ved 12 000 x g i 30 min ved 4 ° c. Vask RNA i 70% etanol.
  3. For å fjerne 3 ' fosfat igjen på RNA etter RNase jeg kløft, resuspend RNA pellet i 17 μL av RNase-Free ddH2O, og tilsett 2 μL av 10x T4 polynucleotide KINASE (pnk) buffer (tabell over materialer) og 1 μL av T4 pnk. Ruge ved 37 ° c i 30 min.
    Merk: Den 3 ' fosfatase aktiviteten til T4 PNK har optimal aktivitet ved pH 617. PNK reaksjonsbuffer er optimalisert for 5 ' kinase aktiviteten til T4 PNK og har en pH på 7,6. Mens justere pH av slutt herding reaksjonen har blitt forsøkt, kan dette trinnet bli ytterligere optimalisert.
  4. Tilsett 380 μL av RNase-Free ddH2O og 400 ΜL av PCIAA pH 4,5 til røret. Vortex for 30 s, sentrifuge ved 12 000 x g i 5 min. samle vandig fase og tilsett 35 μL av 3 M natrium acetate, 1 μL av 1 M MgCl2, 10 mikrogram glykogen, og 1 ml 100% etanol.
  5. Ruge over natten ved-20 ° c. Pellet og vask RNA med 70% etanol som ovenfor. Resuspend RNA i 4,5 av RNase-fritt vann.

11. estimering av RNA footprint størrelse og overflod

  1. En vellykket RIPiT er forventet å gi 1 pmol eller mer av RNA fragmenter. For å kvantifisere faktisk utbytte, Overfør 0,7 μL av RIPiT RNA (~ 1/6 av total utbytte) til et nytt rør. Tilsett 2 μL av 10x T4 PNK buffer, 1 μL av 1 mM ATP, 40 μCi γ32P-ATP (0,5 − 1,0 μL av aksjen), og 1 μL av T4 pnk. Juster volumet til 10 μL og ruge ved 37 ° c i 30 minutter.
    1. I parallelle PNK-reaksjoner, Label en lav rekkevidde DNA Ladder og 0,1 pmol av en syntetisk RNA eller DNA oligo (20-40 NT) til å bruke en størrelse og kvantitet standarder.
  2. Løs merket RNA/DNA på 26% urea-side gel (20 x 27 x 0,45 mm3). Gel må være pre-Run for 30 min på 35 W. flush brønner før pre-Run og før lasting prøver og kjøre på 35 W til bromophenol blå fargestoff fronten har nesten nådd slutten av gel.
  3. Forsiktig fjerne gel fra glassplater på et stykke av 8 x 11 tommer filter papir. Med gel på toppen av papiret, plass i gel tørking apparater og dekk med et stykke plast brytes. Tørr gel ved 80 ° c for 1 time med vakuum.
  4. Utsett tørket gel til en phosphoscreen over natten eller til tilstrekkelig signal oppdages. Bilde phosphoscreen. God kvalitet RNA fra en RIPiT skal fremstå som en flekk i kjørefelt, med minimal fremtredende band (Figur 3B). For å kvantifisere RNA, sammenlign signal intensiteten til den ønskede størrelsen RNA-fragmenter i RIPiT kjørefelt til signalet fra 0,1 pmol av merket syntetisk oligo.
    Merk: Alternativt kan RNA fotavtrykk størrelse og beløp verifiseres ved hjelp av en høysensitiv bioanalyzer (Figur 3C).

12. adapter ligation

  1. Forbered RIPiT RNA slik at minst 3 pmol av RNA oppløses i 3,8 μL vann.
  2. I en 0,2 mL polymerase kjedere reaksjon (PCR) tube, kombinerer 3,8 μL av RNA, 1 μL av miR-CAT-33 pre-adenylated adapter (7 μM) (tabell av materialer). Ruge blandingen på en termisk cycler ved 65 ° c i 10 min, 16 ° c i 5 min, og hold deretter ved 4 ° c.
    Merk: Den pre-adenylated linker kan enten bestilles fra oligo syntese tjenesten, eller en tilpasset unadenylated DNA oligo fra alle oligo syntese tjenesten kan adenylated ved hjelp mth RNA ligase (tabell over materialer) og gel renset.
  3. Til samme rør, tilsett 1,5 μL av 10x T4 RNA ligase buffer, 7,5 μL av 50% polyetylen glykol 8000 (PEG-8000), 0,75 μL av 20 mM dithiotreitol (DTT), og 0,45 μL av T4 RNL2 tr. K227Q (tabell over materialer).
    Merk: 50% PEG-8000 leveres med RNA-ligase og buffer kjøpt. PEG-8000 løsninger er tyktflytende og bør Pipet tert langsomt.
  4. Ruge reaksjon i den termiske cycler ved 30 ° c for 6 h, Deaktiver varme ligase ved 65 ° c i 10 min, og hold deretter ved 4 ° c.

13. omvendt transkripsjon

  1. Til røret med den ligation blandingen fra trinn 12,4, tilsett 11,25 μL av 4X deoxynucleotides trifosfat (dNTP), som inneholder en blanding av regelmessige og biotinylated dNTPs (se tabell 1), 1,0 μL av 10 μM RT-primere (tabell av materialer), og 6,8 μL av RNase-fritt vann. Ruge ved 65 ° c i 5 minutter, og hold deretter ved 4 ° c.
  2. Overfør rør til is og Legg 9,0 μL av 5x første-strand (FS) buffer uten MgCl2 (tabell 1), 2,25 ΜL av 100 mm DTT, 1,2 μL av omvendt transkriptase enzym til et endelig volum på 45 ΜL (tabell av materialer).
  3. Ruge i en termisk cycler ved 55 ° c i 30-60 min. Heat Deaktiver revers transkriptase ved 70 ° c i 15 min og hold prøven ved 4 ° c.

14. rensing av RT-produkt

  1. Tilsett 45 μL av 2x urea belastnings buffer (tabell 1) til RT reaksjon. Fortynne 1 μg av en lav rekkevidde DNA Ladder i 45 og tilsett 45 μL av 2x urea Last buffer.
  2. Forbered 10% urea-side gel (20 x 28 x 0,15 cm3; Tabell 1) med 8-brønn kam. Bruk sprøyte eller Pipet, skyll brønner med 0,5 x Tris/borate/EDTA (TBE) buffer.
    Merk: Den hjemmelagde gels ovenfor gir bedre oppløsning i å skille det utvidede RT produktet fra udistribuerte RT primer. Som et alternativ, pre-cast urea-side gels kan også brukes (tabell over materialer). Som pre-cast gels tillate mindre maksimale volumer per brønn, så prøver må deles inn i flere brønner. Pre-cast gels bør kjøres på 150 − 200 V.
  3. Pre-Run gelen på 35 W i 30 min. flush brønner igjen, laste prøver og kjøre gel på 35 W til bromophenol blå fargestoff front har migrert til ca 1 tomme fra slutten av gel.
    Merk: Bruk metall kjøleribbe under pre-Run og den endelige løpe for å hindre gel overoppheting.
  4. Stain gelen i 5 min i 1x gull nukleinsyre syre gel flekk løsning fremstilt i 0,5 x TBE. Dette fargestoffet er lysfølsom, så unngå lys eksponering.
  5. Image gel på fluorescerende skanner for dokumentasjon ved hjelp av 520 NM eksitasjon og 580 NM utslipps filtre. Hvis en fluorescerende skanner ikke er tilgjengelig, bruker du et blått lys transilluminator. RT-produktet skal vises som en flekk som starter over udistribuerte RT-primer (Figur 4).
    Merk: Selv om gull nukleinsyre syre gel farging fargestoff er lett å visualisere på en gel doc med UV-lyskilde, er det viktig å ikke utsette verdifulle RT produktet til UV for å hindre skade.
  6. Visualiser gelen på et blått lys transilluminator og avgiftsdirektoratet RT produktet fra gel. Det anbefales å kutte DNA med utvidelser som spenner fra 30-200 NT (Figur 4). Plasser excised gel brikkene på en ren overflate og hakke stykket i små biter for å øke areal. Overfør forsiktig til et 1,5 mL rør og tilsett 800 μL av DNA eluering buffer (tabell 1).
  7. Ruge gel biter med skånsom blanding med DNA eluering buffer over natten ved romtemperatur.
  8. Skill eluering buffer fra gelen ved å sende slurry gjennom en cellulose acetate filter kolonne (tabell av materialer) plassert i en 2 ml samling tube.
  9. I 1,5 mL rør, vask 10 μL av streptavidin magnetiske perler med 500 μL av streptavidin perle vaskebuffer (tabell 1). Gjenta for tre totale vasker. Ikke la perlene tørke ut. Resuspend perler i 10 μL av DNA eluering buffer (tabell 1).
  10. Overfør eluering buffer atskilt fra gel brikkene i trinn 14,8 til røret som inneholder de vasket streptavidin magnetiske perler.
  11. Ruge med skånsom blanding i minst 8 timer ved romtemperatur. Fang perlene på en magnet, Fjern supernatanten og resuspend magnetiske perler i 10 μL av RNase-fritt vann og Overfør til en 0,2 mL PCR-slange.

