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Genetics

Identificazione delle impronte di RNA:Complessi proteici tramite l'immunoprecipitazioni dell'RNA in Tandem seguita dal sequenziamento (RIPiT-Seq)

Published: July 10, 2019 doi: 10.3791/59913
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Molecular Genetics, Center for RNA Biology, The Ohio State University

Summary

Qui, presentiamo un protocollo per arricchire i siti endogeni di legame dell'RNA o "impronte" di nasi: proteine (RNP) complessi da cellule di mammiferi. Questo approccio comporta due immunoprecipitazioni di sottounità RNP ed è quindi soprannominato immunoprecipitazioni di RNA in tandem (RIPiT).

Abstract

L'immunoprecipitazioni dell'RNA in tandem (RIPiT) è un metodo per arricchire le impronte di RNA di una coppia di proteine all'interno di un complesso RNA:proteina (RNP). RIPiT impiega due fasi di purificazione. In primo luogo, l'immunoprecipitazioni di una sottounità RNP con tag è seguita da una lieve digestione di RNase e dalla successiva elusione di affinità non denatura. Una seconda immunoprecipitazioni di un'altra sottounità RNP consente l'arricchimento di un complesso definito. A seguito di una diluizione di RNA e proteine, le impronte di RNA vengono convertite in librerie di sequenziamento del DNA ad alto valore di produzione. A differenza del più popolare approccio ultravioletto (UV) seguito da immunoprecipitazioni (CLIP) per arricchire i siti di legame RBP, RIPiT è UV-crosslinking indipendente. Quindi RIPiT può essere applicato a numerose proteine presenti nell'interactoma dell'RNA e oltre che sono essenziali per la regolazione dell'RNA, ma non contattano direttamente l'RNA o UV-crosslink scarsamente all'RNA. Le due fasi di purificazione in RIPiT offrono un ulteriore vantaggio nell'identificare i siti di legame in cui una proteina di interesse agisce in collaborazione con un altro cofattore. La strategia di doppia purificazione serve anche a migliorare il segnale limitando lo sfondo. In questo caso, forniamo una procedura passo-passo per eseguire RIPiT e per generare librerie di sequenziamento ad alta velocità da impronte di RNA isolate. Delineiamo anche i vantaggi e le applicazioni di RIPiT e discutiamo alcune delle sue limitazioni.

Introduction

All'interno delle cellule, l'RNA esiste in complesso con proteine per formare complessi di RNA:proteina (RRP). Gli RPP sono assemblati intorno alle proteine leganti l'RNA (RBP, quelle che legano direttamente l'RNA) ma comprendono anche non-RP (quelli che legano gli RBP ma non l'RNA) e sono spesso di natura dinamica. Gli RBP e i loro cofattori funzionano collettivamente all'interno dei RSP per eseguire funzioni normative. Ad esempio, nel percorso di decadimento dell'mRNA mediato senza senso (NMD), le proteine UPF (UPF1, UPF2 e UPF3b) riconoscono il ribosoma terminato prematuramente. Ognuna delle proteine UPF può legarsi all'RNA, ma è solo quando si assemblano insieme che inizia a formarsi un complesso nmD attivo. All'interno di questo complesso, UPF1 è ulteriormente attivato dalla fosforilazione da un SMG1 non-RBP, e tale attivazione UPF1 alla fine porta al reclutamento di fattori di induzione del decadimento mRNA1,2. In questo esempio, gli RBP richiedono cofattori non RBP per il reclutamento e l'attivazione del complesso RNP che attiva NMD. Un'altra proprietà degli RNP è la loro eterogeneità compositiva. Si consideri il spicchio, che esiste in distinti complessi E, A, B o C. Diversi complessi spliceo hanno proteine sovrapposte e distinte3. Per studiare le funzioni di RNP, è importante chiarire quali RNA sono legati da un RBP e le sue proteine associate. Esistono molti metodi per raggiungere questo obiettivo, con ogni approccio che ha i suoi vantaggi e svantaggi distinti4,5,6,7.

I metodi molto popolari per identificare i siti di legame RBP - crosslinking seguito da immunoprecipitazioni (CLIP) e le sue varie variazioni - si basano sulla luce ultravioletta (UV) per collegare un RBP all'RNA8. Tuttavia, questo non è un approccio efficace per i non-RBP all'interno dei RSP, che non contattano direttamente l'RNA. Qui, descriviamo un approccio alternativo applicabile sia agli RBP che ai non-RBP, per isolare e identificare i loro siti di legame dell'RNA. Questo approccio chiamato immunoprecipitazioni dell'RNA in tandem (RIPiT) è costituito da due fasi di immunoprecipitazioni, che aiutano a raggiungere una maggiore specificità rispetto a una singola purificazione (Figura 1)9,10. Poiché le singole fasi di immunoprecipitazioni (IP) possono essere eseguite a una cordenza inferiore rispetto al CLIP, RIPiT non dipende dalla disponibilità di anticorpi in grado di resistere alla presenza di forti detergenti durante l'immunoprecipitazioni. Il vantaggio più unico di RIPiT è la capacità di indirizzare due diverse proteine in due fasi di purificazione; questo fornisce un modo potente per arricchire un complesso RNP compositivamente distinto da altri complessi simili11.

Piccole variazioni alla procedura RIPiT possono migliorare ulteriormente l'arricchimento del RNP. Ad esempio, alcune interazioni RNA-proteina o proteina-proteina all'interno dei RNP sono transitorie e può essere difficile purificare in modo efficiente le impronte di tali complessi. Per stabilizzare tali interazioni, i RNP possono essere incrociati all'interno delle cellule con formaldeide prima della lisi cellulare e RIPiT. Ad esempio, abbiamo osservato che una debole interazione tra il fattore centrale del complesso di giunzione dell'esonio (EJC), EIF4AIII e il fattore di smontaggio dell'EJC, IL PYM12 può essere stabilizzato con il trattamento della formaldeide in modo che vengano arricchite più impronte di RNA (dati non (visualizzato). Prima della raccolta cellulare e RIPiT, le cellule possono anche essere trattate con farmaci per stabilizzare o arricchire i RNP in un determinato stato. Ad esempio, quando si studiano proteine che vengono rimosse dall'mRNA durante la traduzione (ad esempio, l'EJC13, UPF114), il trattamento con inibitori di traduzione come la damacina, il cicloseximide o l'armonica può portare ad un aumento dell'occupazione di proteine sugli RNA.

La quantità di RNA recuperata da RIPiT è solitamente bassa (0,5-10 pmoles, cioè 10-250 ng RNA considerando una lunghezza media dell'RNA di 75 nt). La ragione principale di questo è che solo una piccola frazione di una data proteina è presente in complesso con altre proteine all'interno di RRP (qualsiasi proteina "libera" IP'ed nel primo passo viene persa durante il secondo IP). Per generare librerie RNA-Seq da questo RNA, abbiamo anche delineato qui un adattamento del protocollo pubblicato in precedenza adatto a tali input di RNA bassi15,16 (Figura 2), che produce campioni pronti per la sequenziamento ad alta velocità in 3 Giorni.

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Protocol

1. Istituzione di linee cellulari HEK293 stabili che esprimono le proteine di interesse marcate FLAG indecicabili da Tetraciclina (POI)

  1. Cellule di semi HEK293 con un punto di destinazione di ricombinazione Flp (FRT) stabilmente integrato ad una densità di 10 x 104 celle/mL in mezzo di crescita (il mezzo di Eagle modificato di Eagle [DMEM] - 10% siero bovino fetale [FBS] - 1% penicillina-streptomycin [penn/sp]) in 6- piatti ben. Consentire alle cellule di crescere durante la notte in un'incubatrice umidificata a 37 e 5% di CO2 (condizioni di crescita standard per tutti i passaggi successivi).
  2. Il giorno successivo, le cellule dovrebbero essere confluenti del 70%. Secondo il protocollo di reagente di trasfezione, trasfecare le cellule HEK293 che contengono il sito FRT con un rapporto 9:1 di pcDNA5-TETO-FLAG-POI:pOG44.
    NOT: Il tag FLAG ha il motivo della sequenza DYKDDDDK (D - acido aspartico, Y e tirosina e K - lisina).
  3. Dopo 24 h, iniziare la selezione degli antibiotici. Rimuovere i supporti e aggiungere un nuovo mezzo di crescita integrato con 100 g/mL di igromycina. Entro 72 h, le cellule non trastrante dovrebbero iniziare a morire.
  4. Ogni 48-72 h, cambiare i media di crescita e integrare con igromycina fresca.
  5. Dopo 2 settimane di selezione, cominceranno a comparire colonie discrete di cellule rescissive e stabile. Una volta che le colonie sono visibili ad occhio nudo, aggiungere 1 mL di trypsin alla piastra e incubare per 5 min a 37 gradi centigradi. Risospendere le cellule in DMEM, trasferire le cellule in una nuova piastra di 10 cm e regolare il volume a 10 mL di mezzo di crescita fresco integrato con 100 g/mL di igromicina. Consentire alla piastra di raggiungere la confluenza dell'80% per espandere ulteriormente le cellule per preparare scorte permanenti.
  6. Determinare la quantità di tetraciclina (Tet) necessaria per ottenere il livello ottimale di espressione FLAG-POI per l'esperimento. Far crescere le cellule in formato 12-well e condurre una titolazione di Tet tra 0-1,000 ng/mL gamma per 16-24 h. Eseguire macchie occidentali sui campioni di titolazione con anticorpo contro il POI.
    NOT: Per le proteine fino a 60 kDa, il FLAG-tagged e la copia endogena della proteina possono essere risolti sul sodio dodecyl sodecyl sodecyl solfato-polyacrilie gel elettroforesi (SDS-PAGE) per confrontare i livelli di espressione di FLAG-POI con la sua controparte endogena. Per le proteine più grandi, l'intensità del segnale nei campioni indotti da Tet può essere paragonata a un campione non indotto. La soluzione di stock di tetraciclina può essere preparata a 1 mg/mL in 100% di etanolo. Le diluizioni dello stock per il lavoro di coltura cellulare dovrebbero essere in acqua sterile o saline tampone fosfato (PBS). Lo stock di tetraciclina deve essere preparato fresco una volta al mese.

2. Cellule di coltura per l'induzione di tetraciclina e la procedura RIPiT

  1. Seme opportunamente integrato FLAG-POI HEK293 ad una densità di 3 x 105 celle / mL in mezzo di crescita in piastre da 15 cm. Consentire alle cellule di crescere a 37 e 5% di CO2.
    NOT: In generale, da tre a cinque piastre da 15 cm produrranno da 2 a 20 pm di impronte di RNA a seconda dell'abbondanza di RNP di interesse. Se gli RNP saranno incrociati e purificati da parte di RRN in condizioni rigorose, potrebbe essere necessario il doppio dell'input.
  2. Aggiungere tetraciclina a una concentrazione ottimale predeterminata ai media per indurre l'espressione del FLAG-POI (vedi passo 1.6) 16-24 h prima della raccolta delle cellule.
    NOT: Non è necessario cambiare il mezzo di crescita. Le cellule devono essere pronte per la raccolta di circa 72 h dopo la semina o quando le piastre sono confluenti dell'80%. È importante evitare che le cellule diventino confluenti.

3. Raccolta cellulare, trattamento di formaldeide e lisi cellulare

  1. Lavare delicatamente le cellule monostrato con 15 mL di PBS refrigerati per ogni piastra da 15 cm. Poi raschiare le cellule in 30 mL di PBS. Se le cellule sono state trattate con farmaci prima della raccolta, integrare PBS con il farmaco. Raccogliere tutte le cellule in tubo conico da 50 mL.
    NOT: Per preservare le interazioni deboli, le cellule possono essere incrociate con la formaldeide: aggiungere formaldeide alla sospensione cellulare dal passaggio 3.1 a una concentrazione finale dello 0,1% e incubare su un rocker a temperatura ambiente per 10 min. Aggiungere 3 mL del tampone di spegnimento (Tabella 1 ) e roccia per altri 5 minuti.
  2. Cellule di Pellet a 400 x g per 10 min a 4 gradi centigradi e scartare il supernatante.
  3. Cellule di lyse in 4 mL di tampone di lisi ipotonica ghiaccio-freddo (HLB; Tabella 1). Utilizzare una pipetta P1000 per risospendere le celle. Trasferire su un tubo da 5 mL e incubare il lisa su ghiaccio per 10 min.
  4. Mettere il lisato in un bagno di ghiaccio e sonicare al 10% di ampiezza per 30 s con impulso 1 s con 2 s pause. Quindi, regolare la concentrazione del sale a 150 mM aggiungendo 108 L di 5 M NaCl.
    NOT: I campioni incrociati di formaldeide possono essere soggetti a lisi e purificazione più rigorosi includendo lo 0,1% ciascuno di SDS e deossicolato di sodio nel buffer di lisi.
  5. Cancellare il lisato con la centrifugazione a 21.000 x g per 10 min a 4 gradi centigradi. Raccogliere 20 supernatali lla (estratto cellulare) in un tubo etichettato per l'analisi western blot dei livelli di proteine in ingresso (vedere Figura 3A).
    NOT: Mentre il lisato è in centrifuga, le perle di agarose FLAG possono essere lavate (vedi passo 4.1). Le perle di agarose FLAG devono essere pre-lavate 3 volte in 4 mL di tampone di lavaggio isotonico ghiacciato (IsoWB, Tabella 1).

4. Immunoprecipitazioni FLAG

  1. Applicare il rimanente supernatante dal passo 3,5 al 750 - perline di agarose FLAG pre-lavate in un tubo da 5 mL (il volume del letto delle perline di agarose FLAG lavate sarà 375 . Incubare le perline di agarose FLAG e l'estratto cellulare per 1-3 h a 4 gradi centigradi con una leggera miscelazione.
    NOT: Questo volume di perline di agarose FLAG dovrebbe essere sufficiente per una vasta gamma di proteine, ma può essere ottimizzato, se necessario.
  2. Pellet FLAG agarose perline di centrifugazione a 400 x g per 1 min a 4 gradi centigradi. Raccogliere 20 l del supernatore in un tubo etichettato per l'analisi macchia occidentale dei livelli di proteine in estratto di cellule esaurite (vedere Figura 3A). Scartare il super-attuoso rimanente.
  3. Per lavare le perline di agarose FLAG, aggiungere 4 mL di IsoWB e risospendere. Perline di pellet a 400 x g per 1 min a 4 gradi centigradi. Rimuovere con attenzione supernatante. Ripetere 4x.
    NOT: Per lavaggi rigorosi degli IP incrociati di formaldeide, lo 0,1% di ciascuno di SDS e deossicolato di sodio può essere incluso nel buffer di lavaggio per le prime due fasi di lavaggio.

5. Digestione di RNase I

  1. Diluire RNase I a 0,002-0.01 unità/mL in 750 -L di IsoWB (la concentrazione appropriata per le dimensioni dell'impronta desiderata deve essere determinata empiricamente). Aggiungere IsoWB-RNase I alle perline di agarose FLAG lavate e incubare con una leggera miscelazione a 4 gradi centigradi per 10 min.
  2. Perline di pellet a 400 x g per 1 min a 4 gradi centigradi. Raccogliere 20 supernatant (RNase I elution) in un tubo etichettato per l'analisi delle macchie occidentali. Scartare IsoWB-RNase I e lavare le perline di agarose FLAG 4x con IsoWB come descritto al punto 4.3.

6. Elusione dell'affinità

  1. Preparare uno stock di tampone di tampone di eluizione (peptide FLAG a 250 ng/mL in IsoWB). Applicare 375 LL di tampone di eluizione alle perline di agarose FLAG e agitare delicatamente a 4 gradi centigradi per 1-2 h. Pellet FLAG agarose perline e raccogliere un 15 -L dell'eluizione per le macchie occidentali di proteine in FLAG IP (vedi Figura 3A).
    NOT: Quando l'elusione di affinità è in corso, è possibile eseguire la sezione 7.

7. Coniugazione magnetica per perline-anticorpo

  1. Lavare 50 perline magnetiche (ad es. Dinale; Tabella dei materiali) 3x in 1 mL IsoWB in tubo da 1,5 mL. Risospendere le perline magnetiche in 100 gradi l di buffer di coniugazione. Aggiungere la quantità appropriata di anticorpo (quantità esatta di anticorpo da utilizzare per IP dovrà essere empiricamente determinato per ogni anticorpo).
    NOT: Le perle magnetiche proteiche A sono ottimali per gli anticorpi prodotti nel coniglio, mentre le perle magnetiche proteiche G sono più appropriate per gli anticorpi murini. Grafico di compatibilità perline magnetiche è disponibile sul sito web del fornitore per scegliere perline appropriate per ogni anticorpo.
  2. Lavare perline magnetiche 2x nel buffer di coniugazione (Tabella 1). Incubare la miscela a temperatura ambiente per almeno 10 min. Resospendia perline magnetiche in 375 : L di tampone di diluizione RIPiT. Conservare sul ghiaccio fino al passo successivo.

8. Seconda immunoprecipitazioni

  1. Applicare l'eludiazione di affinità FLAG rimanente dal passo 6.1 alle perle magnetiche accoppiate agli anticorpi contro la proteina di interesse. Incubare con una leggera miscelazione a 4 gradi centigradi per 1-2 h. Catturare perline magnetiche su un magnete e raccogliere 15 - L di supernatante per l'analisi delle proteine non legate tramite blot occidentale. Lavare perline magnetiche 7x con 1 mL di IsoWB.

9. Denaturing Elusione

  1. Aggiungete 100 l di buffer campione trasparente (Tabella 1) alle perline magnetiche e sospendete con una pipetta P200. Incubare sul ghiaccio per 10 min. Flick delicatamente per risospendere periodicamente le perline.
  2. Catturare perline magnetiche su un magnete e raccogliere 15 - L di eluizione per l'analisi delle proteine in eluzione RIPiT tramite macchia occidentale (vedi Figura 3A). Trasferire l'eluzione residua in un nuovo tubo etichettato da 1,5 mL.
    NOT: Se i campioni sono stati crosslinked di formaldeide, allora i campioni devono essere incubati a 65 gradi centigradi per 1 h per invertire il crosslinking.
  3. Eseguire macchie occidentali su campioni raccolti in varie fasi (ingresso, deplezione dell'IP FLAG, IP FLAG, secondo esaurimento IP, seconda eluizione IP). Blot con anticorpi contro le due proteine esca, gli altri interattori se noti, e almeno un RBP non interagente come controllo negativo (Figura 3A).

10. Estrazione dell'RNA e curazione finale

  1. All'eluizione RIPiT, aggiungere 320 -L di RNase-free ddH2O, 400 L di alcool isonomico fenolo-cloroforminato (PCIAA, pH 4.5), e vortice per 30 s e girare a temperatura ambiente a 12.000 x g per 5 min. Aggiungere 35 ld di acetato di sodio da 3M, 1/L di 1 M MgCl 2, 10 g di glicogeno e 1 mL di 100% di etanolo. Incubare per una notte a -20 gradi centigradi.
  2. Per pellet RNA, centrifugare a 12.000 x g per 30 min a 4 gradi centigradi. Lavare l'RNA nel 70% di etanolo.
  3. Per rimuovere il fosfato 3' lasciato sull'RNA dopo la scissione di RNase I, risospendere il pellet di RNA in 17 : L di ddH2O senza RNASe, e aggiungere 2 L di 10x T4 polynucleotide chinase (TableofMaterials) e 1 L di T4 PNK. Incubare a 37 gradi centigradi per 30 min.
    NOT: L'attività 3' fosphatase di T4 PNK ha un'attività ottimale a pH 617. Il buffer di reazione PNK è ottimizzato per l'attività della chinasi 5' di T4 PNK e ha un pH di 7,6. Mentre è stato tentato di regolare il pH della reazione finale, questo passaggio può essere ulteriormente ottimizzato.
  4. Aggiungete al tubo 380 l di RNase-free ddH2O e 400 -L di PCIAA pH 4.5. Vortice per 30 s, centrifugare a 12.000 x g per 5 min. Raccogliere acquosa e aggiungere 35 L di acetato di sodio 3 M, 1 L di 1 M MgCl2, 10 g di glicogeno, e 1 mL di 100% etanolo.
  5. Incubare per una notte a -20 gradi centigradi. Pellet e lavare RNA con 70% etanolo come sopra. Risospendere l'RNA in 4,5 litri di acqua senza RNase.

11. Stima delle dimensioni e dell'abbondanza dell'impronta di RNA

  1. Un RIPiT di successo dovrebbe produrre 1 pmol o più di frammenti di RNA. Per quantificare la resa effettiva, trasferire 0,7 litri di RNA RIPiT (1/6 del rendimento totale) in un nuovo tubo. Aggiungete 2 L di 10x T4 PNK, 1 luna di 1 mM ATP, 40 Ci e32P-ATP (0,5,1,0 L del titolo) e 1 L di T4 PNK. Regolare il volume a 10 gradi centigradi e incubare a 37 gradi centigradi per 30 min.
    1. Nelle reazioni PNK parallele, etichettare un DNA Ladder a bassa portata e 0,1 pmol di un RNA sintetico o oligo del DNA (20-40 nt) per utilizzare uno standard di dimensioni e quantità.
  2. Risolvere l'etichettatura RNA/DNA su gel urea-PAGE 26% (20 x 27 x 0,45 mm3). Gel deve essere pre-run per 30 min a 35 W. Pozzi di lavaggio prima di pre-esecuzione e prima di caricare i campioni ed eseguire a 35 W fino a quando fronte colorante blu bromofenolo ha quasi raggiunto la fine del gel.
  3. Rimuovere con attenzione il gel dalle lastre di vetro su un pezzo di carta filtrante 8 x 11 pollici. Con gel sulla parte superiore della carta, mettere in gel asciugatura apparato e coprire con un pezzo di involucro di plastica. Gel secco a 80 gradi centigradi per 1 h con vuoto.
  4. Esporre gel essiccato a un fosforo durante la notte o fino a quando non viene rilevato un segnale adeguato. Schermo fosforo dell'immagine. RNA di buona qualità da un RIPiT dovrebbe apparire come uno striscio nella corsia, con bande di primo piano (Figura 3B). Per quantificare l'RNA, confrontare l'intensità del segnale dei frammenti di RNA di dimensioni desiderati nella corsia RIPiT con il segnale da 0,1 pmol di oligo sintetico etichettato.
    NOT: In alternativa, le dimensioni e le quantità di impronta dell'RNA possono essere verificate utilizzando un bio/analyzer ad alta sensibilità (Figura 3C).

12. Ligazione dell'adattatore

  1. Preparare l'RNA RIPiT in modo che almeno 3 pmol di RNA venga disciolto in 3,8 : l'acqua.
  2. In un tubo a catena di reazione alla catena di polimerasi da 0,2 mL (PCR), unire 3,8 litri di RNA, 1 -L di adattatore pre-adenilato miR-CAT-33 (7 M) (Tabella dei materiali). Incubare la miscela su un ciclore termico a 65 gradi centigradi per 10 min, 16 gradi centigradi per 5 min, quindi tenere a 4 gradi centigradi.
    NOT: Il linker pre-adenlato può essere ordinato dal servizio di sintesi oligo, o un oligo di DNA personalizzato non densato da qualsiasi servizio di sintesi oligo può essere adenlato utilizzando Mth RNA ligase (Tabella dei materiali) e gel purificato.
  3. Allo stesso tubo, aggiungere 1,5 L di 10x T4 RNA ligase buffer, 7,5 L del 50% di polietilene glicole 8000 (PEG-8000), 0,75 L di 20 m dithiothreitol (DTT)e 0,45 L di T4 RNL2 Tr.
    NOTA: il 50% peg-8000 viene fornito con legamento di RNA e tampone acquistato. Le soluzioni PEG-8000 sono viscose e devono essere reindirizzate lentamente.
  4. Incubane la reazione nel ciclore termico a 30 gradi centigradi per 6 h, il calore inattiva la ligia a 65 gradi centigradi per 10 minuti, quindi tenere premuto a 4 gradi centigradi.

13. Trascrizione inversa

  1. Al tubo con la miscela di legatura dal punto 12.4, aggiungere 11,25 l of 4x deoxynucleotide triposfata (dNTP) mix, che contiene un mix di dNTP regolari e biotinylati (vedi tabella1), 1,0 l di 10 - M RS primer (Tabella dei materiali) e 6,8 L di Acqua senza RNasi. Incubare a 65 gradi centigradi per 5 min, quindi tenere a 4 gradi centigradi.
  2. Trasferire i tubi sul ghiaccio e aggiungere 9,0 loff di 5 volte il buffer del primo filamento (FS) senza MgCl2 (Tabella 1), 2,25 L di 100 mM DTT, 1,2 l di enzima della trascrizione inversa a un volume finale di 45 ( Tabelladei materiali).
  3. Incubare in un ciclore termico a 55 gradi centigradi per 30-60 min.

14. Purificazione del prodotto RT

  1. Aggiungere 45 - L di 2x urea load buffer (Tabella 1) alla reazione RT. Diluire 1 g di un DNA Ladder a basso raggio in 45 gradi l e aggiungere 45 lof2 buffer di carico di urea.
  2. Preparare il gel urea-PAGE 10% (20 x 28 x 0,15 cm3; Tabella 1) con pettine a 8 pozze. Utilizzando siringhe o pipet, lavare i pozzi con buffer 0.5x Tris/borate/EDTA (TBE).
    NOT: I gel fatti in casa di cui sopra offrono una migliore risoluzione nel separare il prodotto RT esteso dal primer RT non esteso. In alternativa, possono essere utilizzati anche gel urea-PAGE pre-cast (Tabella dei materiali). Poiché i gel pre-cast consentono volumi massimi più piccoli per pozzo, quindi i campioni dovranno essere suddivisi in più pozzetti. I gel pre-cast devono essere eseguiti a 150-200 V.
  3. Pre-eseguire il gel a 35 W per 30 min. Lavare i pozzi di nuovo, caricare i campioni ed eseguire gel a 35 W fino a quando fronte fronte fronte mormoreanolo blu colorante è migrato a circa 1 pollice dalla fine del gel.
    NOT: Utilizzare il dissipatore di calore metallico durante la pre-esecuzione e la corsa finale per evitare il surriscaldamento del gel.
  4. Macchiare il gel per 5 min in 1x oro nucleico acido soluzione macchia gel preparato in 0.5x TBE. Questo tinriè è sensibile alla luce, quindi evita l'esposizione alla luce.
  5. Gel di immagini su scanner fluorescente per scopi di documentazione utilizzando l'eccitazione di 520 nm e filtri di emissione 580 nm. Se uno scanner fluorescente non è disponibile, utilizzare un transilluminatore a luce blu. Il prodotto RT dovrebbe apparire come uno striscio a partire da sopra il primer RT non esteso (Figura 4).
    NOT: Anche se la colorante colorante per gel acido acido coculico d'oro è facilmente visualizzabile su un documento gel con fonte di luce UV, è fondamentale non esporre il prezioso prodotto RT ai raggi UV per prevenire danni.
  6. Visualizzare il gel su un transilluminatore a luce blu e accisare il prodotto RT dal gel. Si raccomanda di tagliare il DNA con estensioni che vanno da 30-200 nt (Figura 4). Posizionare i pezzi di gel asformati su una superficie pulita e macinare la fetta in piccoli pezzi per aumentare la superficie. Trasferire con attenzione su un tubo da 1,5 mL e aggiungere 800 l di buffer di eluizione del DNA (Tabella 1).
  7. Incubare i pezzi di gel con una leggera miscelazione con buffer di eluizione del DNA durante la notte a temperatura ambiente.
  8. Separare il tampone di eluizione dal gel passando il liquame attraverso una colonna di filtro in acetato di cellulosa (Tabella dei materiali) collocata in un tubo di raccolta da 2 mL.
  9. In tubo da 1,5 mL, lavare 10 o più di perline magnetiche di streptavidin con 500 L di tampone di lavaggio perline di streptavidin (Tabella 1). Ripetere per tre lavamenti totali. Non lasciare asciugare le perline. Risospendere le perline in 10 : L del buffer di eluizione del DNA (Tabella 1).
  10. Trasferire il tampone di eluizione separato dai pezzi di gel al punto 14.8 al tubo contenente le perle magnetiche streptavidinlava lavate.
  11. Incubare con miscelazione delicata per almeno 8 h a temperatura ambiente. Catturare perline su un magnete, rimuovere le perline magnetiche supernatali e respendere le perline magnetiche in 10 -L di acqua senza RNase e trasferirle su un tubo PCR da 0,2 mL.

15. Circolarizzazione del Prodotto RT

  1. I prodotti RT catturati su perline streptavidin sono circolari mentre sono legati su perline. Per il liquame magnetico di perline, aggiungere 2,0 L di 10x buffer di reazione circolari, 1,0 L di 1 mM ATP, 1,0 L di 50 mM MnCl2, 4,0 L di 5 M betaina, 1,0 l di ssDNA ligase I (Tabelladeimateriali), e 1,0 L di RNase-free water.
  2. Incubare la reazione di circolarizzazione su un ciclore termico a 60 gradi centigradi per 4 h. Il calore inattiva la ligase ssDNA i riscaldando a 80 gradi centigradi per 10 minuti, quindi tenere a 4 gradi centigradi.

16. Prova PCR

  1. Prima di procedere a una PCR su larga scala, utilizzare una porzione di prodotto circolare per determinare il numero ideale di cicli di amplificazione per ogni campione. Questo passaggio consente di prevenire l'amplificazione eccessiva e limitare gli artefatti PCR come componenti di reazione PCR diventano limitanti a cicli PCR più elevati.
  2. Preparare una reazione PCR da 45 LlL con 4,0-6,0 l del prodotto circolare a partire dal punto 15,2, 9,0 L di 5 volte buffer di reazione, 0,9 Ll 10 M dNTP, 2,25 M di 10 M PE1.0 primer (Tabella dei materiali), 2,25 l di 10M PE2.0 primer ( Tabella deimateriali) , e 0,045 l di polimerasi del DNA ad alta fedeltà (Tabella dei materiali) e acqua.
  3. Mescolare bene la reazione e dividere in tre reazioni da 15 l. Ognuna di queste tre reazioni sarà soggetta a un numero variabile di cicli PCR. Il numero ideale di cicli dovrebbe essere compreso tra 7 e 14. Quindi eseguire PCR di prova per 8, 11, e 14 cicli.
  4. Utilizzare le seguenti condizioni di PCR: 98 s - 30 s; 98 s - 5 s; 65 s - 10 s; 72 s - 15 s; 72 s - 2 min; 12 gradi centigradi - tenere premuto.
  5. Aggiungere 3 -L L di 6x gel carico di carico e risolvere su 10% nativo gel PAGE fino a quando il fronte colorante blu ha migrato 3/4 del gel. Macchiare il gel utilizzando la macchia del gel acido nucleico d'oro e l'immagine come nei passi 14.4 e 14.5 (Figura 5).
  6. Per scegliere il numero ideale di cicli PCR, confrontare i prodotti PCR da un numero crescente di cicli. Scegliere il numero di ciclo che produce la massima quantità di prodotto della dimensione prevista senza artefatti di sovraamplificazione (ad esempio, sbavatura di DNA molto più grande del prodotto previsto e in cui non si osserva un esaurimento apprezzabile dei primer PE1.0 e PE2.0 (vedere la freccia rossa Figura 5).

17. PCR su larga scala

  1. Preparare una reazione PCR da 45 LL, come nel passaggio 16,2 e ripetere la PCR. Risolvere la PCR su 10% nativo PAGE a 150 V, macchia con 1x oro nucleico acido gel macchia e immagine su un transilluminatore luce blu.
  2. Accisa il prodotto PCR dal gel e trasferire a una siringa da 3 mL. Utilizzare la siringa per schiacciare il gel ed estrudere in un tubo da 1,5 mL.
    NOT: Il prodotto RT non esteso al momento della circolarizzazione produce un prodotto PCR di 151 bp. Pertanto, in questa fase è necessario ridimensionare selezionare i prodotti che sono superiori a 151 bp (Figura 6).
  3. Aggiungere 900 l di tamponi di eluizione del DNA e incubare a temperatura ambiente durante la notte con una leggera miscelazione.
  4. Trasferire il liquame gel in una colonna di filtro in acetato di cellulosa collocata in un tubo di raccolta da 2 mL. Girare a 12.000 x g per 3 min, raccogliendo supernatant in un tubo fresco.
  5. Aggiungere altri 400 l di tamponi di eluizione del DNA al gel frantumato e trasferirli in un tubo da 1,5 mL. Incubare con miscelazione delicata per altre 4 ore per una seconda eluizione.
  6. Mettere in comune tutte le eluzioni e dividere in 3 tubi con 400 . Precipitare il DNA aggiungendo 1 mL di 100% etanolo e 10 g di glicogeno. Vortice e incubare almeno 2 h a -20 gradi centigradi.
  7. Dna di Pellet a 12.000 x g per 30 min a 4 gradi centigradi. Lavare il pellet di DNA con il 70% di etanolo.
  8. Rimuovere con attenzione tutto l'etanolo pipettando e rispendere rapidamente il pellet di DNA in 20 .
    NOT: In questa fase, è importante non lasciare che il pellet di DNA si asciughi, poiché l'essiccazione del DNA può denaturarlo.
  9. Utilizzare una piccola porzione di campione di DNA per determinare le dimensioni e la concentrazione del prodotto PCR tramite fluorometro e bio/ira/ del DNA ad alta sensibilità. I campioni possono ora essere inviati per la sequenza su una delle piattaforme.
  10. Le letture in sequenza possono essere elaborate (ad esempio, rimozione dell'adattatore, taglio per mantenere le sequenze >30 Phred score), allineate al genoma di riferimento e visualizzate su un browser come il browser del genoma UCSC (Figura 7).

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Representative Results

Un RIPiT di successo comporterà l'immunoprecipitazioni di proteine di interesse e di altre proteine interagenti note, e l'assenza di proteine non interagenti. Come si è visto nella Figura 3A, sia Magoh che EIF4AIII sono stati rilevati nell'eluzione di RIPiT, ma HNRNPA1 non lo era (lane 6). Parallelamente, le impronte di RNA che hanno co-purificato con i complessi RNP sono state rilevate tramite l'autoradiografia (Figura 3B) o il bioanalisi (Figura 3C). Si prevede che il trattamento della formicina aumenterà l'occupazione di EJC sull'RNA, e un segnale di impronta dell'RNA più forte è stato osservato nel RIPiT trattato puromycin nella Figura 3B (confrontare le corsie 2 e 3). La generazione di campioni per il sequenziamento profondo richiede la legazione di un adattatore all'RNA, e quindi la trascrizione inversa dell'RNA in DNA utilizzando un primer che anneals alla sequenza dell'adattatore. La fase di trascrizione inversa incorpora nucleotidi biotinylati, per la purificazione del prodotto di trascrizione inversa. Dopo la trascrizione inversa, il prodotto deve essere separato dall'adattatore non esteso da urea-PAGE (Figura 4). Il prodotto di trascrizione inversa viene quindi ruotato e PCR amplificato. Il numero appropriato di cicli PCR non deve amplificare eccessivamente il prodotto circolatori. La sovraamplificazione comporterà l'esaurimento delle primer e il prodotto PCR aberrato (vedere Figura 5, corsia 4). Il numero di cicli con la massima amplificazione senza evidenza di sovraamplificazione è più appropriato da utilizzare per una PCR su larga scala (Figura 5 corsia 3 e Figura 6).

Figure 1
Figura 1 : schematico che illustra i passaggi principali in RIPiT. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3

Figura 2 : Schema raffigurante il flusso di lavoro per la conversione dell'RNA RIPiT in librerie per il sequenziamento ad alta velocità. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2

Figura 3 : Stima dei rendimenti dell'RNA e delle proteine da RIPiT. (A) Macchia occidentale delle proteine purificate da ogni passo importante della procedura RIPiT. (B) Immagine autoradiografica delle impronte di RNA da un FLAG-MAGOH:EIF4AIII RIPiT confrontando le cellule trattate puramycin e non trattate. La casella rossa indica la dimensione dell'impronta dell'RNA che verrà infine convertita in librerie di sequenziamento. (C) Profilo dell'RNA eluito da RIPiT come nella corsia 2 nel pannello B quando visualizzato utilizzando un bioanalizzatore. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4 : prodotto di trascrizione inversa (RT) risolto su un gel urea-PAGE del 10% e macchiato con macchia di gel acido acido nucleico d'oro. Scatola rossa indica la regione gel asformata per la purificazione del gel di prodotti RT estesi. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5 : PCR di prova risolto su PAGINA non denatura dell'8%. Si noti i prodotti PCR aberrantemente grandi che appaiono a 14 cicli (scatola rossa) e l'esaurimento parallelo di primer (freccia rossa) indicativo di sovraamplificazione. Per questo esempio, sono stati scelti 11 cicli per la PCR su larga scala (scatola blu). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 6
Figura 6 : PCR su larga scala risolta su PAGINA non denatura dell'8%. Scatola rossa indica il pezzo di gel asformato per la purificazione del gel. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 7
Figura 7 : schermata del browser genoma del gene MAPK1 che mostra la distribuzione delle impronte FLAG-MAGOH:EIF4AIII come risultati rappresentativi da un RIPiT. Le frecce rosse indicano i siti di binding EJC canonici previsti. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Pbs 137 mM NaCl
2,7 mM KCl
10 mM Na2HPO4x 7H2O
KH2PO4
pH 7,4
Buffer di spegnimento 2,5 M Glicina
2,5 mM Tris-Base
Buffer di Lisi Ipotonico (HLB) 20 mM Tris-HCl pH 7.5
15 mM NaCl
10 mM EDTA
0,5% IGEPAL
0,1% Triton-X-100
1x Aprotin
1x Leupeptin
1x Pepstatin
1 mM PMSF (fluoruro fenilmethylsulfonyl)		 : deve essere aggiunto fresco ogni volta
Buffer lavaggio Isotonico (IsoWB) 20 mM Tris-HCl pH 7.5
150 mM NaCl
0.1% IGEPAL
Buffer di coniugazione 0,02% Polysorbate-20
1x PBS
Cancella buffer di esempio 100 mM Tris-HCl pH 6,8
4% SDS
10 mM EDTA
4xdNTPmix 0,25 md dGTP
0,25 mM dTTP
0,175 mM dATP
0,1625 mM dCTP
0,075 mM di biotina-dATP
0,0875 mM di biotina-dCTP
5x Buffer Primo-Strand w/o MgCl2 250 mM Tris-HCl pH 8
375 mM KCl
Buffer di diluizione RIPiT (1 mL) 1 mL IsoWB
5 -L 200x BSA
20 -L 10% Triton-X-100
20 -L 0,5M EDTA
1x Aprotin
1x Leupeptin
1x Pepstatin
1 mM PMSF		 : deve essere aggiunto fresco ogni volta
2x Buffer di caricamento di denatura 3 mL 5x TBE
1,8 g Ficoll Tipo 400
6,3 g di urea
3 mg di bromofenolo blu
3 mg di xilene cianol
Regolare il volume a 15 mL ddH2O		 Per entrare in soluzione, mettere il tubo in acqua in un bicchiere e far bollire sulla piastra calda per 10-15 min.
Gel Urea-PAGE 6 M Urea
Acrilammide:bisacriccmide (40% [w/v]) alla percentuale appropriata
0,5x TBE
0.01% TEMED
Buffer di elusione del DNA 300 mM NaCl
1 mM EDTA
Streptavidin Perline Lavare Buffer 0,5 M NaOH
20 mM Tris-HCl pH 7.5
1 mM EDTA

Tabella 1: buffer.

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Discussion

Discutiamo qui alcune considerazioni chiave per eseguire con successo RIPiT. In primo luogo, i singoli IP devono essere ottimizzati per ottenere la massima efficienza possibile in ogni fase. La quantità di perline di agarose FLAG per il numero di ingresso di cellule qui descritte si è dimostrata robusta per una vasta gamma di proteine che abbiamo testato. Poiché solo una piccola frazione delle proteine partner è co-immunoprecipitata con la proteina FLAG, la quantità di anticorpi necessari per un IP secondo efficiente è solitamente bassa (meno di 10 g). RiPiT su piccola scala (da una piastra di 10 cm) seguito dalla verifica delle macchie occidentali delle proteine in ogni frazione durante le due fasi di immunoprecipitazioni si rivela estremamente utile per valutare l'efficienza e la specificità della procedura prima di aumentare. Entrambe le proteine mirate e qualsiasi altra proteina interagenti prevista nel complesso devono essere rilevate nell'eluzione. È anche utile valutare che le proteine nei lisati esauriti (non legati al FLAG-agarose o alle perline magnetiche) abbiano una buona stima dell'efficienza dell'immunoprecipitazioni e della percentuale di proteine assemblate in un complesso. Inoltre, questa analisi informa anche se le condizioni di digestione di RNase sono sufficienti a separare le interazioni dipendenti dall'RNA dalle interazioni indipendenti dall'RNA all'interno di un RNP. Pertanto, è altrettanto importante includere un controllo negativo, idealmente un RBP non correlato al RNP di interesse. Ad esempio, nella figura 3A, HNRNPA1 è presente nell'input ma non viene rilevato nell'eluzione RIPiT. HNRNPA1 è un RBP che non interagisce direttamente con l'EJC, ma interagisce indirettamente con l'EJC quando l'EJC e l'HNRNPA1 sono legati alla stessa molecola di RNA. La rilevazione della proteina di controllo negativo nell'eluizione indica una scarsa specificità RIPiT o un'impronta di RNA insufficiente. In tal caso, le impronte di RNA ottenute non rifletteranno completamente le impronte della proteina di interesse. Le impronte di dimensioni 50-200 nt sono raccomandate per il successivo trattamento RNA-Seq. Si noti che lo scenario migliore sarà quello di ottenere un buon segnale nella gamma di dimensioni desiderata, ed è inevitabile avere RNA più lunghi e più brevi anche nelle condizioni ottimali. RIPiT può essere utilizzato anche per ottenere siti di associazione di un singolo RBP. In tal caso, la stessa proteina può essere immunoprecipitata con due diversi anticorpi, prima utilizzando un anticorpo contro un tag di affinità e poi con anticorpi contro la proteina stessa18. Infine, un controllo negativo RIPiT può essere eseguito in parallelo da cellule che esprimono una proteina di controllo marcata FLAG (ad esempio, proteina fluorescente verde) in combinazione con anticorpo contro una proteina contro una proteina non correlata nel secondo IP.

Nonostante i suoi numerosi vantaggi, è importante considerare alcune limitazioni dell'approccio RIPiT e possibili rimedi. Il requisito di elusione dell'affinità dopo la prima purificazione richiede la necessità della fonte biologica per esprimere una proteina marcata. Se un sistema di ricombinazione specifico del sito non è disponibile nella linea cellulare o nell'organismo di interesse, un breve tag di affinità come un tag FLAG (8 aminoacidi) può essere introdotto al locus genico endogeno utilizzando l'approccio di modifica del genoma basato su CRISPR/Cas19. Il tag FLAG è un epitopo ideale per questo approccio, perché l'anticorpo FLAG è adatto per l'eluzione dell'affinità e può sopportare alti punti di forza ionici e lievi condizioni di denatura che possono essere utilizzate in combinazione con il crosslinking della formaldeide. Un'altra limitazione dell'approccio RIPiT è la necessità di un grande input di materiale cellulare. Questo può rimanere inevitabile in una certa misura come solo una piccola percentuale di un RBP probabilmente interagisce con altre proteine nel RNP. Ancora gli approcci di preparazione della libreria migliorati possono aiutare a ridurre il grande requisito di input. Le possibili idee per semplificare ulteriormente questi passaggi includono l'esecuzione della deposforilazione a 3'end dell'RNA e la legatura dell'adattatore sulle perline magnetiche immediatamente dopo il secondo ormeip e prima dell'eluizione finale di RNP. Tale approccio è implementato con successo nelle attuali procedure CLIP-Seq e in una variazione recentemente descritta di RIPiT20. Tali cambiamenti elimineranno anche diverse fasi di purificazione dell'RNA che richiedono molto tempo dalle prime fasi della procedura di preparazione della libreria. Inoltre, a differenza di CLIP, che fornisce una risoluzione del livello nucleotide del sito di collegamento incrociato di un RBP sull'RNA, la risoluzione delle impronte RIPiT rimarrà al livello di decine di nucleotidi. Infine, poiché i RNP possono includere più RBP, i siti di RNA arricchito RIPiT includono una miscela di siti di legame di molti RBP. Poiché le sequenze di consenso vincolate da singoli RBP vengono scoperte a un ritmo in rapido aumento e sono ora prontamente disponibili21,22,23, queste informazioni possono essere sfruttate per deconvolve l'assortimento di siti RBP arricchito nelle uscite RIPiT. Nonostante queste sfide, RIPiT-Seq è una procedura efficace per catturare impronte di RNA di complessi RNP dinamici, eterogenei e persino transitori, che possono fornire informazioni uniche sul funzionamento interno delle macchine RNA che controllano il cellulare funzione.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato sostenuto dalla sovvenzione NIH GM120209 (GS). Gli autori ringraziano oSUCCC Genomics Shared Resources Core per i loro servizi (CCC Support Grant NCI P30 CA16058).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-FLAG Affinity Gel Sigma A2220
ATP, [γ-32P]- 3,000 Ci/mmol 10 mCi/mL EasyTide, 250 µCi PerkinElmer BLU502A250UC
BD Disposable Syringes with Luer-Lok Tips (200) Fisher 14-823-435
Betaine 5M Sigma B0300
biotin-dATP TriLink N-5002
biotin-dCTP Perkin Elmer NEL540001EA
Branson Sonifier, Model SSE-1 Branson
CircLigase I VWR 76081-606 ssDNA ligase I
DMEM, High Glucose ThermoFisher 11995-065
DNA load buffer NEB NEB
Dynabeads Protein A LifeTech 10002D
Flp-In-T-REx 293 Cell Line ThermoFisher R78007
GeneRuler Low Range DNA Ladder ThermoScientific FERSM1203
Hygromycin B ThermoFisher 10687010
Mini-PROTEAN TBE Gel 10 well Bio-Rad 4565013
Mini-PROTEAN TBE-Urea Gel Bio-Rad 4566033
miRCAT-33 adapter 5′-TGGAATTCTCGGGTGCCAAGGddC-3′ Any this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform
Mirus transIT-X2 transfection reagent Mirus MIR 6004
Mth RNA ligase NEB E2610S
PE1.0 5′-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACT
CTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC*T-3′		 Any this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform
PE2.0 5′-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGGTCTC
GGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATC*T-3′		 Any this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform
Phenol/Chloroform/Isoamyl Alcohol (25:24:1, pH 6.7, 100 mLl) Fisher BP1752I-100
Purple Gel Loading Dye (6x) NEB NEB #7025
Q5 DNA Polymerase NEB M0491S/L
RNase I, E. coli, 1,000 U Eppicenter N6901K
SPIN-X column Corning CLS8160-24EA
Streptavidin beads ThermoFisher 60210
Superscript III (SSIII) ThermoScientific 18080044 reverse transcriptase enzyme
SybrGold ThermoFisher S11494 gold nucleic acid gel stain
T4 Polynucleotide Kinase-2500U NEB M0201L
T4RNL2 Tr. K227Q NEB M0351S
Tetracycline Sigma 87128
Thermostable 5´ App DNA/RNA Ligase NEB M0319S
TruSeq_SE1 5′-pGGCACTANNNNNAGATCGGAAGA
GCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTC
TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′		 Any this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform
TruSeq_SE10 5′-pGGTGTTCNNNNNAGATCGGAAG
AGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCT
CTTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′		 Any this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform
TruSeq_SE11 5′-pGGTAAGTNNNNNAGATCGGAA
GAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTC
TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′		 Any this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform
TruSeq_SE12 5′-pGGAGATGNNNNNAGATCGGAAGA
GCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTC
TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′		 Any this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform
TruSeq_SE2 5′-pGGGTAGCNNNNNAGATCGGAAGAG
CGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCT
CTTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′		 Any this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform
TruSeq_SE35′-pGGTCGATNNNNNAGATCGGAAG
AGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCT
CTTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′		 Any this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform
TruSeq_SE4 5′-pGGCCTCGNNNNNAGATCGGAAGA
GCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTC
TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′		 Any this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform
TruSeq_SE5 5′-pGGTGACANNNNNAGATCGGAAGA
GCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTC
TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′		 Any this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform
TruSeq_SE6 5′-pGGTAGACNNNNNAGATCGGAAGAG
CGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTC
CGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′		 Any this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform
TruSeq_SE7 5′-pGGGCCCTNNNNNAGATCGGAAG
AGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCT
TCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′		 Any this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform
TruSeq_SE8 5′-pGGATCGGNNNNNAGATCGGAAGAG
CGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTT
CCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′		 Any this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform
TruSeq_SE9 5′-pGGACTGANNNNNAGATCGGAAGAG
CGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTC
CGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′		 Any this protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform
Typhoon 5 Bimolecular Imager GE Healthcare Life Science 29187191

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References

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Genetica Numero 149 Impronta RNA RIPiT Proteina RNA-legante RBP complessi RNA:proteine RNP
Identificazione delle impronte di RNA:Complessi proteici tramite l'immunoprecipitazioni dell'RNA in Tandem seguita dal sequenziamento (RIPiT-Seq)
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Woodward, L., Gangras, P., Singh, G. … More

Woodward, L., Gangras, P., Singh, G. Identification of Footprints of RNA:Protein Complexes via RNA Immunoprecipitation in Tandem Followed by Sequencing (RIPiT-Seq). J. Vis. Exp. (149), e59913, doi:10.3791/59913 (2019).

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