Summary
Multiplex fluorescerende immunohistochemie is een opkomende technologie die het mogelijk maakt de visualisatie van meerdere celtypen binnen intact formalin-vaste, paraffine ingesloten (FFPE) weefsel. Gepresenteerd zijn richtlijnen voor het waarborgen van een succesvol 7-kleuren multiplex met instructies voor het optimaliseren van antilichamen en reagentia, het voorbereiden van dia's, ontwerp en tips voor het vermijden van veelvoorkomende problemen.
Abstract
Micro-milieuevaluatie van intact weefsel voor analyse van celinfiltratie en ruimtelijke ordening zijn essentieel in het begrijpen van de complexiteit van ziekteprocessen. De in het verleden gebruikte principe technieken omvatten immunohistochemie (IHC) en immunofluorescentie (IF) die visualisatie van cellen mogelijk maken als een momentopname in de tijd met behulp van tussen 1 en 4 markeringen. Beide technieken hebben tekortkomingen, met inbegrip van moeilijkheid kleuring slecht antigene doelen en beperkingen met betrekking tot kruis soorten reactiviteit. IHC is betrouwbaar en reproduceerbaar, maar de aard van de chemie en het vertrouwen op het zichtbare lichtspectrum maakt het mogelijk slechts een paar markers te gebruiken en maakt co-lokalisatie uitdagend. Gebruik van als verbreedt potentiële markers maar meestal vertrouwt op bevroren weefsel als gevolg van de uitgebreide weefsel auto fluorescentie na formaline fixatie. Flow Cytometry, een techniek die gelijktijdige labeling van meerdere epitopes mogelijk maakt, abrogates veel van de tekortkomingen van IF en IHC, echter, de noodzaak om cellen te onderzoeken als een eencellige suspensie verliest de ruimtelijke context van cellen die belangrijke biologische Relaties. Multiplex fluorescerende immunohistochemie (mfIHC) overbrugt deze technologieën waardoor multi-epitope cellulaire fenotyping in formaline vaste paraffine ingebed (FFPE) weefsel met behoud van de algehele micro-omgeving architectuur en ruimtelijke relatie van cellen binnen intact onverstoorde weefsel. Hoge fluorescentie intensiteit fluoroforen die covalent binding aan de weefsel epitoop maakt meerdere toepassingen van primaire antilichamen zonder zorgen van soort specifieke Kruisreactiviteit door secundaire antilichamen. Hoewel deze technologie heeft bewezen betrouwbare en nauwkeurige beelden voor de studie van de ziekte te produceren, het proces van het creëren van een nuttige mfIHC kleuring strategie kan tijdrovend en veeleisende als gevolg van uitgebreide optimalisatie en ontwerp. Om robuuste beelden te maken die nauwkeurige cellulaire interacties in situ vertegenwoordigen en om de optimalisatie periode voorhand matige analyse te verzachten, worden hier gepresenteerd zijn methoden voor de voorbereiding van dia's, het optimaliseren van antilichamen, multiplex ontwerp en fouten vaak aangetroffen tijdens het kleuringsproces.
Introduction
Visualisatie van een intact tumor micro Environment (TME) is essentieel bij het evalueren van niet alleen cellulaire infiltratie in vaste maligniteiten, maar cel naar celinteracties ook. Multiplex fluorescerende immunohistochemie (mfihc) is ontstaan als een effectief hulpmiddel voor multi-antigen fenotyping van cellen in de studie van kanker en geassocieerde ziekten1,2,3,4, 5,6,7. Dit, in combinatie met nieuwe software en Programma's die zijn ontworpen om grote gegevenssets te analyseren, maakt observatie van complexe interacties tussen cellen1,2,4mogelijk. De snelheids beperkende factor bij het verzamelen van gegevens is vaak de kwaliteit van het gekleurd weefsel voorafgaand aan de analyse.
Eerdere technieken die worden gebruikt voor fenotype cellen in de TME omvatten immunohistochemie (IHC), immunofluorescentie (IF) en Flowcytometrie die allemaal significante beperkingen hebben. IHC maakt gebruik van formaline vaste paraffine ingesloten (FFPE) weefsel secties die zijn gedeparaffiniseerd en gerehydrateerd voordat ze worden gekleurd door meestal één antilichaam. Gebruik van een mierikswortelperoxidase (HRP) gebonden secundair antilichaam en een chemische reactie maakt visualisatie van een enkele antigene epitoop8. Hoewel IHC betrouwbaar is en wordt uitgevoerd op FFPE-weefsel dat gemakkelijk te werken is, betekent beperkingen voor het zichtbare lichtspectrum dat slechts één of twee markeringen betrouwbaar kunnen worden onderscheiden en colokalisatie van antigenen heel moeilijk8. Een manier om de beschikbare markers uit te breiden en daarom antigenen die op een enkele sectie kunnen worden geproteand, is om te veranderen in fluorescentie die het mogelijk maakt om een breder bereik van het visuele spectrum te gebruiken. Voor als, bevroren of FFPE weefsel wordt overgebracht op dia's en antilichamen gebruikt die zijn geconjugeerd aan verschillende fluor Foren. Terwijl dit verhoogt het aantal antigenen die kunnen worden geprobed, er zijn verschillende belangrijke beperkingen. Ten eerste, omdat elk antilichaam meestal slechts één de heeft bevestigd, is de helderheid vaak niet sterk genoeg om weefsel autofluorescentie te overwinnen. Het is om deze reden, de meeste als wordt uitgevoerd op bevroren weefsel dat is duur om op te slaan en moeilijk om mee te werken. Een beperkt aantal fluorescerende Tags zijn beschikbaar voor gebruik als gevolg van spectrale overlapping en kruis soorten reactiviteit, vooral wanneer niet-geconjugeerde antilichamen worden gebruikt. Flow cytometrie, dat bestaat uit de verwerking van vers weefsel tot een enkele celsuspensie en labeling met fluorescerende antilichamen is de gouden standaard voor immunofenotypering voor decennia9,10. Een voordeel van flow cytometrie is de mogelijkheid om meerdere antilichamen zonder bezorgdheid te labelen voor soorten Kruisreactiviteit, omdat de meeste zijn geconjugeerd. Omdat de cellen worden "gevisualiseerd" door een machine en geen menselijke ogen, er zijn veel meer fluor Foren beschikbaar, maar dit komt met een kostprijs. De compensatie moet handmatig worden uitgevoerd, waardoor de resultaten van valse positieve en negatieve populaties aanzienlijk kunnen worden gewijzigd. De meest significante beperking van flow cytometrie is dat weefsel architectuur en vervolgens alle ruimtelijke informatie verloren gaat door de noodzaak voor de schorsing van de enkelvoudige cellen.
Multiplex fluorescerende immunohistochemie (mfihc) met behulp van een geautomatiseerde fluorescerende Microscoop in combinatie met nieuwe software combineert de voordelen van IHC, if en flow flowcytometrieonderzoeken door het toestaan van multi-antigen weefsel kleuring met signaalversterking en behoud van ruimtelijke relaties zonder de noodzaak van compensatie. FFPE weefsel wordt geplaatst op geladen glijbanen die, na antigeen opvraging, een ronde van primaire antilichamen ondergaan op het doel antigeen van belang, gevolgd door een secundair antilichaam met een HRP chemisch plaatje, vergelijkbaar met IHC. Na de plaatsing van het secundaire antilichaam resulteert een HRP-specifieke reactie in een covalente binding van de aan de epitoop van belang11. Zodra het weefsel is gelabeld, een andere ronde van de verwarming van de dia's is voltooid het verwijderen van de eerder toegepaste primaire en secundaire antilichaam complex verlaten alleen de fluorescerende tag gebonden aan de weefsel epitoop11. Dit maakt het mogelijk om meerdere antilichamen van elke soort opnieuw toe te passen zonder zorgen voor Kruisreactiviteit11,12. Om de behoefte aan handmatige compensatie van meerdere fluorescerende kleurstoffen te minimaliseren, wordt een verzameling van fluor Foren met weinig spectrale overlap met inbegrip van een nucleaire Counter vlek gebruikt om de mfIHC te voltooien. Om rekening te houden met de autofluorescentie die met ffpe-weefsel is aangetroffen, trekt de software de autofluorescentie van de uiteindelijke afbeelding af met behulp van een afbeelding van een blanco dia die mogelijk is vanwege de sterkte van antigeen specifieke fluorescentie na de signaalversterking. Met behulp van nieuwe Programma's die zijn ontworpen voor grote gegevenssets, kunnen cellocaties worden geïdentificeerd en geanalyseerd voor ruimtelijke context1,2,4. De meest significante beperking van deze techniek is de optimalisatie tijd. Een gedetailleerde methodologie met instructies voor experimentele ontwerp-en kleurings-en beeldvormings strategie vindt u hier. mfIHC is nuttig voor laboratoria die momenteel geen geoptimaliseerd geautomatiseerd kleurings systeem hebben dat de ruimtelijke context van cel-naar-celinteracties in intact FFPE-weefsel met behulp van de handmatige techniek beter zou willen begrijpen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Al het werk is goedgekeurd door de Universiteit van Michigan interne Review Board.
1. optimaliseren van primaire antilichamen en Slide voorbereiding
- Bepaal de ideale concentratie van antilichamen voor multiplex met conventionele IHC.
- Test de antilichamen voor de multiplex door handmatige conventionele immunohistochemie (IHC)13.
- Gebruik specifieke weefsels die een overvloedig celtype hebben voor elke geteste antilichaam, zoals het gebruik van tonsillen weefsel voor CD3 antilichaam testen.
- Gebruik de referentie concentratie voor IHC aanbevolen door het bedrijf en voltooi vervolgens IHC met antilichaamconcentraties in de aanbevolen concentraties, evenals concentraties boven en onder de aanbevolen concentratie.
- Bereid formaline vast paraffine ingesloten weefsel op dia's.
- Met behulp van een microtoom, snijd blokken van FFPE weefsel met een dikte tussen 4 en 6 μm en toepassen op opgeladen dia's.
Opmerking: het gebruik van gedistilleerd water zorgt voor de juiste weefsel montage en hechting in de multiplex. - Plaats de glijbanen plat, weefsel zijde omhoog, en laat drogen bij 37 °C 's nachts.
- Sla dia's op in een Slide Box weg van extreme temperatuur tot klaar om de multiplex te voltooien.
- Met behulp van een microtoom, snijd blokken van FFPE weefsel met een dikte tussen 4 en 6 μm en toepassen op opgeladen dia's.
2. algemene kleurings methode
- Bereiding van de oplossingen voor het ophalen van was en antigeen
- Bereid de wasoplossing van 0,1% TBST door het mengen van 9 L gedeïoniseerd water, 1 L tris gebufferde zout (TBS) en 10 mL Polysorbaat 20.
- Bereid beide antigeen oplossingen voor het ophalen (pH 6 en pH 9; Tabel met materialen) door te verdunen naar 1x met gedeïoniseerd water.
- Deparaffinisatie en rehydratatie
- Bakken glijbanen, plat liggen, weefsel zijde omhoog bij 60 °C gedurende 1 uur in een hybridisatie oven1. Verwijder de glaasjes uit de oven en laat minstens 5 − 10 min afkoelen en plaats in een verticaal schuif rek.
- Behandel de dia's in de volgende oplossingen opeenvolgend: xyleen in drievultaat, gevolgd door een enkelvoudige behandeling van 100% ethanol, 95% ethanol en ten slotte 70% ethanol gedurende 10 min, elk met een dia-Kleurset1.
- Was het rek van de glijbanen gedurende 2 minuten met gedeïoniseerd water door onderdompeling in een plastic glijbaan, gevolgd door fixatie door onderdompeling in een plastic glijbaan gevuld met neutrale gebufferde formaline gedurende 30 min13. Was de glaasjes in gedeïoniseerd water gedurende 2 min en ga verder naar antigeen-opvraging.
- Antigeen-opvraging
- Plaats het rek van de glijbanen in een hittebestendige doos gevuld met de interne lijn (ongeveer 300 mL) met pH 6 of pH 9 antigeen ophaalbuffer.
Opmerking: antigeen-ophaal buffer kan ofwel pH 6 of pH 9 zijn, die mogelijk moet worden geoptimaliseerd per epitope. Begin echter met het gebruik van pH 9 voor antilichamen die binden aan nucleaire epitopen en pH 6 voor alle andere antilichamen. - Bedek de doos met plastic folie en gebruik een rubberen band om te beveiligen. Plaats de doos in de magnetron aan de rand van de roterende plaat (magnetron moet worden uitgerust met inverter technologie voor zelfs verwarming). Verwarm de dia's voor 45 s bij 100% vermogen gevolgd door 15 min bij 20% vermogen13.
Opmerking: microgolf behandeling kan optimalisatie nodig hebben, afhankelijk van de gebruikte magnetron. - Laat de lantaarnplaten ongeveer 15 − 20 minuten afkoelen.
- Plaats het rek van de glijbanen in een hittebestendige doos gevuld met de interne lijn (ongeveer 300 mL) met pH 6 of pH 9 antigeen ophaalbuffer.
- Bereid werkoplossingen voor van antilichamen en fluoroforen terwijl het koel glijdt.
- Bereid het primaire antilichaam verdunningsmiddel door 0,5 g boviene serumalbumine korrels op te lossen in 50 mL TBST. U ook 50 mL 1x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) gebruiken om granules op te lossen.
- Zorg ervoor dat elke primaire antilichaam-werkoplossing de geoptimaliseerde concentratie is, bepaald in punt 1, in het primaire antilichaam verdunningsmiddel. Geschatte ongeveer 200 μL per dia.
- Bereid de de-werkoplossing door elke de in het de verdunningsmiddel te verdunen met een concentratie van 1:100.
Opmerking: dit moet mogelijk worden geoptimaliseerd, afhankelijk van het antilichaam. Geschatte ongeveer 100 μL per dia. - Bereid op de laatste dag van de kleuring de 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) werkoplossing door 3 druppels DAPI toe te voegen in 1 mL TBST.
- Glij-kleuring (wassen en blokkeren)
- Verwijder de doos uit de magnetron na het koelen en opstijgen van de plastic wrap, was de dia's met gedeïoniseerd water gedurende 2 minuten, gevolgd door een 2 min wassen in een plastic Slide box gevuld TBST13.
- Na het drogen van elke glijbaan rond het weefsel met een delicate taak veeg voorzichtig om het weefsel niet te laten uitdrogen, rond de buitenkant van het weefsel te traceren met behulp van een hydrofobe barrière pen. Raak het weefsel niet aan met het delicate taak doekje of de pen.
- Plaats elke dia in de bevoficeerde kamer en voeg een blokkerende oplossing (ongeveer 4 druppels) toe aan het weefsel. Incuberen gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur (RT).
- Slide kleuring (primair antilichaam toepassing)
- Neem elke dia en verwijder de blokkerende oplossing door te tikken op de zijkant van de dia op een stapel papieren handdoeken en met behulp van een delicate taak wissen om overtollige blokkerende agent van rond het weefsel te verwijderen.
- Leg de schuif terug in de bevoficeerde kamer en voeg ongeveer 200 μL van het werkende primaire antilichaam toe. Incuberen in de bevoficeerde kamer gedurende 1 uur bij RT.
- Wassen met TBST voor 2 min door onderdompeling in drievoud13.
Opmerking: na elke wasstap zorgt het wijzigen van de TBST voor een schoner beeld.
- Slide kleuring (secundair antilichaam toepassing)
- DEP de resterende TBST van elke dia af en breng ongeveer 3 tot 4 druppels secundair antilichaam aan (mengsel van secundaire HRP-geconjugeerde antilichamen met konijn en muis). Inincuberen gedurende 10 min in de bevoficeerde kamer op RT13.
Opmerking: als u van plan bent een primair antilichaam te gebruiken dat een secundair antilichaam nodig heeft, anders dan muis of konijn, of ervoor kiest om een alternatief secundair antilichaam te gebruiken, breng dan de juiste HRP geconjugeerde op de dia's aan en incuberen bij RT gedurende 45 min. optimalisatie van Er kan een incubatietijd nodig zijn voor de alternatieve secundaire14. - Na incubatie, wassen met TBST voor 2 min in drievat13.
- DEP de resterende TBST van elke dia af en breng ongeveer 3 tot 4 druppels secundair antilichaam aan (mengsel van secundaire HRP-geconjugeerde antilichamen met konijn en muis). Inincuberen gedurende 10 min in de bevoficeerde kamer op RT13.
- Slide kleuring (fluorophore toepassing)
- Breng ongeveer 100 μL van de werkoplossing de aan en incubeer in de bevoficeerde kamer bij RT gedurende 10 min.13.
- Wassen met TBST voor 2 min in drievat13.
- Verwijdering van antilichamen
- Microwave glijbanen (45 s bij 100% dan 15 min bij 20%) in de hittebestendige doos (zie stap 2.3.2) voor het verwijderen van antilichamen13,14.
Opmerking: Hiermee is een ronde van de multiplex voltooid. Dit is het enige punt waarop het protocol kan worden onderbroken. Om het protocol te onderbreken, laat u de dia's in de buffer voor het ophalen van het antigeen overnachten bij kamertemperatuur.
- Microwave glijbanen (45 s bij 100% dan 15 min bij 20%) in de hittebestendige doos (zie stap 2.3.2) voor het verwijderen van antilichamen13,14.
- Verdere kleurings rondes voortzetten. Herhaal stap 2.5.1 − 2.9.1 voor de rest van de antilichamen-fluorophore paren. Nadat alle antilichamen en fluor Foren zijn gebruikt, gaat u verder met paragraaf 2,11.
- DAPI-toepassing en-montage
- Na de laatste kleurings ronde in de multiplex, verwijder de laatste antilichaam toepassing met antigeen opvraging oplossing pH 613. Wassen met gedeïoniseerd water gevolgd door TBST voor 2 min elke13.
- Breng ongeveer 150 μL van de werkende DAPI-oplossing aan op dia's en incuberen in de bevoficeerde kamer gedurende 10 minuten bij RT1.
- Was met TBST voor ongeveer 30 s en monteer de dekstroken met een anti fade mountant. Breng Clear vingernagel Polish aan op de vier hoeken van de Afdeklijst zodra de bevestigings media zijn gedroogd om de Afdeklijst te beveiligen (optioneel).
3. Details voor bibliotheek, monoplexen en multiplex
- Kies dia's voor het bouwen van een de Library.
- Voor een 7-kleuren multiplex verzamelen 7 immuun cel rijke weefsel dia's (dat wil zeggen, tonsil, milt, enz.) voor de bibliotheek.
Opmerking: Kies besturings dia's die moeten worden gebruikt voor een de-bibliotheek met elke dia die elke unieke de vertegenwoordigt die in de multiplex wordt gebruikt. Controle dia's moeten een overvloedige epitoop van keuze hebben en kunnen hetzelfde type weefsel voor elke fluorophore.
- Voor een 7-kleuren multiplex verzamelen 7 immuun cel rijke weefsel dia's (dat wil zeggen, tonsil, milt, enz.) voor de bibliotheek.
- Vlek-en afbeeldingsbibliotheek dia's voor gebruik met monoplexes en multiplexen.
- Volg de stappen 2.1 − 2.9.1 met behulp van de besturings dia's en besturings weefsel dia's van keuze. Plaats een andere de op elke dia met een concentratie van 1:100; Eén dia mag alleen DAPI bevatten.
- Ga verder met paragraaf 2,11 behalve DAPI-kleuring weglaten en gebruik in plaats daarvan TBST en Mount zoals beschreven.
- Na het laten drogen van de dia's 's nachts, afbeelding met alle kanalen DAPI, CY3, CY5, CY7, Texas rood, Semiconductor Quantum dots, en fluoresceïne isothiocyanaten (FITC) instellen van de blootstelling aan 250 MS met de verzadiging bescherming functie1.
Opmerking: de belichtingstijden kunnen worden ingesteld op 50 − 250 MS13. - Upload de bibliotheek Afbeeldingen naar de software en gebruik deze in de analyse van de monoplexes en multiplex.
- Kies dia's voor monoplexen.
- Kies besturings dia's met een overvloedige belichamer keuze op basis van geoptimaliseerde antilichamen (sectie 1). Voor elke ronde van kleuring moet worden uitgevoerd in de multiplex, selecteert u dat aantal besturingselementen voor het maken van monoplexen.
Opmerking: het doel van de monoplex is het bepalen van de beste positie (orde) voor elk antilichaam dat in de multiplex moet worden gebruikt.
- Kies besturings dia's met een overvloedige belichamer keuze op basis van geoptimaliseerde antilichamen (sectie 1). Voor elke ronde van kleuring moet worden uitgevoerd in de multiplex, selecteert u dat aantal besturingselementen voor het maken van monoplexen.
- Vlek monoplexes.
- Volg de paragrafen 2.1 − 2.11 met behulp van het primaire antilichaam op een andere volgorde (positie) voor elk van de dia's. Elke dia moet slechts één primair antilichaam hebben dat wordt toegepast op een andere volgorde (positie) dan de andere dia's.
Opmerking: voor elke dia waar de ronde geen primair antilichaam of de aanroept, gebruikt u in plaats daarvan het verdunningsmiddel primair antilichaam en de verdunent13.
- Volg de paragrafen 2.1 − 2.11 met behulp van het primaire antilichaam op een andere volgorde (positie) voor elk van de dia's. Elke dia moet slechts één primair antilichaam hebben dat wordt toegepast op een andere volgorde (positie) dan de andere dia's.
- Afbeelding schuift en analyseert de monoplex.
- Met behulp van de Microscoop en het instellen van de belichtingstijd tot 250 ms voor alle kanalen vast te leggen elke afbeelding met behulp van DAPI om scherp te stellen.
Opmerking: de belichtingstijden kunnen worden ingesteld op 50 − 250 MS14. - Met behulp van de analyse software evalueren elke monoplex Slide door te kijken naar de fluorescerende intensiteit van de bevlekt marker.
- Vergelijk deze intensiteit met de achtergrond. Als het ten minste 5 − 10 keer hoger is dan de achtergrond, is de positie van die glijbaan een optimale positie om te gebruiken in de uiteindelijke multiplex.
- Met behulp van de Microscoop en het instellen van de belichtingstijd tot 250 ms voor alle kanalen vast te leggen elke afbeelding met behulp van DAPI om scherp te stellen.
- Kies dia's voor de multiplex.
- Kies de dia's van belang en voeg een extra dia toe om te worden gebruikt als een lege dia voor het aftrekken van autofluorescentie na kleuring en beeldvorming.
- Vlekken op de multiplex.
- Op basis van de monoplex resultaten, kies de juiste volgorde (posities) voor elk antilichaam op basis van stap 3.5.3. Elke de aan een antilichaam toewijzen.
Opmerking: dit kan optimalisatie nodig hebben; echter, van plan om heldere antilichamen te gebruiken voor minder overvloedige markers1, co-localiserende antilichamen moeten worden geëvenaard met fluoroforen op Far spectrums van elkaar13, en fluoroforen met het spectrum 540 en 570 mag niet worden co-gelokaliseerd due naar spectrale overlap problemen1. - Ga verder met de paragrafen 2.1 − 2.11 om ervoor te zorgen dat de blanco Slide geen primair antilichaam, de of DAPI krijgt, gebruik in plaats daarvan het verdunningsmiddel, de diluent en TBST op zijn plaats.
- Op basis van de monoplex resultaten, kies de juiste volgorde (posities) voor elk antilichaam op basis van stap 3.5.3. Elke de aan een antilichaam toewijzen.
- Beeld multiplex en analyse voor de integriteit van de kleuring
- Met behulp van de Microscoop en het instellen van de belichtingstijd tot 250 ms voor alle kanalen, vastleggen van elke afbeelding met behulp van DAPI om scherp te stellen.
- Met behulp van de analyse software (tabel met materialen), Evalueer elke multiplex door fluorescerende False kleur.
Opmerking: een duidelijk beeld moet elke marker duidelijk aantonen. Als een markering diffuus en korrelig uitziet of niet bestaat, is het waarschijnlijk dat de marker niet werkte en opnieuw moet worden geoptimaliseerd. - Evalueer met behulp van de analyse software elke multiplex per pathologie-weergave. Pathologie-weergave zal de specificiteit van elke marker bevestigen. Vergelijk met IHC eerder geoptimaliseerd (paragraaf 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het totale proces van het verkrijgen van een multiplex test met 7 kleuren volgt een repetitief patroon. Figuur 1 beschrijft het proces in een diagrammatische vorm. Zodra de glaasjes worden geknipt en gedroogd of van het laboratorium worden ontvangen en in een hybridisatie oven bij 60 °C gedurende 1 uur worden gebakken, gaat u verder naar deparaffinisatie en rehydratatie, herstelt u de glaasjes in formaline opnieuw gevolgd door antigeen-ophaling. Elke ronde van multiplexing begint bij het ophalen van antigeen en eindigt bij het verwijderen van antilichamen (Figuur 1).
Optimalisatie van elke stap in het proces is van het allergrootste belang om een duidelijk en bruikbaar beeld te bereiken. Antilichamen moeten door IHC eerst worden getest met behulp van antigeen-ophaalbuffers met pH 6 en pH 9 voor elk antilichaam om te visualiseren welke antigeen-ophaal buffer het beste werkt met dat specifieke antilichaam. In het algemeen reageren nucleaire doelwitten op het ophalen van antigeen met buffer pH 9. FOXP3 werkt bijvoorbeeld het beste wanneer de buffer voor het ophalen van antigeen van pH 9 wordt gebruikt in tegenstelling tot CD3 die het beste werkt met een buffer voor het ophalen van antigeen (pH 6). Afbeeldingen uit het IHC-proces moeten worden gebruikt om de specificiteit van de multiplex-analyse te valideren.
Een monoplex is nodig om de volgorde van elk antilichaam in de multiplex te bepalen. Bij gebruik van een 4-of een 7-kleurenkit, zal elk antilichaam een voorkeursvolgorde hebben in de array. Voor het aantal antilichamen dat zal worden gebruikt, verzamelen van de juiste controle dia's (d.w.z. voor een 7-kleuren multiplex waarbij één kleur DAPI is, selecteer 6 Weefselspecifieke representatieve controle dia's voor de 6 andere fluor Foren). Figuur 2 A-C is een schematische weergave van een monoplex assay met 3 glaasjes met ffpe colonkanker weefsel. Elke dia heeft FOXP3 in een andere positie in de array met behulp van de 570 als zijn tag. DAPI wordt gebruikt als een tegen vlek om kernen adequaat te visualiseren. In Figuur 3worden representatieve beelden van een monoplex en een multiplex met VARIËRENDE FOXP3 positie getoond. In Figuur 3A, B, waar FOXP3 zich op de derde positie bevindt (overeenkomend met de in figuur 2cvermelde volgorde), wordt specifieke en robuuste kleuring van FOXP3 (rood) gezien zoals blijkt uit heldere nucleaire kleuring Figuur 3a en co-lokalisatie met CD3 Figuur 3b. De intensiteit van het de signaal bevestigt de specificiteit van FOXP3 zonder niet-specifieke kleuring elders in de weefsel afbeelding 3a. In figuur 3c, waarbij FOXP3 zich op de eerste positie bevindt (overeenkomend met de volgorde in Figuur 2a), is er sprake van niet-specifieke kleuring van FOXP3. Korrelige diffuse gebieden van rood bedekken het grootste deel van de glijbaan en de fluorescentie intensiteit in deze gebieden zijn minder dan 1. Poging om een multiplex te doen zonder het voltooien van een monoplex eerst om de volgorde van de kleuring resultaten te testen in een soortgelijk resultaat en zal afval reagentia. Een andere kritieke stap die niet over het hoofd kan worden gezien in het multiplex proces is DAPI-kleuring. Een werkende DAPI-contra vlek is de basis voor celidentificatie en verdere ruimtelijke analyse met behulp van de analyse software. Een belangrijk contrast kan worden gezien in de samengestelde afbeelding met werkende DAPI (blauw) in figuur 3e en in de niet-werkende DAPI in figuur 3F. De afbeelding in figuur 3F kon niet worden gebruikt om cellen in de analyse software te identificeren. Een poging om de multiplex en de weefsel analyse te redden, de dekglaasje misschien verwijderd door het weken van de glijbaan in TBST gevolgd door een Microwaving stap in pH 6 antigeen retrieval buffer met een extra toepassing van DAPI.
Zodra de monoplex assay is voltooid en optimale antilichaam volgorde is bevestigd, kan een multiplex strategie worden geconstrueerd Figuur 4. Voor elk doel moet een andere de worden gekozen. Het aantal geassocieerd met elke de vertegenwoordigt ruwweg de spectrale fluorescerende golflengte die wordt uitgezonden na excitatie, vergelijkbaar met Flow cytometrie. Zorg moet worden genomen bij het afstemmen van voorgestelde antilichamen met fluoroforen om te beperken van spectrale overlapping en potentiële bloeden van markers. Een goede strategie is om golflengten ver van elkaar te kiezen voor het co-localiseren van antilichamen tegen overmatige spectrale overlapping, wat een helder beeld en betrouwbaarder fenotyping13oplevert. In de weergegeven multiplex strategie (Figuur 4) wordt CD8 bijvoorbeeld gecombineerd met de 570 terwijl CD3 is gekoppeld met de 520. Men moet het gebruik van de 540 en 570 in co-gelokaliseerde doelen vermijden, aangezien deze de neiging hebben om de meest ondiscriminerende te zijn en de resultaten kunnen aantasten. Fluorophore 620 neigt zeer helder te zijn en moet worden gebruikt voor antilichamen die niet overvloedig in het weefsel aanwezig zijn. Een recente bibliotheek die wordt gebruikt als referentie voor elke de helpt ook bij het verminderen van spectrale overlap van fluor Foren. Een lege Slide die alle rondes antigeen ophaling ondergaat, is nodig om de autofluorescentie extractie van het samengestelde beeld te waarborgen. Deze lege glijbaan zal dezelfde behandeling ondergaan als de multiplex glaasjes, behalve in plaats van een werkend primair antilichaam en de, het antilichaam verdunningsmiddel en het de verdunningsmiddel zullen respectievelijk figuur 4bworden gebruikt.
Om ervoor te zorgen dat het multiplex-ontwerp goed werkte en de markeringen in het samengestelde beeld specifiek zijn, gebruikt u het "pathologie-beeld" in combinatie met de insteloptie "brightfield" met behulp van Microscoop-software die een faux IHC-afbeelding creëert die vervolgens kan worden in vergelijking met de vorige IHC-tests die in punt 1 zijn besproken. Helaas, mooie samengestelde afbeeldingen niet noodzakelijkerwijs een nauwkeurige vlek weerspiegelen en dit is een belangrijke stap naar kwaliteitscontrole van het proces en voorkomen van vals positieve resultaten. Afbeelding 5a toont een samengestelde afbeelding zonder initiële bezorgdheid. CD3 wordt gevisualiseerd en toont specifieke kleuring (groen) en wordt bevestigd door het pathologische brightfield-beeld in Figuur 5b. CD163 (oranje) wordt gezien in het samengestelde beeld (figuur 5a); bij de beoordeling van de pathologie brightfield View van CD163 (figuur 5c) is het antilichaam echter niet-specifiek. Een voorbeeld van een optimaal multiplex beeld met specifieke kleuring wordt gedemonstreerd in een samengestelde afbeelding (figuur 5d). De specificiteit van CD3 en CD163 wordt bevestigd met behulp van de pathologie brightfield View (respectievelijkfiguur 5e en figuur 5F) en vergelijkt gunstig met eerdere IHC-assays die met deze antilichamen werden uitgevoerd (niet weergegeven).
Figuur 1: kleurings diagram.
Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Monoplex ontwikkeling.
A) Colon kanker SCHUIFT met FOXP3 op positie 1. B) Colon kanker SCHUIFT met FOXP3 op positie 2. C) Colon kanker SCHUIFT met FOXP3 op positie 3. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: successen en valkuilen van monoplex en multiplex.
A) monoplex assay van primaire colonkanker met FOXP3 op positie 3, weergegeven TL-intensiteits label. B) Multiplex test van primaire colonkanker met FOXP3 op positie 3 en CD3 op positie 2. C) monoplex assay van primaire colonkanker met FOXP3 op positie 1, fluorescerende intensiteits label afgebeeld. D) Multiplex test van primaire colonkanker met FOXP3 op positie 1 en CD3 op positie 2. E) Multiplex test van primaire colonkanker met de volgorde van antilichamen als volgt: CD8 (geel), CD3 (groen), CD163 (oranje), pancytokeratin (wit), PD-L1 (magenta), FOXP3 (rood), werkend DAPI (blauw). F) Multiplex test van primaire colonkanker met de volgorde van antilichamen als volgt: CD8 (geel), CD3 (groen), CD163 (oranje), pancytokeratin (wit), PD-L1 (magenta), FOXP3 (rood), niet-werkende DAPI (blauw). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: multiplex ontwikkeling.
(A) Multiplex Slide van colonkanker in een 7-kleuren multiplex. (B) lege dia in een 7-kleuren multiplex met behulp van colonkanker weefsel. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: het analyseren van specificiteit van een 7-kleuren multiplex.
A) Multiplex composiet beeld met antilichamen als volgt: CD8 (geel), CD3 (groen), CD163 (oranje), pancytokeratin (wit), Ki67 (rood), DAPI (blauw). (B) pathologie brightfield-weergave van afbeelding in paneel A op CD3 alleen weergave. (C) pathologie brightfield-weergave van afbeelding in paneel A op CD163 alleen weergave. D) Multiplex composiet beeld met antilichamen als hieronder: CD8 (geel), CD3 (groen), CD163 (oranje), pancytokeratin (wit), PD-L1 (magenta), FOXP3 (rood), DAPI (blauw). (E) pathologie brightfield-weergave van afbeelding in paneel D op CD3 alleen weergave. (F) pathologie brightfield-weergave van afbeelding in paneel D op CD163 alleen weergave. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Intact weefsel specimens van solide tumor biopsie en chirurgische resectie blijven belangrijke diagnostische en voorspellende instrumenten voor ziekte-analyse, evenals de prognose van de patiënt. Multiplex fluorescerende immunohistochemie (mfIHC) is een nieuwe techniek die de voordelen van immunohistochemie (IHC), immunofluorescentie (IF) en Flowcytometrie combineert. Eerdere methoden voor sonde cellen in situ hebben toegestaan voor de evaluatie van cel-naar-cel regelingen in een weefsel omgeving8, echter, het lage aantal epitopen dat kan worden geprobed beperkt complexe analyse. Flow cytometrie, hoewel nuttig bij het analyseren van veel celtypen in een specimen, verliest ruimtelijke context door de voorbereiding van monsters als een enkele cel schorsing9,10. mfihc overbrugt deze technieken door het behoud van de ruimtelijke context van de cellulaire micro omgeving en het verhogen van het aantal epitopen dat kan worden gelabeld tijdens het versterken van het signaal per gelabelde epitoop11. Eerder onderzoek heeft gebruikt mfihc voor fenotyping het cellulaire infiltreren in kanker en niet-kanker weefsel specimens1,2,3,4,5,15. Analyse van de post-image is ook gebruikt voor het analyseren van de ruimtelijke relaties van cellen en structuren binnen het weefsel micro omgeving1,2,4. Voor een betrouwbare analyse moet eerst een specifiek en nauwkeurig beeld worden geproduceerd. De manuele kleuringstechniek, in tegenstelling tot een geautomatiseerd kleurings systeem, maakt het mogelijk om kleinere en kostenbewuste laboratoria toegang te krijgen tot deze technologie. Optimalisatie tijd en kleurings tijd behoren tot de grootste barrières voor het bereiken van een betrouwbaar beeld voor verdere ruimtelijke analyse.
Verschillende algemene regels verbeteren de kans op een geslaagde generatie van een betrouwbare samengestelde multiplex-installatiekopie en bespaart tijd en middelen. Antilichamen die in de multiplex moeten worden gebruikt, moeten worden gekozen op basis van succes met handmatige conventionele IHC. Voor IHC moeten antigeen-ophaalbuffers met pH 6 en pH 9 worden gebruikt om het geschikte antigeen-ophaalproces voor gebruik in de multiplex te onderzoeken. Monoplex ontwikkeling is noodzakelijk om de plaatsing van antilichamen in het multiplexing protocol te identificeren. De reden hiervoor is ingewikkeld en varieert tussen weefsel specimens en epitopen. In sommige gevallen, de epitoop kan degraderen met meerdere Microwaving stappen en marker visualisatie gaat verloren, zoals vaak het geval is met CD3. FOXP3, echter, wordt helderder met meer Microwaving stappen en is nauwelijks zichtbaar als geplaatst op de eerste of tweede ronde van multiplex13,14.
Het kleuringsproces begint met FFPE-weefsel dat op opgeladen dia's wordt gesneden. Het eerste probleem dat kan worden aangetroffen is het weefsel vallen van de glijbaan na Microwaving. Wanneer opgeladen dia's worden niet gebruikt, de hechting van weefsel op het glasoppervlak is beperkt en het weefsel zal ofwel overmatig vouwen of kan glijden volledig. Om er zeker van te zijn dat het weefsel tijdens het kleuringsproces aan de glaasjes hecht, worden verschillende technieken uitgevoerd. Eerst terwijl het snijden van de blokken op dia's, de zuiverste vorm van water werkt het beste. Voor sommige laboratoria kan gedeïoniseerd water voldoende zijn, maar gedistilleerd water heeft het beste gewerkt. De glaasjes moeten vlak na het snijden op een nacht van 37 °C worden gedroogd. Om de hechting verder te verzekeren, worden de glaasjes vervolgens in een hybridisatie oven geplaatst en plat op 60 °C gebakken vlak vóór gebruik. Hoewel formaline fixatie al is opgetreden tijdens het initiële weefsel voorbereidingsproces, het plaatsen van de glaasjes in neutraal gebufferde formaline gedurende 30 minuten na de deparaffinisatie en het rehydratatie proces verbetert de structurele integriteit van de gemonteerde weefsel1,13.
Het handmatige kleuringsproces kan tot drie, 8-uurs dagen duren, afhankelijk van het aantal gebruikte antilichamen. Het vermijden van valkuilen is essentieel in het besparen van tijd en het sparen van reagentia. De eerste veelvoorkomende fout treedt vaak op bij de bereiding van het reagens. Water verschilt tussen laboratoria en kan het enige verschil in resultaten van de ene lab naar de volgende. Het gebruik van dezelfde evenals een schone waterbron voor alle reacties en reagentia zorgt voor een consistent resultaat. De antilichamen, blokkerende oplossing en fluoroforen werken het beste bij kamertemperatuur. Om valkuilen in het reagens en de voorbereiding van de werkoplossing te vermijden, gebruikt u hetzelfde water voor alle reagentia. Gebruik ook alle werkoplossingen en reagentia bij kamertemperatuur.
Het oplossen van problemen met mfIHC is belangrijk en het naleven van strenge laboratorium richtlijnen is cruciaal om verontreiniging van componenten en/of operatorfouten te beperken. De productie van suboptimale beelden zal de resultaten scheeftrekken en leiden tot vals-positieve en negatieve celpopulaties die negatieve gevolgen kunnen hebben voor gegevens. Omdat de uiteindelijke analyse meestal computer gegenereerde fenotypes bevat op basis van machine learning, kunnen kleine fouten in vlekken worden vergroot om de volledige gegevensset te beïnvloeden. Bijvoorbeeld, hoewel alle vlekken perfect werken, een fout of omissie van DAPI zal toekomstige celsegmentatie voorkomen en tellen renderen van het experiment nutteloos. Analyse software gebruikt DAPI-kleuring niet alleen om cellen te identificeren, maar wijst x-en y-coördinaten aan elke cel en als de multiplex gedimde, slecht omgeschreven of diffuse DAPI-kleuring heeft, kan de afbeelding niet verder worden gebruikt en moet de multiplex opnieuw worden uitgevoerd of geprobeerd redding en herkleuring van DAPI. Het gebruik van softwarecomponenten zoals de pathologie en brightfield-views zal het vertrouwen in gevoeligheid en specificiteit vroeg in het optimalisatieproces vergroten en fouten vroegtijdig in het multiplex proces voorkomen.
De modificerende aspecten van het beeldvormings proces kunnen ook helpen bij het optimaliseren van afbeeldingen. Bijvoorbeeld, het nemen van een afbeelding met behulp van DAPI als de visuele hulp om scherp te stellen helpt om wazige afbeeldingen te voorkomen. Het toevoegen van de nieuw gemaakte de Library aan de software zorgt voor een schoon beeld en minder spectrale overlapping van elke de tijdens de analyse fase en het gebruik van de lege Slide om de autofluorescentie te extraheren intensiveert de markers en verbetert het beeld Kwaliteit.
Het gebruik van weefsel specimens is en blijft een essentieel hulpmiddel bij het onderzoeken van de pathofysiologie van de ziekte. Opkomende technologie heeft ons begrip van cel-naar-cel interacties vergroot en mfIHC is een veelbelovende nieuwe speler. Optimalisatie en nauwkeurigheid tijdens het kleuringsproces in deze techniek is van het allergrootste belang voor een goede benutting en verdere analyse van de interacties tussen cellen en cellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs willen Ed stack, eerder van Perkin Elmer, bedanken voor zijn hulp bij het instellen en optimaliseren van de originele multiplex kleuring. De auteurs willen ook Kristen Schmidt van Akoya Biosciences bedanken voor tips met behulp van de analyse software. Het onderzoek dat in deze uitgave werd gerapporteerd, werd gesteund door de National Cancer Institutes of Health onder het Awardnummer P30CA046592, K08CA201581 (tlf), K08CA234222 (JS), R01CA15158807 (mpm), RSG1417301CSM (mpm), R01CA19807403 (mpm), U01CA22414501 (mpm, HC), CA170568 (HC). De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijkerwijs de officiële standpunten van de National Institutes of Health. Extra ondersteuning werd geboden door Jeffery A. Colby Colon Cancer en Tom Liu Memorial Research funds.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100% ethanol | Fisher | HC8001GAL | |
| 70% ethanol | Fisher | HC10001GL | |
| 95% ethanol | Fisher | HC11001GL | |
| Analysis software | Akoya Biosciences | CLS135783 | inForm version 2.3.0 |
| Antifade mountant | ThermoFisher | P36961 | ProLong Diamond |
| Blocking solution | Vector | SP-6000 | Bloxall |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Life Sciences | A9647-100G | |
| Cover Slips | Fisher | 12-548-5E | |
| Delicate task wipe | Kimberly-Clark | 34120 | |
| Fluorescent diluent | Akoya Biosciences | ARD1A01EA | Opal TSA diluent |
| Fluorophore 520 | Akoya Biosciences | FP1487001KT | 1:100 |
| Fluorophore 540 | Akoya Biosciences | FP1494001KT | 1:100 |
| Fluorophore 570 | Akoya Biosciences | FP1488001KT | 1:100 |
| Fluorophore 620 | Akoya Biosciences | FP1495001KT | 1:100 |
| Fluorophore 650 | Akoya Biosciences | FP1496001KT | 1:100 |
| Fluorophore 690 | Akoya Biosciences | FP1497001KT | 1:100 |
| Fluorophore DAPI | Akoya Biosciences | FP1490 | 3 drops in TBST or PBS |
| Heat resistant box | Tissue-Tek | 25608-904 | Plastic slide box-green |
| Humidified Chamber | Ibi Scientific | AT-12 | |
| Hybridization oven | FisherBiotech | ||
| Hydrophobic barrier pen | Vector | H-4000 | ImmEdge |
| Microscope | Perkin Elmer | CLS140089 | Mantra quantitative pathology workstation |
| Microwave | Panasonic | NN-A661S | with inverter technology |
| Neutral buffered formalin | Fisher Scientific | SF100-4 | 10% neutral buffered formalin |
| pH 6 antigen retrieval buffer | Akoya Biosciences | AR600 | AR6 |
| pH 9 antigen retrieval buffer | Akoya Biosciences | AR900 | AR9 |
| Phosphate buffered saline | Fisher | BP3994 | PBS |
| Plastic slide box | Tissue-Tek | 25608-906 | |
| Plastic wrap | Fisher | NC9070936 | |
| Polysorbate 20 | Fisher | BP337-800 | Tween 20 |
| Primary antibody CD163 | Lecia | NCL-LCD163 | 1:400 |
| Primary antibody CD3 | Dako | A0452 | 1:400 |
| Primary antibody CD8 | Spring Bio | M5390 | 1:400 |
| Primary antibody FOXP3 | Dako | M3515 | 1:400 |
| Primary antibody pancytokeratin | Cell Signaling | 12653 | 1:500 |
| Primary antibody PD-L1 | Cell Signaling | 13684 | 1:200 |
| Secondary antibody | Akoya Biosciences | ARH1001EA | Opal polymer |
| Slide stain set | Electron Microscopy Sciences | 6254001 | |
| Tris buffered saline | Corning | 46-012-CM | TBS |
| Vertical slide rack | Electron Microscopy Sciences | 50-294-72 | |
| Xylene | Fisher | X3P1GAL |
References
- Lazarus, J., et al. Spatial and phenotypic immune profiling of metastatic colon cancer. JCI Insight. 3 (22), (2018).
- Barua, S., et al. A Functional Spatial Analysis Platform for Discovery of Immunological Interactions Predictive of Low-Grade to High-Grade Transition of Pancreatic Intraductal Papillary Mucinous Neoplasms. Cancer Informatics. 17, 1176935118782880 (2018).
- Yang, L., Liu, Z., Tan, J., Dong, H., Zhang, X. Multispectral imaging reveals hyper active TGF-beta signaling in colorectal cancer. Cancer Biology & Therapy. 19 (2), 105-112 (2018).
- Carstens, J. L., et al. Spatial computation of intratumoral T cells correlates with survival of patients with pancreatic cancer. Nature Communications. 8, 15095 (2017).
- Steele, K. E., Brown, C. Multiplex Immunohistochemistry for Image Analysis of Tertiary Lymphoid Structures in Cancer. Methods In Molecular Biology. 1845, 87-98 (2018).
- Gorris, M. A. J., et al. Eight-Color Multiplex Immunohistochemistry for Simultaneous Detection of Multiple Immune Checkpoint Molecules within the Tumor Microenvironment. The Journal Of Immunology. 200 (1), 347-354 (2018).
- Parra, E. R., et al. Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues. Scientific Reports. 7, (2017).
- Katikireddy, K. R., O'Sullivan, F. Immunohistochemical and immunofluorescence procedures for protein analysis. Methods In Molecular Biology. 784, 155-167 (2011).
- Adan, A., Alizada, G., Kiraz, Y., Baran, Y., Nalbant, A. Flow cytometry: basic principles and applications. Critical Reviews In Biotechnology. 37 (2), 163-176 (2017).
- Zaritskaya, L., Shurin, M. R., Sayers, T. J., Malyguine, A. M. New flow cytometric assays for monitoring cell-mediated cytotoxicity. Expert Review of Vaccines. 9 (6), 601-616 (2010).
- Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70 (1), 46-58 (2014).
- Zhang, W., et al. Fully automated 5-plex fluorescent immunohistochemistry with tyramide signal amplification and same species antibodies. Laboratory Investigation. 97 (7), 873-885 (2017).
- Phenoptics Research Solutions. Perkin Elmer Manual. , 32 (2016).
- Opal Multiplex IHC Assay Development Guide. , Perkin Elmer Manual. (2014).
- Carey, C. D., et al. Topological analysis reveals a PD-L1-associated microenvironmental niche for Reed-Sternberg cells in Hodgkin lymphoma. Blood. 130 (22), 2420-2430 (2017).