15. Circularization av RT-produkter

  1. RT-produkter tatt på streptavidin perler er circularized mens bundet på perler. Til magnetisk bead slurry, tilsett 2,0 μL av 10x circularization reaksjonsbuffer, 1,0 μL av 1 mM ATP, 1,0 μL av 50 mM MnCl2, 4,0 μL av 5 M betaine, 1,0 μL av ssDNA ligase i (tabell over materialer), og 1,0 μL av RNase-fritt vann.
  2. Ruge den circularization reaksjonen på en termisk cycler ved 60 ° c for 4 h. Heat Deaktiver ssDNA-ligase ved oppvarming ved 80 ° c i 10 minutter og hold ved 4 ° c.

16. test PCR

  1. Før du går videre til en storstilt PCR, bør du bruke en del av circularized produkt for å finne det ideelle antallet forsterknings sykluser for hver prøve. Dette trinnet bidrar til å hindre over-forsterkning og begrense PCR-artefakter som PCR reaksjons komponenter blir begrensende ved høyere PCR-sykluser.
  2. Klargjør en 45 μL PCR-reaksjon med 4,0-6.0 μL av det circularized produktet fra trinn 15,2, 9,0 μL av 5x reaksjonsbuffer, 0,9 μL 10 M dNTPs, 2,25 μL av 10 μM PE 1,0 primer (tabell av materialer), 2,25 μL av 10 μm PE 2.0 primer (tabell av materialer) og 0,045 av høykvalitets DNA-polymerase (Material tabell) og vann.
  3. Bland reaksjonen godt og delt inn i 3 15 μL reaksjoner. Hver av disse tre reaksjonene vil være gjenstand for et variabelt antall PCR-sykluser. Det ideelle antall sykluser er forventet å være mellom 7 og 14. Så utfører test PCRene for 8, 11 og 14 sykluser.
  4. Bruk følgende PCR-betingelser: 98 ° c-30 s; 98 ° c-5 s; 65 ° c-10 s; 72 ° c-15 s; 72 ° c-2 min; 12 ° c-hold.
  5. Tilsett 3 μL av 6 ganger gel lasting fargestoff og løse på 10% native PAGE gel til blå fargestoff fronten har migrert 3/4 av gel. Stain gelen ved hjelp av gull nukleinsyre acid gel beis og bilde som i trinn 14,4 og 14,5 (figur 5).
  6. For å velge det ideelle antallet PCR-sykluser, sammenlign PCR-produkter fra økende antall sykluser. Velg syklus nummer som gir den største mengden av produktet av forventet størrelse uten overamplification gjenstander (f. eks DNA smøre mye større enn forventet produkt, og hvor ingen merkbar reduksjon av PE 1.0 og PE 2.0 primere er sett (se rød pil i Figur 5).

17. PCR i stor skala

  1. Klargjør en 45 μL PCR-reaksjon, som i trinn 16,2, og gjenta PCR. Løs PCR på 10% native PAGE på 150 V, beis med 1x gull nukleinsyre acid gel beis og bilde på et blått lys transilluminator.
  2. Avgiftsdirektoratet PCR-produktet fra gelen og overføring til en 3 mL sprøyte. Bruk sprøyten til å knuse gelen og extrude i en 1,5 mL slange.
    Merk: Det udistribuerte RT-produktet ved circularization gir PCR-produkt av 151 BP. Således, på dette trinnet en bør størrelsen velge produkter som er større enn 151 BP (figur 6).
  3. Tilsett 900 μL av DNA eluering buffer og ruge ved romtemperatur over natten med skånsom miksing.
  4. Overfør gel slurry til en cellulose acetate filter kolonne plassert i en 2 mL samling tube. Spin på 12 000 x g for 3 min, samle supernatanten inn i en fersk tube.
  5. Tilsett ytterligere 400 μL av DNA eluering buffer til den knuste gelen og Overfør til et 1,5 mL rør. Ruge med skånsom miksing i ytterligere 4 timer for en ekstra eluering.
  6. Pool alle elutions og delt inn i 3 rør med 400 μL hver. Utløse DNA ved å tilsette 1 mL 100% etanol og 10 mikrogram glykogen. Vortex og ruge minst 2 timer ved-20 ° c.
  7. Pellet DNA ved 12 000 x g i 30 min ved 4 ° c. Vask DNA pellet med 70% etanol.
  8. Fjern forsiktig alle etanol ved pipettering og resuspend raskt DNA-pellets i 20 μL vann.
    Merk: På dette stadiet er det viktig å ikke la DNA pellet bli tørr, som tørking DNA ut kan denaturere det.
  9. Bruk en liten del av DNA-prøven til å bestemme størrelsen og konsentrasjonen av PCR-produktet via fluorometer og DNA-bioanalyzer med høy følsomhet. Prøver kan nå sendes for sekvensering på en av plattformene.
  10. Det i rekkefølge leser kan bearbeidet (e.g., adapter flytting, trimmer å oppbevare sekvenser > 30 Phred snes), oppstilt å anbefalingen Genova, og visualisere opp på en kikker som UCSC Genova kikker (skikkelsen 7).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

En vellykket RIPiT vil resultere i immunutfelling av både proteiner av interesse og andre kjente samspill proteiner, og fraværet av ikke-samspill proteiner. Som sett i Figur 3A, ble både Magoh og EIF4AIII påvist i RIPIT eluering, men HNRNPA1 var ikke (Lane 6). Parallelt ble RNA fotavtrykk som har co-renset med RNP komplekser oppdaget via autoradiografi (Figur 3B) eller bioanalyzer (Figur 3C). Puromycin behandling forventes å øke EJC-belegget på RNA, og det ble observert et sterkere RNA fotavtrykk signal i Puromycin behandlet RIPiT i Figur 3B (sammenlign Lanes 2 og 3). Generering av prøver for dyp sekvensering krever ligating av en adapter til RNA, og deretter reversere transkribere RNA til DNA ved hjelp av en primer som anneals til adapter sekvensen. Den omvendte transkripsjon trinn inkorporerer biotinylated nukleotider, for rensing av omvendt transkripsjon produkt. Etter omvendt transkripsjon, må produktet skilles fra udistribuerte adapter av urea-side (Figur 4). Det omvendte transkripsjon produktet er deretter circularized og PCR forsterket. Riktig antall PCR-sykluser må ikke overamplify det circularized produktet. Overamplification vil resultere i primer tømming og avvikende PCR-produkt (se figur 5, Lane 4). Antall sykluser med størst forsterkning uten bevis for overamplification er mest hensiktsmessig å bruke for en storstilt PCR (figur 5 Lane 3 og figur 6).

Figure 1
Figur 1 : Skjematisk skisserte de viktigste trinnene i RIPiT. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3

Figur 2 : Skjematisk fremstilling av arbeidsflyten for konvertering av RIPIT RNA til biblioteker for sekvenser med høy gjennomstrømming. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2

Figur 3 : Estimering av RNA og protein gir fra RIPiT. (A) Western Blot av proteiner renset fra hvert stort skritt i RIPiT prosedyren. (B) Autoradiograph bilde av RNA fotavtrykk fra et flagg-MAGOH: EIF4AIII RIPiT sammenligne puromycin behandlet og ubehandlede celler. Rød boks indikerer RNA fotavtrykk størrelsen som til slutt vil bli konvertert til sekvensering biblioteker. (C) profilen til RNA-Eluert fra RIPiT som i felt 2 i panel B ved bruk av en bioanalyzer. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4 : Reverse transkripsjon (RT) produkt løst på en 10% urea-side gel og beiset med gull nukleinsyre acid gel flekken. Rød boks indikerer gel-region excised for gel rensing av utvidede RT-produkter. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5 : Test PCR løst på 8% ikke-DENATURERING side. Legg merke til aberrantly store PCR-produkter som vises ved 14 sykluser (rød boks) og parallell tømming av primere (rød pil) indikasjon på overamplification. For dette eksempelet ble 11 sykluser valgt for stor skala PCR (blå boks). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6 : Stor skala PCR løst på 8% ikke-DENATURERING side. Rød boks indikerer gel stykke excised for gel rensing. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 7
Figur 7 : Genova kikker skjermene av det MAPK1 gen viser distribusjon av flagg-MAGOH: EIF4AIII fotavtrykk idet Distinguished resultater fra en RIPiT. Røde piler angir de forventede kanoniske områdene for EJC binding. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Pbs 137 mM NaCl
2,7 mM KCl
10 mM na2HPO4· 7H2O
KH2PO4
pH-7,4
Slukke buffer 2,5 M Glycine
2,5 mM Tris-sokkel
Hypotonisk lyse Rings buffer (HLB) 20 mM pH-7,5 i Tris-HCl
15 mM NaCl
10 mM EDTA
0,5% IGEPAL
0,1% Triton-X-100
1x Aprotinin *
1x Leupeptin *
1x Pepstatin *
1 mM PMSF (phenylmethylsulfonyl fluor) *		 * må legges friskt hver gang
Isoton vaske buffer (IsoWB) 20 mM pH-7,5 i Tris-HCl
150 mM NaCl
0,1% IGEPAL
Bøyning 0,02% polysorbat-20
1x PBS
Tøm prøve buffer 100 mM Tris-HCl pH 6,8
4% SDS
10 mM EDTA
4xdNTPmix 0,25 mM dGTP
0,25 mM dTTP
0,175 mM dATP
0,1625 mM dCTP
0,075 mM biotin-dATP
0,0875 mM biotin-dCTP
5x første-strand buffer m/o MgCl2 250 mM Tris-HCl pH 8
375 mM KCl
RIPiT fortynning buffer (1 mL) 1 mL IsoWB
5 μL 200x BSA
20 μL 10% Triton-X-100
20 μL 0,5 M EDTA
1x Aprotinin *
1x Leupeptin *
1x Pepstatin *
1 mM PMSF *		 * må legges friskt hver gang
2x denaturering belastnings buffer 3 mL 5x TBE
1,8 g Ficoll type 400
6,3 g urea
3 mg bromophenol blå
3 mg xylen cyanol
Juster volumet til 15 mL ddH2O		 For å komme inn i løsningen, plassere røret i vann i et beger og kok på varm plate i 10 – 15 min. Legg til fargestoffer etter å ha justert volumet til 15 mL
Urea-side gel 6 M urea
Akrylamid: bisacrylamide (40% [w/v]) til riktig prosentandel
0,5 x TBE
0,01% TEMED
DNA eluering buffer 300 mM NaCl
1 mM EDTA
Streptavidin perle vask buffer 0,5 M NaOH
20 mM pH-7,5 i Tris-HCl
1 mM EDTA

Tabell 1: buffere.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi diskuterer her noen viktige hensyn å kunne utføre RIPiT. Fremst må individuelle IP-adresser optimaliseres for å oppnå høyest mulig effektivitet på hvert trinn. Mengden av FLAG agarose perler for input antall celler som er beskrevet her har vist seg å være robust for et bredt spekter av proteiner vi har testet. Som bare en liten brøkdel av partner proteiner er co-immunoprecipitated med FLAGGET protein, er mengden av antistoff som trengs for effektiv andre IP vanligvis lav (mindre enn 10 μg). Småskala RIPiT (fra 1 10 cm plate) etterfulgt av Western Blot verifisering av proteiner i hver brøkdel av de to immunutfelling trinnene vise seg svært nyttig for å vurdere effektiviteten og spesifisitet av prosedyren før skalering opp. Både målrettede proteiner og andre forventede samspill proteiner i komplekset bør oppdages i eluering. Det er også gunstig å analysen for proteiner i utarmet lysater (ubundet av flagg-agarose eller magnetiske perler) å ha et godt anslag over immunutfelling effektivitet og prosentandelen av proteiner som monteres inn i et kompleks. Videre informerer denne analysen også om RNase fordøyelse forhold er tilstrekkelige til å skille RNA-avhengige interaksjoner fra RNA-uavhengige interaksjoner i en RNP. Derfor er det like viktig å inkludere en negativ kontroll, ideelt en RBP relatert til RNP av interesse. I Figur 3Aer for eksempel HNRNPA1 tilstede i inn dataene, men oppdages ikke i RIPiT eluering. HNRNPA1 er en RBP som ikke samhandler direkte med EJC, men kommuniserer indirekte med EJC når EJC og HNRNPA1 er bundet til det samme RNA-molekylet. Påvisning av det negative kontroll proteinet i eluering indikerer enten dårlig RIPiT-spesifisitet eller utilstrekkelig RNA-Footprinting. I et slikt tilfelle, vil RNA fotavtrykk innhentet ikke helt gjenspeile overføringene av protein av interesse. Fotavtrykk av størrelse 50-200 NT anbefales for etterfølgende RNA-SEQ. varighet av RNase jeg behandling eller mengden av enzymet som brukes kan optimaliseres for å oppnå ønsket størrelse fotavtrykk. Vær oppmerksom på at det beste tilfellet vil være å oppnå godt signal i ønsket størrelsesområde, og det er uunngåelig å ha lengre og kortere RNAs selv i de mest optimale forhold. RIPiT kan også brukes til å skaffe bindende områder av en enkelt RBP. I et slikt tilfelle kan det samme proteinet bli immunoprecipitated med to forskjellige antistoffer, først bruke et antistoff mot en affinitet kode og deretter med antistoffer mot proteinet selv18. Til slutt, en negativ kontroll RIPiT kan utføres parallelt fra cellene uttrykker en FLAG-Tagged kontroll protein (f. eks, grønt fluorescerende protein) i kombinasjon med antistoff mot et protein mot et ikke-relatert protein i andre IP.

Til tross for sine mange fordeler, er det viktig å vurdere noen begrensninger av RIPiT tilnærming, og mulige løsninger. Kravet om affinitet eluering etter den første rensing nødvendiggjør den biologiske kilden til å uttrykke en kodet protein. Hvis en områdespesifikk rekombinasjon system ikke er tilgjengelig i cellelinjen eller organisme av interesse, en kort affinitet kode som en FLAG tag (8 aminosyrer) kan innføres på endogene genet geometriske bruker CRISPR/CAS-baserte Genova redigering tilnærming19. FLAGGET tag er en ideell epitope for denne tilnærmingen, fordi FLAG antistoff er godt egnet for affinitet eluering og tåler høy ioniske styrker og milde denaturering forhold som kan brukes i kombinasjon med formaldehyd Cross Linking. En annen begrensning av RIPiT tilnærming er behovet for en stor input av mobilnettet materiale. Dette kan være uunngåelig til en viss grad som bare en liten prosentandel av en RBP sannsynlig samhandler med andre proteiner i RNP. Fortsatt forbedret biblioteket forberedelse tilnærminger kan bidra til å få ned store innspill kravet. Mulige ideer for ytterligere å strømlinjeforme disse trinnene omfatter å utføre RNA 3 '-end-defosforylering og adapter-ligation på magnet perlene umiddelbart etter andre IP-vasker og før den endelige eluering av RNP. En slik tilnærming er implementert i gjeldende CLIP-SEQ prosedyrer og i en nylig beskrevet variant av RIPiT20. Slike endringer vil også fjerne flere tidkrevende RNA rensing trinn fra de tidlige fasene av biblioteket forberedelse prosedyre. Videre, i motsetning til CLIP, som gir en nukleotid nivå oppløsning på Cross Linking stedet av en RBP på RNA, oppløsning på RIPiT fotavtrykk vil forbli på nivået av titalls nukleotider. Til slutt, som RNPs kan omfatte flere RBPs, den RIPiT beriket RNA nettsteder inkluderer en blanding av bindende områder av mange RBPs. Som konsensus sekvenser bundet av individuelle RBPs blir avdekket på et raskt økende tempo og er nå lett tilgjengelig21,22,23, denne informasjonen kan utnyttes til å deconvolve utvalg av RBP nettsteder beriket med RIPiT-utganger. Til tross for disse utfordringene er RIPiT-SEQ en effektiv prosedyre for å fange opp RNA-avtrykk av dynamiske, heterogene og til og med forbigående RNP-komplekser, som kan gi unik innsikt i det indre arbeidet til RNA-machineries som kontrollerer mobilnettet Funksjonen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av NIH Grant GM120209 (GS). Forfatterne takker OSUCCC Genomics delte ressurser Core for sine tjenester (CCC support Grant NCI P30 CA16058).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-FLAG Affinity Gel Sigma A2220
ATP, [γ-32P]- 3,000 Ci/mmol 10 mCi/mL EasyTide, 250 µCi PerkinElmer BLU502A250UC
BD Disposable Syringes with Luer-Lok Tips (200) Fisher 14-823-435
Betaine 5M Sigma B0300
biotin-dATP TriLink N-5002
biotin-dCTP Perkin Elmer NEL540001EA
Branson Sonifier, Model SSE-1 Branson
CircLigase I VWR 76081-606 ssDNA ligase I
DMEM, High Glucose ThermoFisher 11995-065
DNA load buffer NEB NEB
Dynabeads Protein A LifeTech 10002D
Flp-In-T-REx 293 Cell Line ThermoFisher R78007
GeneRuler Low Range DNA Ladder ThermoScientific FERSM1203
Hygromycin B ThermoFisher 10687010
Mini-PROTEAN TBE Gel 10 well Bio-Rad 4565013
Mini-PROTEAN TBE-Urea Gel Bio-Rad 4566033
miRCAT-33 adapter 5′-TGGAATTCTCGGGTGCCAAGGddC-3′ Any this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform
Mirus transIT-X2 transfection reagent Mirus MIR 6004
Mth RNA ligase NEB E2610S
PE1.0 5′-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACT
CTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC*T-3′		 Any this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform
PE2.0 5′-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGGTCTC
GGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATC*T-3′		 Any this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform
Phenol/Chloroform/Isoamyl Alcohol (25:24:1, pH 6.7, 100 mLl) Fisher BP1752I-100
Purple Gel Loading Dye (6x) NEB NEB #7025
Q5 DNA Polymerase NEB M0491S/L
RNase I, E. coli, 1,000 U Eppicenter N6901K
SPIN-X column Corning CLS8160-24EA
Streptavidin beads ThermoFisher 60210
Superscript III (SSIII) ThermoScientific 18080044 reverse transcriptase enzyme
SybrGold ThermoFisher S11494 gold nucleic acid gel stain
T4 Polynucleotide Kinase-2500U NEB M0201L
T4RNL2 Tr. K227Q NEB M0351S
Tetracycline Sigma 87128
Thermostable 5´ App DNA/RNA Ligase NEB M0319S
TruSeq_SE1 5′-pGGCACTANNNNNAGATCGGAAGA
GCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTC
TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′		 Any this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform
TruSeq_SE10 5′-pGGTGTTCNNNNNAGATCGGAAG
AGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCT
CTTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′		 Any this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform
TruSeq_SE11 5′-pGGTAAGTNNNNNAGATCGGAA
GAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTC
TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′		 Any this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform
TruSeq_SE12 5′-pGGAGATGNNNNNAGATCGGAAGA
GCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTC
TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′		 Any this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform
TruSeq_SE2 5′-pGGGTAGCNNNNNAGATCGGAAGAG
CGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCT
CTTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′		 Any this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform
TruSeq_SE35′-pGGTCGATNNNNNAGATCGGAAG
AGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCT
CTTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′		 Any this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform
TruSeq_SE4 5′-pGGCCTCGNNNNNAGATCGGAAGA
GCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTC
TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′		 Any this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform
TruSeq_SE5 5′-pGGTGACANNNNNAGATCGGAAGA
GCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTC
TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′		 Any this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform
TruSeq_SE6 5′-pGGTAGACNNNNNAGATCGGAAGAG
CGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTC
CGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′		 Any this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform
TruSeq_SE7 5′-pGGGCCCTNNNNNAGATCGGAAG
AGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCT
TCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′		 Any this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform
TruSeq_SE8 5′-pGGATCGGNNNNNAGATCGGAAGAG
CGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTT
CCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′		 Any this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform
TruSeq_SE9 5′-pGGACTGANNNNNAGATCGGAAGAG
CGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTC
CGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′		 Any this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform
Typhoon 5 Bimolecular Imager GE Healthcare Life Science 29187191

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Karousis, E. D., Nasif, S., Mühlemann, O. Nonsense-mediated mRNA decay: novel mechanistic insights and biological impact. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 7 (5), 661-682 (2016).
  2. Ivanov, P. V., Gehring, N. H., Kunz, J. B., Hentze, M. W., Kulozik, A. E. Interactions between UPF1, eRFs, PABP and the exon junction complex suggest an integrated model for mammalian NMD pathways. The EMBO Journal. 27 (5), 736-747 (2008).
  3. Papasaikas, P., Valcárcel, J. The Spliceosome: The Ultimate RNA Chaperone and Sculptor. Trends in Biochemical Sciences. 41 (1), 33-45 (2016).
  4. Jensen, K. B., Darnell, R. B. CLIP: Crosslinking and ImmunoPrecipitation of In Vivo RNA Targets of RNA-Binding Proteins. Methods in Molecular Biology. 488, Clifton, N.J. 85-98 (2008).
  5. Garzia, A., Morozov, P., Sajek, M., Meyer, C., Tuschl, T. PAR-CLIP for Discovering Target Sites of RNA-Binding Proteins. mRNA Decay: Methods and Protocols. 1720, 55-75 (2018).
  6. Konig, J., et al. iCLIP - Transcriptome-wide Mapping of Protein-RNA Interactions with Individual Nucleotide Resolution. Journal of Visualized Experiments. (50), e2638 (2011).
  7. Sibley, C. R. Individual Nucleotide Resolution UV Cross-Linking and Immunoprecipitation (iCLIP) to Determine Protein-RNA Interactions. RNA Detection: Methods and Protocols. 1649, 427-454 (2018).
  8. Wheeler, E. C., Van Nostrand, E. L., Yeo, G. W. Advances and challenges in the detection of transcriptome‐wide protein-RNA interactions. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 9 (1), (2018).
  9. Singh, G., et al. The Cellular EJC Interactome Reveals Higher-Order mRNP Structure and an EJC-SR Protein Nexus. Cell. 151, 750-764 (2012).
  10. Singh, G., Ricci, E. P., Moore, M. J. RIPiT-Seq: A high-throughput approach for footprinting RNA:protein complexes. Methods. 65, 320-332 (2014).
  11. Mabin, J. W., et al. The Exon Junction Complex Undergoes a Compositional Switch that Alters mRNP Structure and Nonsense-Mediated mRNA Decay Activity. Cell Reports. 25 (9), 2431-2446 (2018).
  12. Gehring, N. H., Lamprinaki, S., Kulozik, A. E., Hentze, M. W. Disassembly of Exon Junction Complexes by PYM. Cell. 137 (3), 536-548 (2009).
  13. Dostie, J., Dreyfuss, G. Translation Is Required to Remove Y14 from mRNAs in the Cytoplasm. Current Biology. 12 (13), 1060-1067 (2002).
  14. Zünd, D., Gruber, A. R., Zavolan, M., Mühlemann, O. Translation-dependent displacement of UPF1 from coding sequences causes its enrichment in 3' UTRs. Nature Structural & Molecular Biology. 20 (8), 936-943 (2013).
  15. Gangras, P., Dayeh, D. M., Mabin, J. W., Nakanishi, K., Singh, G. Cloning and Identification of Recombinant Argonaute-Bound Small RNAs Using Next-Generation Sequencing. Argonaute Proteins: Methods and Protocols. 1680, 1-28 (2018).
  16. Heyer, E. E., Ozadam, H., Ricci, E. P., Cenik, C., Moore, M. J. An optimized kit-free method for making strand-specific deep sequencing libraries from RNA fragments. Nucleic Acids Research. 43 (1), 2 (2015).
  17. Cameron, V., Uhlenbeck, O. C. 3'-Phosphatase activity in T4 polynucleotide kinase. Biochemistry. 16 (23), 5120-5126 (1977).
  18. Ricci, E. P., et al. Staufen1 senses overall transcript secondary structure to regulate translation. Nature Structural & Molecular Biology. 21 (1), 26-35 (2014).
  19. Lackner, D. H., et al. A generic strategy for CRISPR-Cas9-mediated gene tagging. Nature Communications. 6, 10237 (2015).
  20. Metkar, M., et al. Higher-Order Organization Principles of Pre-translational mRNPs. Molecular Cell. 72 (4), 715-726 (2018).
  21. Giudice, G., Sánchez-Cabo, F., Torroja, C., Lara-Pezzi, E. ATtRACT-a database of RNA-binding proteins and associated motifs. Database: The Journal of Biological Databases and Curation. 2016, (2016).
  22. Paz, I., Kosti, I., Ares, M., Cline, M., Mandel-Gutfreund, Y. RBPmap: a web server for mapping binding sites of RNA-binding proteins. Nucleic Acids Research. 42, Web Server issue 361-367 (2014).
  23. Sundararaman, B., et al. Resources for the Comprehensive Discovery of Functional RNA Elements. Molecular Cell. 61 (6), 903-913 (2016).

Tags

Genetikk RNA fotavtrykk RIPiT RNA-bindende protein RBP RNA: protein komplekser RNP
Identifisering av fotavtrykk av RNA: protein komplekser via RNA-Immunutfelling i tandem etterfulgt av sekvensering (RIPiT-SEQ)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Woodward, L., Gangras, P., Singh, G. … More

Woodward, L., Gangras, P., Singh, G. Identification of Footprints of RNA:Protein Complexes via RNA Immunoprecipitation in Tandem Followed by Sequencing (RIPiT-Seq). J. Vis. Exp. (149), e59913, doi:10.3791/59913 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter