Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Identifikation af fodspor af RNA: protein komplekser via RNA Immunopræcipitation i tandem efterfulgt af sekventering (RIPiT-SEQ)

Published: July 10, 2019 doi: 10.3791/59913
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Molecular Genetics, Center for RNA Biology, The Ohio State University

Summary

Her præsenterer vi en protokol for at berige endogene RNA-bindingssteder eller "fodspor" af RNA: protein (RNP)-komplekser fra pattedyrsceller. Denne fremgangsmåde involverer to immunoprecipitationer af RNP under enheder og er derfor døbt RNA chromatinimmunpræcipitation i tandem (ripit).

Abstract

RNA chromatinimmunpræcipitation i tandem (ripit) er en metode til at berige RNA fodspor af et par proteiner i et RNA: protein (RNP) kompleks. RIPiT anvender to rensningstrin. For det første er immunopræcipitation af en Tagged RNP-underenhed efterfulgt af mild RNase fordøjelse og efterfølgende ikke-Denaturerings affinitet eluering. En anden chromatinimmunpræcipitation af en anden RNP-underenhed giver mulighed for tilsætning af et defineret kompleks. Efter en denaturering af RNAs og proteiner omdannes RNA-fodaftryk til DNA-sekvensering biblioteker med høj gennemløb. I modsætning til de mere populære ultraviolet (UV) binding efterfulgt af chromatinimmunpræcipitation (Clip) tilgang til at berige RBP bindingssteder, ripit er UV-binding uafhængig. Derfor kan RIPiT anvendes til talrige proteiner til stede i RNA interactome og ud over, der er afgørende for RNA-regulering, men ikke direkte kontakte RNA eller UV-crosslink dårligt til RNA. De to rensningstrin i RIPiT giver en yderligere fordel ved at identificere bindingssteder, hvor et protein af interesse optræder i partnerskab med en anden cofactor. Den dobbelte rensningsstrategi tjener også til at forbedre signalet ved at begrænse baggrunden. Her giver vi en trinvis procedure til at udføre RIPiT og generere High-gennemløb sekvensering biblioteker fra isolerede RNA fodspor. Vi skitserer også RIPiT fordele og applikationer og diskutere nogle af sine begrænsninger.

Introduction

I cellerne findes RNA i kompleks med proteiner til dannelse af RNA: protein komplekser (Rnp'er). Rnp'er samles omkring RNA-bindende proteiner (RBPs, dem, der binder RNA direkte), men omfatter også ikke-RBPs (dem, der binder RBPs, men ikke RNA), og er ofte dynamiske i naturen. Rbps og deres cofaktorer fungerer kollektivt inden for rnp'er for at udføre reguleringsfunktioner. For eksempel genkender UPF-proteinerne (UPF1, UPF2 og UPF3b) i den nonsens-medierede mRNA Decay-pathway (NMD) de tidligt afsluttede ribosome. Hver af UPF-proteinerne kan binde sig til RNA, men det er kun, når de samler, at et aktivt NMD-kompleks begynder at danne. Inden for dette kompleks, UPF1 er yderligere aktiveret ved fosforylering af en ikke-RBP SMG1, og en sådan UPF1 aktivering i sidste ende fører til ansættelse af mRNA forfald inducerende faktorer1,2. I dette eksempel kræver RBPs ikke-RBP-cofaktorer til rekruttering og aktivering af RNP-komplekset, der udløser NMD. Endnu en ejendom af Rnp'er er deres kompositoriske heterogenitet. Overvej spliceosome, som findes i særskilte E, A, B eller C komplekser. Forskellige spliceosome komplekser har overlappende og forskellige proteiner3. For at studere RNP funktioner, er det vigtigt at belyse, hvilke RNAs er bundet af en RBP og dens associerede proteiner. Mange metoder findes for at opnå dette, med hver tilgang har sine særskilte fordele og ulemper4,5,6,7.

De meget populære metoder til at identificere RBP bindingssteder-binding efterfulgt af chromatinimmunpræcipitation (Clip) og dens forskellige variationer-stole på ultraviolet (UV) lys til at link en RBP til RNA8. Dette er imidlertid ikke en effektiv fremgangsmåde for ikke-RBPs inden for Rnp'er, som ikke direkte kontakter RNA. Her beskriver vi en alternativ tilgang, der gælder for både RBPs og ikke-RBPs, for at isolere og identificere deres RNA-bindingssteder. Denne fremgangsmåde betegnes RNA immunopræcipitation i tandem (ripit) består af to chromatinimmunpræcipitation trin, som hjælper med at opnå højere specificitet i forhold til en enkelt rensning (figur 1)9,10. Da de enkelte immunopræcipitation (IP) trin kan udføres ved en lavere strenghed i forhold til klip, er ripit ikke afhængig af tilgængeligheden af antistoffer, der kan modstå tilstedeværelsen af stærke rengøringsmidler under chromatinimmunpræcipitation. Den mest unikke fordel ved RIPiT er evnen til at målrette to forskellige proteiner i to rensningstrin; Dette giver en effektiv måde at berige en kompositionelt distinkt RNP kompleks fra andre lignende komplekser11.

Små variationer i RIPiT proceduren kan yderligere forbedre RNP berigelse. For eksempel er nogle RNA-protein eller protein-protein interaktioner inden for Rnp'er forbigående, og det kan være vanskeligt effektivt at rense fodspor af sådanne komplekser. For at stabilisere sådanne interaktioner kan rnp'er være tværbundet i celler med formaldehyd før cellelyse og ripit. For eksempel har vi observeret, at en svag interaktion mellem exon Junction Complex (EJC) Core Factor, EIF4AIII og EJC demontering faktor, PYM12 kan stabiliseres med formaldehyd behandling, således at flere RNA fodspor er beriget (data ikke vist). Før celle høst og RIPiT kan cellerne også behandles med lægemidler for at stabilisere eller berige Rnp'er i en bestemt tilstand. For eksempel, når man studerer proteiner, der fjernes fra mRNA under oversættelsen (f. eks. EJC UPF114), kan behandling med oversættelses hæmmere såsom puromycin, cycloheximide eller harringtonin føre til øget belægning af proteiner på RNAs.

Mængden af RNA genvundet fra RIPiT er normalt lav (0.5-10 pmoles, dvs 10-250 ng RNA overvejer en gennemsnitlig RNA længde på 75 NT). Den primære årsag til dette er, at kun en lille brøkdel af et givet protein er til stede i kompleks med andre proteiner inden for RNPs (enhver "gratis" protein IP'ed i første trin er tabt i løbet af den anden IP). For at generere RNA-SEQ biblioteker fra denne RNA, vi også skitsere her en tilpasning af tidligere offentliggjorte protokol egnet til sådanne lav RNA indgange15,16 (figur 2), som giver høj gennemløb sekvensering klar prøver i 3 Dage.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. etablering af stabile HEK293 cellelinjer udtrykker Tetracycline-inducerbare FLAG-Tagged protein af interesse (POI)

  1. Seed HEK293-celler med et stabilt integreret FLP-rekombinationsmål (FRT) med en densitet på 10 x 104 celler/ml i vækstmedium (dulbecco's modificerede eagle's medium [DMEM] + 10% føtal bovint serum [FBS] + 1% penicillin-streptomycin [Penn/STREP]) i 6- godt tallerkener. Lad cellerne vokse natten over i en befuret inkubator ved 37 °C og 5% CO2 (standard vækstbetingelser for alle efterfølgende trin).
  2. Den næste dag, bør cellerne være ~ 70% konflydende. I henhold til transfektering reagens protokol, transficere FRT site-indeholdende HEK293 celler med en 9:1 forholdet mellem pcDNA5-TetO-flag-POI: pOG44.
    Bemærk: FLAGET tag har sekvens motiv DYKDDDDK (D = aspartinsyre, Y = tyrosin, og K = lysin).
  3. Efter 24 timer begynder valget af antibiotika. Fjern medier og tilsæt frisk vækstmedium suppleret med 100 μg/mL hygromycin. Inden for 72 h, ikke transfected celler bør begynde at dø.
  4. Hver 48-72 h, ændre vækstmedier og supplere med frisk hygromycin.
  5. Efter ~ 2 ugers udvælgelse, diskrete kolonier af stabilt transficeret celler vil begynde at dukke op. Når kolonierne er synlige for det blotte øje, tilsættes 1 mL trypsin til pladen, og der inkubates i 5 min ved 37 °C. Resuspension celler i DMEM, overføre celler til en ny 10 cm plade, og justere volumen til 10 mL frisk vækstmedium suppleret med 100 μg/mL hygromycin. Lad pladen nå op på ~ 80% konfluency for yderligere at udvide cellerne for at forberede permanente lagre.
  6. Bestem mængden af tetracyclin (tet), der kræves for at opnå det optimale niveau af FLAG-POI-udtryk for eksperimentet. Vokse celler i 12-Well format og foretage en titrering af tet mellem 0-1000 ng/mL interval for 16-24 h. Udfør vestlige blots på titrerings prøverne med antistof mod POI.
    Bemærk: For proteiner op til ~ 60 kDa, den FLAG-mærkede og den endogene kopi af proteinet kan løses på natriumdodecyl sulfat-polyacrylamid gel elektroforese (SDS-side) at sammenligne ekspression niveauer af FLAG-POI til sin endogene modstykke. For større proteiner kan signal intensiteten i tet-inducerede prøver sammenlignes med uinduceret prøve. Den tetracyclin stamopløsning kan tilberedes ved 1 mg/mL i 100% ethanol. Fortyndinger af bestanden for cellekultur arbejde skal være i sterilt vand eller fosfat-bufferet saltopløsning (PBS). Tetracyclin bestand skal tilberedes frisk en gang hver måned.

2. culturing celler for tetracyclin induktion og RIPiT procedure

  1. Seed stabilt integreret FLAG-POI HEK293 ved en tæthed på 3 x 105 celler/ml i vækstmedium i 15 cm plader. Lad cellerne vokse ved 37 °C og 5% CO2.
    Bemærk: Generelt vil tre til 5 15 cm plader give ~ 2-20 pmol af RNA fodspor afhængigt af den overflod af RNP af interesse. Hvis rnp'er vil være formaldehyd tværbundet og renset under strenge betingelser, så dobbelt så meget input kan være påkrævet.
  2. Tilsæt tetracyclin til forudbestemt optimal koncentration til mediet for at fremkalde et udtryk for flaget-POI (Se trin 1,6) 16-24 h, før cellerne vil blive høstet.
    Bemærk: Det er ikke nødvendigt at ændre vækstmediet. Celler skal være klar til at høste omkring 72 h efter såning eller når pladerne er ~ 80% confluent. Det er vigtigt at undgå, at cellerne bliver flydende.

3. celle høst, formaldehyd behandling og Cellelyse

  1. Enkeltlags cellerne vaskes forsigtigt med 15 ml kølet PBS for hver 15 cm plade. Derefter skrabe cellerne i 30 mL PBS. Hvis cellerne blev behandlet med lægemidler før høst, supplere PBS med stoffet. Saml alle celler i 50 mL konisk rør.
    Bemærk: For at bevare svage interaktioner kan cellerne krydses med formaldehyd: Tilsæt formaldehyd til cellesuspensionen fra trin 3,1 til en endelig koncentration på 0,1% og Inkuber på en rocker ved stuetemperatur i 10 min. Tilsæt 3 mL dæmpnings buffer (tabel 1 ) og rock i yderligere 5 minutter.
  2. Pellet celler ved 400 x g i 10 minutter ved 4 °c og kassér supernatanten.
  3. Lyse celler i 4 mL iskold hypotonisk lyse buffer (HLB; Tabel 1). Brug en P1000-pipette til at gensuspendere cellerne. Overfør til et 5 mL rør og Inkuber lysat på is i 10 min.
  4. Placer lysatet i et isbad og soniker ved 10% amplitude i 30 s med 1 s pulser med 2 s pauser. Juster derefter saltkoncentrationen til 150 mM ved at tilføje 108 μL af 5 M NaCl.
    Bemærk: Formaldehyd tværbundet prøver kan underkastes strengere lyse og oprensning ved at medtage 0,1% hver af SDS og natriumdeoxycholat i lyse bufferen.
  5. Fjern lysningen ved at centrifugeres ved 21.000 x g i 10 minutter ved 4 °c. Der opsamles 20 μL supernatanten (celle ekstrakt) i et mærket rør til Western blot analyse af protein niveauerne i input (Se figur 3a).
    Bemærk: Mens lysat er i centrifuge, kan flag agerede perler vaskes (Se trin 4,1). FLAG agopstået perler skal forvasket 3 x i 4 mL iskold isotonisk vaskebuffer (IsoWB, tabel 1).

4. Marker Immunopræcipitation

  1. Anvend den resterende supernatanten fra trin 3,5 til 750 μL forvasket FLAG agerede perler i et 5 mL rør (seng volumen af vasket FLAG agerede perler vil være 375 μL). Incubate FLAG agopstået perler og celle ekstrakt for 1-3 h ved 4 °C med blid blanding.
    Bemærk: Denne mængde FLAG agopstået perler bør være tilstrækkelig til en bred vifte af proteiner, men kan optimeres, hvis det er nødvendigt.
  2. Pellet FLAG agopstået perler ved centrifugering ved 400 x g i 1 min ved 4 °c. Saml 20 μL af supernatanten i et mærket rør til Western blot analyse af protein niveauer i depleteret celle ekstrakt (Se figur 3a). Kassér den resterende supernatant.
  3. For at vaske flaget agopstået perler tilsættes 4 mL IsoWB og resuspension. Pellet perler ved 400 x g i 1 min ved 4 °c. Fjern forsigtigt supernatanten. Gentag 4X.
    Bemærk: Til strenge skyller af formaldehyd tværbundet IPS, kan 0,1% hver af SDS og natriumdeoxycholate inkluderes i vaskebufferen for de første to vaske trin.

5. RNase I fordøjelse

  1. Fortyndet RNase i til 0,002-0,01 enheder/mL i 750 μL IsoWB (den passende koncentration for de ønskede fodaftryk skal bestemmes empirisk). Tilsæt IsoWB-RNase I til vasket FLAG agopstået perler og Inkuber med blid blanding ved 4 °C i 10 min.
  2. Pellet perler ved 400 x g i 1 min ved 4 °c. Saml 20 μL supernatanten (RNase i elution) i et mærket rør til Western blot-analyse. Kassér IsoWB-RNase I og vask FLAG agopstået perler 4X med IsoWB som beskrevet i trin 4,3.

6. affinitet

  1. Forbered en bestand af elueringsbuffer (FLAG peptid ved 250 ng/mL i IsoWB). Påfør 375 μL elueringsbuffer til FLAG agantet perler og Ryst forsigtigt ved 4 °C for 1-2 h. pellet FLAG agopstået perler og indsamle en 15 μL alikvot af eluering for Western blot af proteiner i FLAG IP (Se figur 3a).
    Bemærk: Når affinitets Elueringen er i gang, kan afsnit 7 udføres.

7. magnetisk perle-antistof konjugering

  1. Vask 50 μL magnetiske perler (dvs. Dynabeads; Tabel over materialer) 3x i 1 mL IsoWB i 1,5 mL rør. Resuspension af magnetiske perler i 100 μL konjugering buffer. Tilsæt passende mængde af antistof (præcis mængde antistof til brug for IP skal empirisk bestemmes for hvert antistof).
    Bemærk: Protein en magnetisk perler er optimale for antistoffer produceret i kanin hvorimod protein G magnetiske perler er mere passende for mus antistoffer. Magnetiske perler kompatibilitets diagram er tilgængelig på leverandørens hjemmeside til at vælge perler passende for hvert antistof.
  2. Vask magnetiske perler 2x i konjugering buffer (tabel 1). Inkuber blandingen ved stuetemperatur i mindst 10 min. resuspension af magnetiske perler i 375 μL RIPiT fortyndingsbuffer. Opbevares på is indtil næste trin.

8. anden Immunopræcipitation

  1. Anvend resterende flag affinitet eluering fra trin 6,1 til magnetiske perler koblet til antistoffer mod det protein af interesse. Inkuber med blid blanding ved 4 °C i 1-2 h. Fang magnetiske perler på en magnet og saml 15 μL supernatanten til analyse af ubundne proteiner via Western blot. Vask magnetiske perler 7x med 1 mL IsoWB.

9. denaturering

  1. Der tilsættes 100 μL klar prøve buffer (tabel 1) til magnetiske perler og resuspenderes med en P200-pipette. Inkuber på is i 10 min. svip forsigtigt for at resuspendere perlerne med jævne mellemrum.
  2. Indfang magnetiske perler på en magnet og saml 15 μL eluering til analyse af proteiner i RIPiT-eluering via Western blot (Se figur 3a). Overfør den resterende eluering til et nyt mærket 1,5 mL rør.
    Bemærk: Hvis prøverne blev sammenkædet med formaldehyd, skal prøverne inkuberet ved 65 °C i 1 time for at vende tværbindingen.
  3. Udfør Western blots på prøver indsamlet på forskellige trin (input, FLAG IP udtømning, FLAG IP, anden IP udtømning, anden IP eluering). Blottet med antistoffer mod de to lokkemad proteiner, deres andre eksterne hvis kendt, og mindst én ikke-interagerende RBP som en negativ kontrol (figur 3a).

10. RNA ekstraktion og ende hærdning

  1. Til RIPiT-eluering tilsættes 320 μL RNase-fri ddH2O, 400 μl phenol-chloroform isoamylalkohol (PCIAA, pH 4,5) og vortex i 30 s og spinne ved stuetemperatur ved 12.000 x g i 5 min. Saml 350 μl vandig fase i et separat rør. Tilsæt 35 μL 3 M natriumacetat, 1 μL 1 M MgCl2, 10 μg glykogen og 1 ml 100% ethanol. Inkuber natten over ved-20 °C.
  2. Til pellet RNA centrifugeres ved 12.000 x g i 30 minutter ved 4 °c. Vask RNA i 70% ethanol.
  3. For at fjerne 3 ' phosphat venstre på RNA efter RNase i spaltning, resuspension RNA pellet i 17 μL RNase-fri ddH2O, og tilsæt 2 μl 10X T4 polynucleotid kinase (pnk) buffer (tabel over materialer) og 1 ΜL af T4 pnk. Inkuber ved 37 °C i 30 minutter.
    Bemærk: Den 3 ' fosfataseaktivitet af T4 PNK har optimal aktivitet ved pH 617. PNK-reaktions bufferen er optimeret til 5 ' kinaseaktiviteten af T4 PNK og har en pH-værdi på 7,6. Mens det er forsøgt at justere pH i den endelige hærdnings reaktion, kan dette trin optimeres yderligere.
  4. Tilsæt 380 μL RNase-fri ddH2O og 400 ΜL PCIAA pH 4,5 til røret. Vortex til 30 s, centrifuge ved 12.000 x g i 5 min. Saml vandig fase og tilsæt 35 μl af 3 M natriumacetat, 1 μl af 1 M mgcl2, 10 μg glykogen og 1 ml 100% ethanol.
  5. Inkuber natten over ved-20 °C. Pellet og vask RNA med 70% ethanol som ovenfor. Resuspension af RNA i 4,5 μL RNase-frit vand.

11. vurdering af RNA-fodaftryk størrelse og tæthed

  1. En vellykket RIPiT forventes at give 1 pmol eller flere af RNA-fragmenter. For at kvantificere det faktiske udbytte, overføres 0,7 μL RIPiT RNA (~ 1/6 af det samlede udbytte) til et nyt rør. Tilsæt 2 μL 10x T4 PNK buffer, 1 μL 1 mM ATP, 40 μCi γ32P-ATP (0,5 − 1,0 μl af bestanden) og 1 ΜL T4 pnk. Justér lydstyrken til 10 μL, og Inkuber ved 37 °C i 30 minutter.
    1. I parallelle PNK-reaktioner skal du mærke en DNA-stige med lav rækkevidde og 0,1 pmol af et syntetisk RNA-eller DNA-oligo (20-40 NT) for at anvende en størrelses-og kvantitets standard.
  2. Løs mærket RNA/DNA på 26% urea-side gel (20 x 27 x 0,45 mm3). Gel skal pre-Run i 30 min ved 35 w. Skyl brønde før pre-Run og før lastning prøver og køre på 35 W indtil bromphenolblåt blå farvestof front har næsten nået enden af gelen.
  3. Fjern forsigtigt gel fra glasplader på et stykke 8 x 11 tommer filtrerpapir. Med gel på toppen af papiret, Placer i gel tørring apparater og dække med et stykke plast wrap. Tør gel ved 80 °C i 1 time med vakuum.
  4. Udsæt tørret gel til en phosphoscreen natten over, eller indtil der opdages et tilstrækkeligt signal. Billede fosfoscreen. God kvalitet RNA fra en ripit bør fremstå som en smøre i Lane, med minimal fremtrædende bands (figur 3B). At kvantificere RNA, sammenligne signalintensitet af den ønskede størrelse RNA fragmenter i RIPiT Lane til signalet fra 0,1 pmol af mærket syntetisk oligo.
    Bemærk: Alternativt kan RNA-fodaftryk størrelse og mængder verificeres ved hjælp af en højfølsom bioanalysator (figur 3C).

12. adapter-ligation

  1. Forbered RIPiT RNA, således at mindst 3 pmol af RNA opløses i 3,8 μL vand.
  2. I en 0,2 mL polymerasekæde reaktion (PCR) tube, kombinere 3,8 μL af RNA, 1 μL af miR-CAT-33 præ-adenyleret adapter (7 μM) (tabel over materialer). Bland blandingen på en termisk variator ved 65 °c i 10 min, 16 °c i 5 min, og hold derefter ved 4 °c.
    Bemærk: Den præ-adenylated linker kan enten bestilles fra oligo syntese service, eller en brugerdefineret unadenylated DNA oligo fra enhver oligo syntese tjeneste kan adenylated ved hjælp af mth RNA ubiquitinligase (tabel over materialer) og gel renset.
  3. Til samme slange tilsættes 1,5 μl 10x T4 RNA-ligasebuffer, 7,5 μl 50% polyethylenglycol 8000 (peg-8000), 0,75 μl af 20 mm ditiotreitol (DTT) og 0,45 μl T4 RNL2 tr. K227Q (tabel over materialer).
    Bemærk: 50% PEG-8000 kommer med RNA-ubiquitinligase og buffer købt. PEG-8000-opløsninger er viskøse og skal pipetteres langsomt.
  4. Incubate reaktion i den termiske variator ved 30 °c i 6 timer, varme inaktivere ubiquitinligase ved 65 °c i 10 min, derefter holde ved 4 °c.

13. omvendt transskription

  1. Til røret med ligations blandingen fra trin 12,4 tilsættes 11,25 μL 4X deoxynucleotidtrifosfat (dNTP) mix, som indeholder en blanding af regelmæssige og biotinylerede dNTP'er (Se tabel 1), 1,0 μl af 10 μM rt primere (tabel over materialer) og 6,8 μl af RNase-frit vand. Inkuber ved 65 °C i 5 minutter, og hold derefter ved 4 °C.
  2. Overfør rør til is og tilsæt 9,0 μL af 5x First-streng (FS) buffer uden MgCl2 (tabel 1), 2,25 ΜL af 100 mM DTT, 1,2 μl revers transkriptase-enzym til et endeligt volumen på 45 ΜL (tabel over materialer).
  3. Inkuber i en termisk variator ved 55 °c i 30-60 min. varme inaktivere revers transkriptase ved 70 °c i 15 min og hold prøven ved 4 °c.

14. rensning af RT-produkt

  1. Tilsæt 45 μL 2x urea-belastnings buffer (tabel 1) til rt-reaktion. 1 μg af en DNA-stige med lav rækkevidde fortyndes i 45 μL og tilsættes 45 μL 2x urea-belastnings buffer.
  2. Forbered 10% Urea-side gel (20 x 28 x 0,15 cm3; Tabel 1) med 8-brønd kam. Ved hjælp af en sprøjte eller et pipet skylles brønde med 0,5 x Tris/borate/EDTA (TBE) buffer.
    Bemærk: De hjemmelavede geler giver bedre opløsning i at adskille det udvidede rt-produkt fra den ufortyndet rt primer. Alternativt kan præ-støbte urea-side geler også anvendes (tabel over materialer). Som præ-støbte geler tillader mindre maksimale mængder pr brønd, så prøverne skal opdeles i flere brønde. Præ-støbte geler skal køres ved 150 − 200 V.
  3. Pre-Run gel på 35 w i 30 min. Skyl brønde igen, indlæse prøver og køre gel på 35 W indtil bromphenolblåt blå farvestof front er migreret til omkring 1 tommer fra enden af gelen.
    Bemærk: Brug metal kølelegemet under præ-Run og den endelige kørsel for at forhindre gel overophedning.
  4. Plette gelen i 5 min i 1x guld nukleinsyre gel bejdsning opløsning tilberedt i 0,5 x TBE. Dette farvestof er lysfølsomt, så undgå lys eksponering.
  5. Billed gel på fluorescerende scanner til dokumentationsformål ved hjælp af 520 nm excitation og 580 nm emissions filtre. Hvis en fluorescerende scanner ikke er tilgængelig, skal du bruge en blå lys-transilluminator. RT-produktet skal fremstå som en smøre, der starter over den ikke-udvidede rt-primer (figur 4).
    Bemærk: Selv om guld nukleinsyre gel farvning farvestof er let visualiseret på en gel doc med UV-lyskilde, det er afgørende at ikke udsætte den værdifulde RT produkt til UV for at forhindre skader.
  6. Visualiser gelen på et blåt lys transilluminator, og afpunkt RT-produktet fra gelen. Det anbefales at skære DNA med forlængelser, der spænder fra 30-200 NT (figur 4). Placer de exciserede gel stykker på en ren overflade og hakde skive i små stykker for at øge overfladearealet. Overføres forsigtigt til et 1,5 mL rør og tilsættes 800 μL DNA-elueringsbuffer (tabel 1).
  7. Inkuber gel-stykkerne med blid blanding med DNA-elueringsbuffer i løbet af natten ved stuetemperatur.
  8. Adskil elueringsbufferen fra gelen ved at passere gyllen gennem en filterkolonne for celluloseacetat (tabel over materialer) anbragt i et 2 ml opsamlings glas.
  9. I 1,5 mL rør vaskes 10 μL streptavidin magnetiske perler med 500 μL streptavidin perle vaskebuffer (tabel 1). Gentag for tre totale skyller. Lad ikke perler tørre ud. Resuspension af perler i 10 μL DNA-elueringsbuffer (tabel 1).
  10. Elueringsbufferen, der er adskilt fra gel stykkerne i trin 14,8, overføres til røret med de vaskede streptavidin magnetiske perler.
  11. Inkuber med blid blanding i mindst 8 timer ved stuetemperatur. Tag perler på en magnet, Fjern supernatanten og resuspender magnetiske perler i 10 μL RNase-frit vand og Overfør til et 0,2 mL PCR-rør.

15. cirkularisering af RT-produkt

  1. RT produkter fanget på streptavidin perler er cirkulariseret mens bundet på perler. Til den magnetiske perle gylle tilsættes 2,0 μL 10x cirkulariserings reaktionsbuffer, 1,0 μL 1 mM ATP, 1,0 μL 50 mM MnCl2, 4,0 μl 5 M betain, 1,0 μl ssdna-ubiquitinligase i (tabel over materialer) og 1,0 μl RNase-frit vand.
  2. Inkubatations reaktionen på en termisk variator ved 60 °c i 4 timer. varme inaktivere ssdna ubiquitinligase i ved opvarmning ved 80 °c i 10 min derefter holde ved 4 °c.

16. test PCR

  1. Før du fortsætter til en storstilet PCR, skal du bruge en del af cirkulariseret produkt til at bestemme det ideelle antal forstærknings cyklusser for hver prøve. Dette trin hjælper med at forhindre over forstærkning og begrænse PCR-artefakter, da PCR-reaktions komponenter bliver begrænsende ved højere PCR-cyklusser.
  2. Forbered en 45 μL PCR-reaktion med 4,0-6,0 μL af cirkulariseret produkt fra trin 15,2, 9,0 μL af 5x reaktionsbuffer, 0,9 μL 10 M dNTPs, 2,25 μL af 10 μM PE 1.0 primer (tabel over materialer), 2,25 μl af 10 μm PE 2.0 primer (tabel over materialer) , og 0,045 μL high-fidelity DNA Polymerase (tabel over materialer) og vand.
  3. Bland reaktionen godt og opdelt i 3 15 μL reaktioner. Hver af disse tre reaktioner vil være underlagt et variabelt antal PCR-cyklusser. Det ideelle antal cyklusser forventes at være mellem 7 og 14. Så udføre test PCRs for 8, 11, og 14 cyklusser.
  4. Brug følgende PCR-betingelser: 98 °C-30 s; 98 °C-5 s; 65 °C-10 s; 72 °C-15 s; 72 °C-2 min; 12 °C-hold.
  5. Tilsæt 3 μL 6x gel loading Dye og løs på 10% Native side gel indtil blå farvestof front har migreret 3/4 af gelen. Plette gelen ved hjælp af guld nukleinsyre gel plet og billede som i trin 14,4 og 14,5 (figur 5).
  6. Hvis du vil vælge det ideelle antal PCR-cyklusser, skal du sammenligne PCR-produkter fra et stigende antal cyklusser. Vælg det cyklus nummer, der giver den største mængde af produktet af den forventede størrelse uden overamplifikationsartefakter (f. eks. DNA-smøre meget større end forventet produkt, og hvor der ikke ses nogen mærkbar nedbrydning af PE 1.0-og PE 2.0-primere (Se rød pil i Figur 5).

17. storstilet PCR

  1. Forbered en 45 μL PCR-reaktion, som i trin 16,2, og Gentag PCR. Løs PCR på 10% Native PAGE på 150 V, plet med 1x guld nukleinsyre gel bejdser og billede på en blå lys transilluminator.
  2. PCR-produktet fra gelen og overføres til en 3 mL sprøjte. Brug sprøjten til at knuse gelen og Extrude i et 1,5 mL rør.
    Bemærk: Det uudvidede RT-produkt ved cirkularisering giver PCR-produkt på 151 BP. Således, på dette trin man skal størrelse vælge produkter, der er større end 151 BP (figur 6).
  3. Tilsæt 900 μL DNA-elueringsbuffer og Inkuber ved stuetemperatur natten over med blid blanding.
  4. Gelopslæmning overføres til en celluloseacetat filterkolonne anbragt i et 2 mL opsamlings glas. Spin ved 12.000 x g i 3 minutter, og opsamler supernatanten i et friskt rør.
  5. Tilsæt yderligere 400 μL DNA-elueringsbuffer til den knuste gel, og overfør det til et 1,5 mL rør. Der inkubates med blid blanding i yderligere 4 timer til en anden eluering.
  6. Pool alle elutioner og opdeles i 3 rør med 400 μL hver. Udfældningen af DNA ved tilsætning af 1 mL 100% ethanol og 10 μg glykogen. Vortex og Inkuber mindst 2 h ved-20 °C.
  7. Pellet DNA ved 12.000 x g i 30 min ved 4 °c. Vask DNA-piller med 70% ethanol.
  8. Fjern forsigtigt al ethanol ved pipettering, og gensuspender hurtigt DNA-pellet i 20 μL vand.
    Bemærk: På nuværende tidspunkt er det vigtigt ikke at lade DNA-pellet blive tørt, da tørring af DNA kan være den.
  9. Brug en lille del af DNA-prøven til at bestemme størrelsen og koncentrationen af PCR-produktet via fluorometer og Højfølsom DNA-bioanalysator. Prøver kan nu indsendes til sekvensering på en af platformene.
  10. De sekvenserede læsninger kan behandles (f. eks. adapter fjernelse, trimning for at holde sekvenser > 30 phred score), justeret til reference genomet, og visualiseret på en browser som UCSC genom browser (figur 7).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

En vellykket ripit vil resultere i chromatinimmunpræcipitation af både proteiner af interesse og andre kendte interagerende proteiner, og fraværet af ikke-interagerende proteiner. Som det ses i figur 3A, blev både magoh og EIF4AIII påvist i ripit ELUERING, men HNRNPA1 var ikke (Lane 6). Parallelt, RNA fodspor, der har Co-renset med RNP komplekser blev detekteret via autoradiography (figur 3B) eller bibilioteker (figur 3C). Puromycin behandling forventes at øge EJC belægning på RNA, og et stærkere RNA-fodaftryk signal blev observeret i puromycin behandlet RIPiT i figur 3B (Sammenlign Lanes 2 og 3). Generering af prøver til dyb sekvensering kræver ligating af en adapter til RNA, og derefter vendes transskribering af RNA til DNA ved hjælp af en primer, der annealer til adapter sekvensen. Det omvendte transskription trin inkorporerer biotinylerede nukleotider, til rensning af reverse transkriptionsprodukt. Efter den omvendte transskription skal produktet adskilles fra den ikke-udvidede adapter med urea-side (figur 4). Det omvendte transskription produkt er derefter cirkulariseret og PCR amplificeret. Det relevante antal PCR-cyklusser må ikke over forstærke det cirkulariserede produkt. Over amplifikation vil resultere i primer depletering og afvigende PCR produkt (Se figur 5, Lane 4). Antallet af cyklusser med den største forstærkning uden tegn på over amplifikation er mest hensigtsmæssigt at bruge til en storstilet PCR (figur 5 Lane 3 og figur 6).

Figure 1
Figur 1 : Skematisk skitserer de vigtigste trin i RIPiT. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3

Figur 2 : Skematisk afbildning af arbejdsprocessen til konvertering af RIPiT RNA til biblioteker for sekvensering med høj gennemløb. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2

Figur 3 : Estimering af RNA og protein udbytter fra RIPiT. (A) Western blot af proteinerne renset fra hvert større trin i ripit proceduren. (B) autoradiograph billede af RNA fodspor fra et flag-magoh: EIF4AIII ripit sammenligne puromycin behandlede og ubehandlede celler. Rød boks angiver den RNA-fodaftryk størrelse, der i sidste ende vil blive konverteret til sekvensering biblioteker. (C) profil af RNA elueret fra ripit som i Lane 2 i panel B, når visualiseret ved hjælp af en bioanalysator. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4 : Reverse transkription (RT) produkt løst på en 10% Urea-side gel og plettet med guld nukleinsyre gel bejdset. Rød boks indikerer, at gel-området er skåret til gel rensning af Extended RT-produkter. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5 : Test PCR løst på 8% ikke-DENATURERINGS side. Bemærk de afvigende store PCR-produkter, som vises ved 14 cyklusser (rød boks) og den parallelle udtømning af primere (rød pil), der indikerer over amplifikation. Til denne prøve blev 11 cyklusser valgt til storstilet PCR (Blue Box). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6 : Storstilet PCR løst på 8% ikke-DENATURERINGS side. Rød boks indikerer gelstykket, som er skåret til gel rensning. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 7
Figur 7 : Genome browser screenshot af MAPK1 genet, der viser fordelingen af flag-MAGOH: EIF4AIII fodspor som repræsentative resultater fra en RIPiT. Røde pile angiver de forventede kanoniske EJC-bindingssteder. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Pbs 137 mM NaCl
2,7 mM KCl
10 mM na2HPO4· 7h2O
KH2po4
pH 7,4
Quenching buffer 2,5 M Glycin
2,5 mM Tris-base
Hypotonisk lyse buffer (HLB) 20 mM Tris-HCl pH 7,5
15 mM NaCl
10 mM EDTA
0,5% IGEPAL
0,1% Triton-X-100
1x Aprotinin *
1x Leupeptin *
1x Pepstatin *
1 mM PMSF (phenylmethylsulfonylfluorid) *		 * skal tilsættes frisk hver gang
Isotonisk vaske buffer (IsoWB) 20 mM Tris-HCl pH 7,5
150 mM NaCl
0,1% IGEPAL
Konjugering buffer 0,02% Polysorbat-20
1x PBS
Ryd eksempel buffer 100 mM Tris-HCl pH 6,8
4% SDS
10 mM EDTA
4xdNTPmix 0,25 mM dGTP
0,25 mM dTTP
0,175 mM dATP
0,1625 mM dCTP
0,075 mM biotin-dATP
0,0875 mM biotin-dCTP
5x første-streng buffer m/o MgCl2 250 mM Tris-HCl pH 8
375 mM KCl
RIPiT fortyndingsbuffer (1 mL) 1 mL IsoWB
5 μL 200x BSA
20 μL 10% Triton-X-100
20 μL 0,5 M EDTA
1x Aprotinin *
1x Leupeptin *
1x Pepstatin *
1 mM PMSF *		 * skal tilsættes frisk hver gang
2x Denaturerings belastnings buffer 3 mL 5x TBE
1,8 g Ficoll type 400
6,3 g urinstof
3 mg bromphenolblåt blåt
3 mg xylen cyanol
Justér lydstyrken til 15 mL ddH2O		 For at komme ind i opløsningen anbringes røret i vand i et bægerglas og koges på kogepladen i 10 – 15 minutter. Tilsæt farvestoffer efter justering af lydstyrken til 15 mL
Urea-side gel 6 M urinstof
Acrylamid: bisacrylamid (40% [w/v]) til passende procentdel
0,5 x TBE
0,01% TEMED
DNA-Elueringsbuffer 300 mM NaCl
1 mM EDTA
Streptavidin perle vask buffer 0,5 M NaOH
20 mM Tris-HCl pH 7,5
1 mM EDTA

Tabel 1: buffere.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi diskuterer her nogle vigtige overvejelser for at kunne udføre RIPiT. De enkelte IP'er skal først og fremmest optimeres for at opnå størst mulig effektivitet ved hvert trin. Mængden af FLAG agopstået perler for input antallet af celler, der er beskrevet her, har vist sig at være robust for en bred vifte af proteiner, vi har testet. Da kun en lille brøkdel af partner proteiner er co-immunoprecipiteret med FLAG proteinet, er den mængde antistof, der er nødvendig for effektiv anden IP, sædvanligvis lav (mindre end 10 μg). Lille ripit (fra 1 10 cm plade) efterfulgt af Western blot verifikation af proteiner i hver fraktion under de to chromatinimmunpræcipitation trin viser sig yderst nyttigt at vurdere effektiviteten og specificitet af proceduren før opskalering. Både målrettede proteiner og andre forventede interagerende proteiner i komplekset bør påvises i elueringsprocessen. Det er også gavnligt at assay for proteiner i de nedfiskede lysater (ubundet til flaget-agopstået eller magnetiske perler) til at have et godt skøn over chromatinimmunpræcipitation effektivitet og procentdelen af proteiner samles i et kompleks. Endvidere oplyser denne analyse også, om Rnasefordøjelsesforholdene er tilstrækkelige til at adskille RNA-afhængige interaktioner fra RNA-uafhængige interaktioner inden for en RNP. Derfor er det lige så vigtigt at inkludere en negativ kontrol, ideelt set en RBP uden forbindelse med RNP af interesse. I figur 3Aer HNRNPA1 for eksempel til stede i input, men detekteres ikke i ripit-Elueringen. HNRNPA1 er en RBP, der ikke direkte interagerer med EJC, men interagerer indirekte med EJC, når EJC og HNRNPA1 er bundet til det samme RNA-molekyle. Påvisning af det negative kontrol protein i elueringsopløsningen indikerer enten dårlig RIPiT specificitet eller utilstrækkelig RNA footprinting. I et sådant tilfælde vil de opnåede RNA-fodspor ikke helt afspejle fodaftryk af det pågældende protein. Fodaftryk af Str. 50-200 NT anbefales til senere RNA-SEQ. varigheden af RNase I-behandlingen, eller mængden af enzym, der anvendes, kan optimeres for at opnå den ønskede størrelse fodspor. Bemærk, at det bedste scenarie vil være at opnå et godt signal i det ønskede størrelsesområde, og det er uundgåeligt at have længere og kortere RNAs selv under de mest optimale forhold. RIPiT kan også bruges til at opnå bindende sites af en enkelt RBP. I et sådant tilfælde kan det samme protein være immunoprecipiteret med to forskellige antistoffer, først ved hjælp af et antistof mod en affinitet tag og derefter med antistoffer mod selve proteinet18. Endelig kan en negativ kontrol RIPiT udføres parallelt fra celler, der udtrykker et FLAG-mærkede kontrol protein (f. eks. grønt fluorescerende protein) i kombination med antistof mod et protein mod et ikke-forretningsmæssigt forbundet protein i anden IP.

På trods af sine mange fordele, er det vigtigt at overveje nogle begrænsninger af RIPiT tilgang, og mulige retsmidler. Kravet om affinitet eluering efter den første rensning nødvendiggør den biologiske kilde til at udtrykke et kodet protein. Hvis et sted specifikt rekombinationsystem ikke er tilgængeligt i celle linjen eller organismen af interesse, kan en kort affinitets kode som et FLAG-tag (8 aminosyrer) introduceres ved det endogene gen locus ved hjælp af CRISPR/CAS-baseret genomredigerings metode19. Flaget tag er en ideel epitop for denne tilgang, fordi flaget antistof er velegnet til affinitet eluering og kan modstå høje Ioniske styrker og milde Denaturerings betingelser, der kan anvendes i kombination med formaldehyd crosslinking. En anden begrænsning af RIPiT tilgang er kravet om et stort input af cellulære materiale. Dette kan i et vist omfang være uundgåeligt, da kun en lille procentdel af et RBP sandsynligvis interagerer med andre proteiner i RNP. Stadig forbedrede bibliotek forberedelse tilgange kan bidrage til at nedbringe den store input krav. Mulige ideer til yderligere strømlining af disse trin omfatter udførelse af RNA 3 '-end-dephosphorylering og adapter-ligering på de magnetiske perler umiddelbart efter anden IP-skylning og forud for den endelige elueringsgrad af RNP. En sådan fremgangsmåde gennemføres med succes i de nuværende klip-SEQ-procedurer og i en nyligt beskrevet variation af RIPiT20. Sådanne ændringer vil også fjerne flere tidskrævende RNA-rensningstrin fra de tidlige faser af Biblioteks forberedelses proceduren. Yderligere, i modsætning til Clip, som giver en nukleotid niveau opløsning af binding site af en RBP på RNA, opløsning af ripit fodspor vil forblive på niveauet af titusinder af nukleotider. Endelig, som Rnp'er kan omfatte flere RBPs, RIPiT beriget RNA sites omfatter en blanding af bindingssteder af mange RBPs. Da konsensus sekvenser, der er bundet af individuelle rbps, bliver afsløret i et hastigt stigende tempo og nu er umiddelbart tilgængelige21,22,23, kan disse oplysninger udnyttes til at devolve sortimentet af RBP-lokaliteter beriget med RIPiT-udgange. Uanset disse udfordringer er RIPiT-SEQ en effektiv procedure for optagelse af RNA-fodspor af dynamiske, heterogene og endda forbigående RNP-komplekser, som kan give unik indsigt i de indre funktioner i RNA-machineries, der styrer cellulære Funktion.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af NIH Grant GM120209 (GS). Forfatterne takker OSUCCC Genomics delte ressourcer kerne for deres tjenester (CCC støtte Grant NIC P30 CA16058).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-FLAG Affinity Gel Sigma A2220
ATP, [γ-32P]- 3,000 Ci/mmol 10 mCi/mL EasyTide, 250 µCi PerkinElmer BLU502A250UC
BD Disposable Syringes with Luer-Lok Tips (200) Fisher 14-823-435
Betaine 5M Sigma B0300
biotin-dATP TriLink N-5002
biotin-dCTP Perkin Elmer NEL540001EA
Branson Sonifier, Model SSE-1 Branson
CircLigase I VWR 76081-606 ssDNA ligase I
DMEM, High Glucose ThermoFisher 11995-065
DNA load buffer NEB NEB
Dynabeads Protein A LifeTech 10002D
Flp-In-T-REx 293 Cell Line ThermoFisher R78007
GeneRuler Low Range DNA Ladder ThermoScientific FERSM1203
Hygromycin B ThermoFisher 10687010
Mini-PROTEAN TBE Gel 10 well Bio-Rad 4565013
Mini-PROTEAN TBE-Urea Gel Bio-Rad 4566033
miRCAT-33 adapter 5′-TGGAATTCTCGGGTGCCAAGGddC-3′ Any this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform
Mirus transIT-X2 transfection reagent Mirus MIR 6004
Mth RNA ligase NEB E2610S
PE1.0 5′-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACT
CTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC*T-3′		 Any this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform
PE2.0 5′-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGGTCTC
GGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATC*T-3′		 Any this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform
Phenol/Chloroform/Isoamyl Alcohol (25:24:1, pH 6.7, 100 mLl) Fisher BP1752I-100
Purple Gel Loading Dye (6x) NEB NEB #7025
Q5 DNA Polymerase NEB M0491S/L
RNase I, E. coli, 1,000 U Eppicenter N6901K
SPIN-X column Corning CLS8160-24EA
Streptavidin beads ThermoFisher 60210
Superscript III (SSIII) ThermoScientific 18080044 reverse transcriptase enzyme
SybrGold ThermoFisher S11494 gold nucleic acid gel stain
T4 Polynucleotide Kinase-2500U NEB M0201L
T4RNL2 Tr. K227Q NEB M0351S
Tetracycline Sigma 87128
Thermostable 5´ App DNA/RNA Ligase NEB M0319S
TruSeq_SE1 5′-pGGCACTANNNNNAGATCGGAAGA
GCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTC
TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′		 Any this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform
TruSeq_SE10 5′-pGGTGTTCNNNNNAGATCGGAAG
AGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCT
CTTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′		 Any this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform
TruSeq_SE11 5′-pGGTAAGTNNNNNAGATCGGAA
GAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTC
TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′		 Any this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform
TruSeq_SE12 5′-pGGAGATGNNNNNAGATCGGAAGA
GCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTC
TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′		 Any this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform
TruSeq_SE2 5′-pGGGTAGCNNNNNAGATCGGAAGAG
CGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCT
CTTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′		 Any this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform
TruSeq_SE35′-pGGTCGATNNNNNAGATCGGAAG
AGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCT
CTTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′		 Any this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform
TruSeq_SE4 5′-pGGCCTCGNNNNNAGATCGGAAGA
GCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTC
TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′		 Any this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform
TruSeq_SE5 5′-pGGTGACANNNNNAGATCGGAAGA
GCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTC
TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′		 Any this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform
TruSeq_SE6 5′-pGGTAGACNNNNNAGATCGGAAGAG
CGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTC
CGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′		 Any this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform
TruSeq_SE7 5′-pGGGCCCTNNNNNAGATCGGAAG
AGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCT
TCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′		 Any this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform
TruSeq_SE8 5′-pGGATCGGNNNNNAGATCGGAAGAG
CGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTT
CCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′		 Any this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform
TruSeq_SE9 5′-pGGACTGANNNNNAGATCGGAAGAG
CGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTC
CGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′		 Any this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform
Typhoon 5 Bimolecular Imager GE Healthcare Life Science 29187191

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Karousis, E. D., Nasif, S., Mühlemann, O. Nonsense-mediated mRNA decay: novel mechanistic insights and biological impact. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 7 (5), 661-682 (2016).
  2. Ivanov, P. V., Gehring, N. H., Kunz, J. B., Hentze, M. W., Kulozik, A. E. Interactions between UPF1, eRFs, PABP and the exon junction complex suggest an integrated model for mammalian NMD pathways. The EMBO Journal. 27 (5), 736-747 (2008).
  3. Papasaikas, P., Valcárcel, J. The Spliceosome: The Ultimate RNA Chaperone and Sculptor. Trends in Biochemical Sciences. 41 (1), 33-45 (2016).
  4. Jensen, K. B., Darnell, R. B. CLIP: Crosslinking and ImmunoPrecipitation of In Vivo RNA Targets of RNA-Binding Proteins. Methods in Molecular Biology. 488, Clifton, N.J. 85-98 (2008).
  5. Garzia, A., Morozov, P., Sajek, M., Meyer, C., Tuschl, T. PAR-CLIP for Discovering Target Sites of RNA-Binding Proteins. mRNA Decay: Methods and Protocols. 1720, 55-75 (2018).
  6. Konig, J., et al. iCLIP - Transcriptome-wide Mapping of Protein-RNA Interactions with Individual Nucleotide Resolution. Journal of Visualized Experiments. (50), e2638 (2011).
  7. Sibley, C. R. Individual Nucleotide Resolution UV Cross-Linking and Immunoprecipitation (iCLIP) to Determine Protein-RNA Interactions. RNA Detection: Methods and Protocols. 1649, 427-454 (2018).
  8. Wheeler, E. C., Van Nostrand, E. L., Yeo, G. W. Advances and challenges in the detection of transcriptome‐wide protein-RNA interactions. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 9 (1), (2018).
  9. Singh, G., et al. The Cellular EJC Interactome Reveals Higher-Order mRNP Structure and an EJC-SR Protein Nexus. Cell. 151, 750-764 (2012).
  10. Singh, G., Ricci, E. P., Moore, M. J. RIPiT-Seq: A high-throughput approach for footprinting RNA:protein complexes. Methods. 65, 320-332 (2014).
  11. Mabin, J. W., et al. The Exon Junction Complex Undergoes a Compositional Switch that Alters mRNP Structure and Nonsense-Mediated mRNA Decay Activity. Cell Reports. 25 (9), 2431-2446 (2018).
  12. Gehring, N. H., Lamprinaki, S., Kulozik, A. E., Hentze, M. W. Disassembly of Exon Junction Complexes by PYM. Cell. 137 (3), 536-548 (2009).
  13. Dostie, J., Dreyfuss, G. Translation Is Required to Remove Y14 from mRNAs in the Cytoplasm. Current Biology. 12 (13), 1060-1067 (2002).
  14. Zünd, D., Gruber, A. R., Zavolan, M., Mühlemann, O. Translation-dependent displacement of UPF1 from coding sequences causes its enrichment in 3' UTRs. Nature Structural & Molecular Biology. 20 (8), 936-943 (2013).
  15. Gangras, P., Dayeh, D. M., Mabin, J. W., Nakanishi, K., Singh, G. Cloning and Identification of Recombinant Argonaute-Bound Small RNAs Using Next-Generation Sequencing. Argonaute Proteins: Methods and Protocols. 1680, 1-28 (2018).
  16. Heyer, E. E., Ozadam, H., Ricci, E. P., Cenik, C., Moore, M. J. An optimized kit-free method for making strand-specific deep sequencing libraries from RNA fragments. Nucleic Acids Research. 43 (1), 2 (2015).
  17. Cameron, V., Uhlenbeck, O. C. 3'-Phosphatase activity in T4 polynucleotide kinase. Biochemistry. 16 (23), 5120-5126 (1977).
  18. Ricci, E. P., et al. Staufen1 senses overall transcript secondary structure to regulate translation. Nature Structural & Molecular Biology. 21 (1), 26-35 (2014).
  19. Lackner, D. H., et al. A generic strategy for CRISPR-Cas9-mediated gene tagging. Nature Communications. 6, 10237 (2015).
  20. Metkar, M., et al. Higher-Order Organization Principles of Pre-translational mRNPs. Molecular Cell. 72 (4), 715-726 (2018).
  21. Giudice, G., Sánchez-Cabo, F., Torroja, C., Lara-Pezzi, E. ATtRACT-a database of RNA-binding proteins and associated motifs. Database: The Journal of Biological Databases and Curation. 2016, (2016).
  22. Paz, I., Kosti, I., Ares, M., Cline, M., Mandel-Gutfreund, Y. RBPmap: a web server for mapping binding sites of RNA-binding proteins. Nucleic Acids Research. 42, Web Server issue 361-367 (2014).
  23. Sundararaman, B., et al. Resources for the Comprehensive Discovery of Functional RNA Elements. Molecular Cell. 61 (6), 903-913 (2016).

Tags

Genetik RNA-fodaftryk RIPiT RNA-bindingsprotein RBP RNA: protein komplekser RNP
Identifikation af fodspor af RNA: protein komplekser via RNA Immunopræcipitation i tandem efterfulgt af sekventering (RIPiT-SEQ)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Woodward, L., Gangras, P., Singh, G. … More

Woodward, L., Gangras, P., Singh, G. Identification of Footprints of RNA:Protein Complexes via RNA Immunoprecipitation in Tandem Followed by Sequencing (RIPiT-Seq). J. Vis. Exp. (149), e59913, doi:10.3791/59913 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter