Summary
Multiplex fluorescerende immunhistokjemi er en ny teknologi som muliggjør visualisering av flere celletyper innenfor intakt formalin, parafin embedded (FFPE) vev. Presentert er retningslinjer for å sikre en vellykket 7-farge multiplex med instruksjoner for å optimalisere antistoffer og reagenser, forberede lysbilder, design og tips for å unngå vanlige problemer.
Abstract
Mikromiljøet evaluering av intakt vev for analyse av celle infiltrasjon og romlig organisasjon er avgjørende for å forstå kompleksiteten i sykdommen prosesser. Prinsippet teknikker som brukes i fortiden inkluderer immunhistokjemi (IHC) og immunofluorescence (IF) som muliggjør visualisering av celler som et øyeblikksbilde i tid ved hjelp av mellom 1 og 4 markører. Begge teknikkene har svakheter inkludert problemer farging dårlig antigen mål og begrensninger knyttet til kryss-arter reaktivitet. IHC er pålitelig og reproduserbar, men arten av kjemi og avhengighet av det synlige lyset spekteret gir bare noen få markører som skal brukes og gjør co-lokalisering utfordrende. Bruk av IF utvider potensielle markører, men vanligvis er avhengig av frosset vev på grunn av den omfattende vev autofluorescence etter formalin fiksering. Flow flowcytometri, en teknikk som muliggjør samtidig merking av flere epitopes, opphever mange av manglene ved IF og IHC, men behovet for å undersøke celler som en enkelt celle suspensjon mister romlige konteksten av celler forkaste viktige biologiske Relasjoner. Multiplex fluorescerende immunhistokjemi (mfIHC) broer disse teknologiene muliggjør multi-epitope mobilnettet bestemmelse av fenotype i formalin fast parafin embedded (FFPE) vev samtidig bevare den samlede mikromiljøet arkitektur og romlig forholdet mellom celler i intakt uforstyrret vev. Høy fluorescerende intensitet fluorophores som covalently bånd til vevet epitope muliggjør flere anvendelser av primære antistoffer uten bekymring for arter spesifikke kryss-reaktivitet av sekundære antistoffer. Selv om denne teknologien har vist seg å produsere pålitelige og nøyaktige bilder for studiet av sykdom, kan prosessen med å lage en nyttig mfIHC farging strategi være tidkrevende og krevende på grunn av omfattende optimalisering og design. For å gjøre robuste bilder som representerer nøyaktige mobilnettet interaksjoner in-situ og å redusere optimaliserings perioden for manuell analyse, som presenteres her er metoder for lysbilde forberedelse, optimalisere antistoffer, multiplex design samt feil ofte oppstår under fargeprosessen.
Introduction
Visualisering av en intakt tumor mikromiljøet (TME) er viktig i å evaluere ikke bare cellulære infiltrasjon i solid ondartet men celle til celle interaksjoner også. Multiplex fluorescerende immunhistokjemi (mfIHC) har dukket opp som et effektivt verktøy for multi-antigen bestemmelse av fenotype av celler i studiet av kreft og tilhørende sykdommer1,2,3,4, 5,6,7. Dette, i kombinasjon med romanen programvare og programmer som er utviklet for å analysere store datasett, muliggjør observasjon av komplekse interaksjoner mellom cellene1,2,4. Satsen begrensende faktor i datainnhenting er ofte kvaliteten på farget vev før analyse.
Tidligere teknikker som brukes til å fenotype celler i TME inkluderer immunhistokjemi (IHC), immunofluorescence (IF) og Flow flowcytometri som alle utgjør betydelige begrensninger. IHC bruker formalin faste parafin embedded (FFPE) vev seksjoner som er deparaffinized og rehydrert før de blir farget av oftest ett antistoff. Bruk av et pepperrot peroksidase (HRP) bundet sekundært antistoff og en kjemisk reaksjon tillater visualisering av en enkelt antigen epitope8. Mens IHC er pålitelig og utført på FFPE vev som er lett å arbeide med, begrensninger til det synlige lyset spekteret betyr bare en eller to markører kan være pålitelig skilles og colocalization av antigener ganske vanskelig8. En måte å utvide tilgjengelige markører og derfor antigener som kan være analysert på en enkelt seksjon er å bytte til fluorescens som tillater bruk av et bredere spekter av det visuelle spekteret. For IF, frosset eller FFPE vev overføres til lysbilder og antistoffer som brukes som er bøyd til ulike fluorophores. Selv om dette øker antall antigener som kan være analysert, er det flere viktige begrensninger. Først fordi hvert antistoff vanligvis bare har en fluoroforen vedlagt, lysstyrken er ofte ikke sterk nok til å overvinne vev autofluorescence. Det er av denne grunn, de fleste IF er utført på frossen vev som er dyrt å lagre og vanskelig å arbeide med. Et begrenset antall fluorescerende etiketter er tilgjengelig for bruk på grunn av Spectral overlapping og kryss arter reaktivitet spesielt når ikke-bøyd antistoffer brukes. Flow flowcytometri, som består av fersk vevs behandling i en enkelt celle suspensjon og merking med fluorescerende antistoffer har vært gullstandarden for immunfenotyping i flere ti år9,10. En fordel med strømnings flowcytometri er evnen til å merke flere antistoffer uten bekymring for at arter krysser reaktivitet, ettersom de fleste blir bøyd. Fordi cellene er "visualisere" av en maskin og ikke menneskelige øyne, det er langt mer fluorophores tilgjengelig, men dette kommer med en kostnad. Kompensasjon må gjøres manuelt som kan betydelig endre resultater produsere falske positive og negative populasjoner. Den mest vesentlige begrensningen av Flow flowcytometri er at vev arkitektur og deretter all romlig informasjon er tapt ved nødvendigheten av enkeltceller suspensjon.
Multiplex fluorescerende immunhistokjemi (mfIHC) ved hjelp av et automatisert fluorescerende mikroskop i kombinasjon med ny programvare kombinerer fordelene med IHC, IF og Flow flowcytometri ved at multi-antigen vev farging med signal forsterkning og oppbevaring av romlige forhold uten behov for kompensasjon. FFPE vev plasseres på ladet lysbilder som etter antigen henting, gjennomgår en runde av primær antistoff søknad til målet antigen av interesse etterfulgt av et sekundært antistoff med en HRP kjemisk kode, lik IHC. Etter plassering av sekundær antistoff, en HRP spesifikk reaksjon resulterer i en fluoroforen covalently binding til epitope av interesse11. Når vevet er merket, en ny runde av oppvarming lysbildene er fullført fjerne tidligere anvendt primære og sekundære antistoff kompleks slik at bare den fluorescerende koden bundet til vevet epitope11. Dette gjør det mulig for flere antistoffer av alle arter som kan brukes på nytt uten bekymring for kryss-reaktivitet11,12. For å minimere behovet for manuell kompensasjon av flere fluorescerende fargestoffer, brukes en samling av fluorophores med liten Spectral overlapping inkludert en kjernefysisk Counter flekken til å fullføre mfIHC. Å gjøre rede for det autofluorescence støtt på med FFPE tissue, programvare trekker det autofluorescence fra det final image benytter en image fra en fjerne skyve hvilke er mulig med hensyn til styrken av antigen spesifikk fluorescens fulgte fluoroforen signal forsterkning. Ved hjelp av romanen programmer laget for store datasett, celle steder kan identifiseres og analyseres for romlig kontekst1,2,4. Den mest vesentlige begrensningen av denne teknikken er optimaliserings tid. Her finner du en detaljert metodikk med instruksjoner for eksperimentell design og farge-og bildebehandlings strategi. mfIHC vil være nyttig for laboratorier som ikke har en optimalisert automatisert farging system som ønsker å bedre forstå romlig sammenheng med celle-til-celle interaksjoner i intakt FFPE vev ved hjelp av manuell teknikk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alt arbeid har blitt godkjent av University of Michigan interne gjennomgang styret.
1. optimalisere primære antistoffer og Slide forberedelse
- Bestem ideell konsentrasjon av antistoffer for multiplex ved bruk av konvensjonell IHC.
- Test antistoffer for multiplex ved manuell konvensjonell immunhistokjemi (IHC)13.
- Bruk spesifikke vev som har en rikelig celle type for hver antistoff testet som bruker mandel vev for CD3 antistoff testing.
- Bruk referanse konsentrasjonen for IHC anbefalt av selskapet og Fullfør IHC med antistoff konsentrasjoner ved anbefalte konsentrasjoner samt konsentrasjoner over og under anbefalt konsentrasjon.
- Forbered formalin fast parafin innebygd vev på lysbilder.
- Bruk en mikrotomen, kutt blokkene i FFPE-vevet med en tykkelse på mellom 4 og 6 μm og Påfør på ladet slides.
Merk: ved hjelp av destillert vann sikrer riktig vev montering og tilslutning gjennom multiplex. - Plasser lysbildene flatt, vev side opp, og la tørke ved 37 ° c over natten.
- Lagre lysbilder i en lysbilde boks vekk fra ekstreme temperaturer til klar til å fullføre multiplex.
- Bruk en mikrotomen, kutt blokkene i FFPE-vevet med en tykkelse på mellom 4 og 6 μm og Påfør på ladet slides.
2. generell Fargemetode
- Utarbeidelse av vask og antigen gjenfinning løsninger
- Forbered vaskeløsningen på 0,1% TBST ved å blande 9 L av deionisert vann, 1 L av Tris bufret saltoppløsning (TBS) og 10 mL polysorbat 20.
- Forbered både antigen henting løsninger (pH 6 og pH 9; Tabell med materialer) ved fortynning til 1x med deionisert vann.
- Deparaffinization og rehydrering
- Bake lysbilder, ligge flatt, vev side opp ved 60 ° c for 1 t i en hybridisering ovn1. Fjern lysbilder fra ovnen og la avkjøles i minst 5 − 10 min da plass i en vertikal Slide rack.
- Behandle lysbildene i følgende løsninger sekvensielt: xylen i tre eksemplarer, etterfulgt av en enkelt behandling av 100% etanol, 95% etanol, og til slutt 70% etanol for 10 min hver ved hjelp av et lysbilde farging sett1.
- Vask stativet med lysbilder i 2 minutter med deionisert vann ved å bli i en plast skyve boks etterfulgt av fiksering ved å bli satt i en plastboks fylt med nøytrale, bufrede formalin i 30 min13. Vask lysbildene i deionisert vann i 2 min og deretter gå videre til antigen henting.
- Antigen henting
- Plasser stativet av lysbilder i en varmebestandig boks fylt til den interne linjen (ca 300 mL) med pH 6 eller pH 9 antigen henting buffer.
Merk: antigen henting buffer kan være enten pH 6 eller pH 9 som kanskje må optimaliseres per epitope. Men Start med å bruke pH 9 for antistoffer som binder til kjernefysisk epitopes og pH 6 for alle andre antistoffer. - Dekk boksen med plast brytes og bruke en gummistrikk for å sikre. Plasser boksen i mikrobølgeovnen på kanten av den roterende plate (mikrobølgeovn må være utstyrt med Inverter teknologi for jevn oppvarming). Heat lysbildene for 45 s på 100% strøm etterfulgt av 15 min ved 20% strøm13.
Merk: mikrobølgeovn behandling kan trenge optimalisering avhengig av mikrobølgeovn som brukes. - La lysbildene avkjøles i ca. 15 − 20 min.
- Plasser stativet av lysbilder i en varmebestandig boks fylt til den interne linjen (ca 300 mL) med pH 6 eller pH 9 antigen henting buffer.
- Forbered arbeidsløsninger av antistoffer og fluorophores mens lysbildene avkjøles.
- Forbered den primære antistoff fortynnings MIDlet ved oppløsning 0,5 g av storfe serum albumin granulater inn 50 mL TBST. Alternativt kan du bruke 50 mL 1x fosfat bufret saltvann (PBS) til å oppløse granulater.
- Gjør hver primære antistoff arbeids løsning til den optimaliserte konsentrasjonen bestemmes i del 1, i den primære antistoff fortynningsmiddel. Beregn ca 200 μL per lysbilde.
- Klargjør den fluoroforen arbeids løsningen ved å fortynne hver fluoroforen i fluoroforen fortynningsvæske ved en konsentrasjon på 1:100.
Merk: Dette må kanskje optimaliseres avhengig av antistoff. Beregn ca 100 μL per lysbilde. - På den siste dagen av farging, forberede 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) arbeider løsning ved å legge til 3 dråper DAPI i 1 mL TBST.
- Skyv flekker (vasking og blokkering)
- Fjern boksen fra mikrobølgeovnen etter avkjøling og ta av plast brytes, vaske lysbildene med deionisert vann i 2 min etterfulgt av en 2 min vask i en plast lysbilde boks fylt TBST13.
- Etter tørking hvert lysbilde rundt vevet med en delikat oppgave tørk forsiktig for ikke å la vevet tørke ut, spor rundt utsiden av vevet ved hjelp av en hydrofobe barriere penn. Ikke berør vevet med den delikate oppgaven tørk eller penn.
- Plasser hvert lysbilde i fuktet kammeret og legge til blokkerende løsning (ca 4 dråper) til vevet. Ruge i 10 min ved romtemperatur (RT).
- Skyv farging (primært antistoff program)
- Ta hvert lysbilde og fjerne blokkering løsningen ved å trykke på siden av lysbildet på en stabel med papirhåndklær og bruke en delikat oppgave tørk for å fjerne overflødig blokkering agent fra hele vevet.
- Legg glidebryteren tilbake i fuktet kammeret og tilsett ca. 200 μL av det arbeidende primære antistoff. Ruge i fuktet kammeret for 1 time ved RT.
- Vask med TBST i 2 minutter med nedsenking i tre eksemplarer13.
Merk: etter hvert vasketrinn, vil endring av TBST bidra til å sikre et renere bilde.
- Skyv farging (sekundært antistoff program)
- DAB av de resterende TBST fra hvert lysbilde og bruke ca 3 til 4 dråper sekundært antistoff (blanding av kanin og mus sekundære HRP bøyd antistoffer). Ruge i 10 min i fuktet kammeret på RT13.
Merk: Hvis du planlegger å bruke en primær antistoff som krever et sekundært antistoff enn mus eller kanin eller velger å bruke et alternativt sekundært antistoff, Påfør riktig HRP bøyd sekundært til lysbildene og ruge ved RT for 45 min. optimalisering av inkubasjonstid kan være nødvendig for alternativ sekundær14. - Etter inkubasjons, vask med TBST i 2 min i tre eksemplarer13.
- DAB av de resterende TBST fra hvert lysbilde og bruke ca 3 til 4 dråper sekundært antistoff (blanding av kanin og mus sekundære HRP bøyd antistoffer). Ruge i 10 min i fuktet kammeret på RT13.
- Skyv farging (fluoroforen program)
- Påfør ca. 100 μL av fluoroforen arbeids løsning og ruge i fuktet kammeret ved RT i 10 min13.
- Vask med TBST i 2 min i tre eksemplarer13.
- Fjerning av antistoffer
- Mikrobølgeovn lysbilder (45 s på 100% så 15 min ved 20%) i varmebestandig eske (se trinn 2.3.2) for fjerning av antistoffer13,14.
Merk: Dette fullfører en runde av multiplex. Dette er det eneste punktet der protokollen kan stanses midlertidig. Hvis du vil stanse protokollen midlertidig, lar du lysbildene være under vann i antigen hentings bufferen over natten ved romtemperatur.
- Mikrobølgeovn lysbilder (45 s på 100% så 15 min ved 20%) i varmebestandig eske (se trinn 2.3.2) for fjerning av antistoffer13,14.
- Fortsett med flere runder med farging. Gjenta trinn 2.5.1 − 2.9.1 for resten av antistoff-fluoroforen parene. Når alle antistoffer og fluorophores er brukt, går du videre til seksjon 2,11.
- DAPI-applikasjon og-montering
- Etter den siste farging runde i Multiplex, fjerne den siste antistoff programmet med antigen henting løsning pH 613. Vask med deionisert vann etterfulgt av TBST i 2 minutter hver13.
- Påfør ca 150 μL av den fungerende DAPI-løsningen på lysbilder og ruge i fuktet kammeret i 10 min på RT1.
- Vask med TBST i ca. 30 s og Monter coverslips med en Antifade mountant. Påfør klar fingernegl polish på de fire hjørnene av dekkglass når monterings mediene har tørket for å sikre dekkglass (valgfritt).
3. detaljer for bibliotek, monoplexes og multiplex
- Velg lysbilder for å bygge et fluoroforen bibliotek.
- For en 7-farge multiplex samle 7 immun celle rikt vev lysbilder (dvs., mandel, milt, etc.) for biblioteket.
Merk: Velg kontroll lysbilder som skal brukes for et fluoroforen bibliotek med hvert lysbilde som representerer hver unike fluoroforen som skal brukes i multiplex. Kontroll lysbilder bør ha en rikelig epitope av valg og kan være den samme type vev for hver fluoroforen.
- For en 7-farge multiplex samle 7 immun celle rikt vev lysbilder (dvs., mandel, milt, etc.) for biblioteket.
- Flekker og bildebibliotek lysbilder for bruk med monoplexes og multiplekser.
- Følg trinn 2.1 − 2.9.1 ved hjelp av kontroll lysbildene og kontroll vevet lysbilder av valget. Plasser en annen fluoroforen på hvert lysbilde med en konsentrasjon på 1:100. ett lysbilde skal inneholde bare DAPI.
- Fortsett til § 2,11 unntatt utelate DAPI farging og i stedet bruke TBST og montere som beskrevet.
- Etter å la lysbilder tørr over natten, bilde med alle kanaler DAPI, CY3, CY5, CY7, Texas rød, halvleder Quantum prikker, og fluorescein isothiocyanate (FITC) innstilling eksponeringen til 250 MS med metning beskyttelse funksjonen1.
Merk: eksponeringstidene kan stilles inn til 50 − 250 MS13. - Last opp biblioteket bildene på programvare og bruk i analysen av monoplexes og multiplex.
- Velg lysbilder for monoplexes.
- Velg kontroll lysbilder som har et rikt epitope basert på optimaliserte antistoffer (del 1). For hver runde med farging som skal gjøres i Multiplex, velger du dette antallet kontroll lysbilder for å opprette monoplexes.
Merk: formålet med monoplex er å bestemme den beste posisjonen (rekkefølge) for hvert antistoff som skal brukes i multiplex.
- Velg kontroll lysbilder som har et rikt epitope basert på optimaliserte antistoffer (del 1). For hver runde med farging som skal gjøres i Multiplex, velger du dette antallet kontroll lysbilder for å opprette monoplexes.
- Stain monoplexes.
- Følg avsnittene 2.1 − 2.11 ved hjelp av primær antistoff i en annen rekkefølge (posisjon) for hvert av lysbildene. Hvert lysbilde bør bare ha ett primært antistoff brukt på en ordre (posisjon) som er forskjellig fra de andre lysbildene.
Merk: for hvert lysbilde der runden ikke krever noe primært antistoff eller fluoroforen, bruk i stedet primært antistoff fortynningsmiddel og fluoroforen fortynningsvæske13.
- Følg avsnittene 2.1 − 2.11 ved hjelp av primær antistoff i en annen rekkefølge (posisjon) for hvert av lysbildene. Hvert lysbilde bør bare ha ett primært antistoff brukt på en ordre (posisjon) som er forskjellig fra de andre lysbildene.
- Bilde glir og analyserer monoplex.
- Bruke mikroskopet og angi eksponeringstid til 250 ms for alle kanaler fange hvert bilde utnytte DAPI å fokusere.
Merk: eksponeringstidene kan stilles inn til 50 − 250 MS14. - Ved hjelp av analyseprogramvaren evaluere hver monoplex lysbilde ved å se på fluorescerende intensiteten av farget markør.
- Sammenlign denne intensiteten med bakgrunnen. Hvis det er minst 5 − 10 ganger høyere enn bakgrunnen, er plasseringen av dette lysbildet en optimal posisjon for bruk i den siste multiplex.
- Bruke mikroskopet og angi eksponeringstid til 250 ms for alle kanaler fange hvert bilde utnytte DAPI å fokusere.
- Velg lysbilder for multiplex.
- Velg lysbildene av interesse og legge til et ekstra lysbilde som skal brukes som et tomt lysbilde for subtraksjon av autofluorescence etter farging og bildebehandling.
- Flekker på multiplex.
- Basert på de monoplex resultatene velger du riktig rekkefølge (stillinger) for hvert antistoff basert på trinn 3.5.3. Tildel hver fluoroforen til et antistoff.
Merk: Dette kan trenge optimalisering; men planlegger å bruke lyse antistoffer for mindre rikelig markører1, co-lokalisere antistoffer bør matches med fluorophores på langt spectrums fra hverandre13, og fluorophores med spekteret 540 og 570 bør ikke være co-lokaliserte grunn til Spectral overlapper problemer1. - Fortsett med avsnittene 2.1 − 2.11 for å sikre at det tomme lysbildet ikke mottar primær antistoff, fluoroforen eller DAPI, i stedet bruker fortynningsvæske, fluoroforen fortynningsmiddel og TBST i stedet.
- Basert på de monoplex resultatene velger du riktig rekkefølge (stillinger) for hvert antistoff basert på trinn 3.5.3. Tildel hver fluoroforen til et antistoff.
- Bilde multiplex og analysere for integritet av farging
- Bruke mikroskopet og sette eksponeringstid til 250 ms for alle kanaler, ta hvert bilde utnytte DAPI å fokusere.
- Ved hjelp av analyseprogramvaren (tabell av materialer), evaluere hver multiplex av fluorescerende falsk farge.
Merk: et klart bilde skal vise hver markør tydelig. Hvis en markør ser diffus og kornete eller ikke-eksisterende, er det sannsynlig at markøren ikke fungerte og må re-optimalisert. - Ved hjelp av analyseprogramvare, evaluere hver multiplex ved patologi visning. Patologi vise vil bekrefte spesifisitet av hver markør. Sammenlign med IHC tidligere optimalisert (del 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den generelle prosessen med å få en 7-farge multiplex analysen følger en repeterende mønster. Figur 1 beskriver prosessen i et diagrammatisk skjema. Når lysbildene er kuttet og tørket eller er mottatt fra laboratoriet og bakt i en hybridisering ovn ved 60 ° c for 1 t, deretter gå videre til deparaffinization og rehydrering, fikse lysbildene i formalin igjen etterfulgt av antigen henting. Hver runde med multipleksing starter på antigen og fullfører ved fjerning av antistoff (figur 1).
Optimalisering av hvert trinn i prosessen er avgjørende for å oppnå en klar og brukbar bilde. Antistoffer bør testes av IHC først ved hjelp av antigen gjenfinning buffere med pH 6 og pH 9 for hvert antistoff å visualisere hvilken antigen henting buffer fungerer best med det aktuelle antistoff. Generelt, kjernefysiske mål reagerer på antigen henting med buffer pH 9. For eksempel fungerer FOXP3 best når antigen henting buffer av pH 9 brukes i motsetning til CD3 som fungerer best med antigen henting buffer av pH 6. Bilder tatt fra IHC prosessen bør brukes til å validere spesifisitet av multiplex analyse.
En monoplex er nødvendig for å bestemme rekkefølgen av hvert antistoff i multiplex. Når du bruker enten et 4-eller 7-fargers sett, vil hvert antistoff ha en foretrukket rekkefølge i matrisen. For antall antistoffer som vil bli brukt, samle de aktuelle kontroll lysbildene (dvs. for en 7-farge multiplex der en farge er DAPI, velger du 6 vev spesifikke representative kontroll lysbilder for de 6 andre fluorophores). Figur 2 A-C er en skjematisk fremstilling av en monoplex analysen ved hjelp av 3 lysbilder med FFPE kolon kreft vev. Hvert lysbilde har FOXP3 i en annen posisjon i matrisen ved hjelp av fluoroforen 570 som sin kode. DAPI brukes som en teller flekk til tilstrekkelig visualisere kjerner. I Figur 3vises representative bilder av en monoplex og en multiplex med varierende FOXP3-posisjon. I Figur 3A, B der FOXP3 er i tredje posisjon (tilsvarende den rekkefølgen som vises i figur 2C), er spesifikke og robuste farging av FOXP3 (rød) sett på som demonstrert av lyse kjernefysiske flekker figur 3a og co-lokalisering med CD3 figur 3b. Den fluoroforen signal intensiteten bekrefter spesifisitet av FOXP3 uten spesifikke flekker andre steder i vevet figuren 3a. I figur 3c, der FOXP3 er i første posisjon (tilsvarende rekkefølgen i figur 2a), er det ikke-spesifikk farging av FOXP3. Kornete diffus områder av rødt dekker det meste av raset og fluorescerende intensitet på disse områdene er mindre enn 1. Forsøk på å gjøre en multiplex uten å fullføre en monoplex først for å teste rekkefølgen av fargeresultatene i et lignende utfall og vil avfalls reagenser. Et annet kritisk trinn som ikke kan overses i multiplex prosessen er DAPI farging. En fungerende DAPI-counterstain er grunnlaget for celle identifisering og ytterligere romlig analyse ved hjelp av analyseprogramvaren. En viktig kontrast kan sees i det sammensatte bildet medarbeider DAPI (blå) i figur 3e og i den ikke-arbeidende DAPI i figur 3F. Bildet i figur 3F var ikke i stand til å brukes til å identifisere celler i analyseprogramvaren. Et forsøk på å redde multiplex og vevs analyse, dekkglass kanskje fjernet ved soaking lysbildet i TBST etterfulgt av en mikrobølgeovnen trinn i pH 6 antigen henting buffer med en ekstra anvendelse av DAPI.
Når monoplex analysen er fullført og optimal antistoff ordre bekreftet, en multiplex strategi kan konstrueres Figur 4. For hvert mål må en annen fluoroforen velges. Tallet som er tilknyttet hver fluoroforen representerer grovt sett den Spectral fluorescerende bølgelengden som slippes ut etter eksitasjon, tilsvarende strømnings flowcytometri. Forsiktighet bør utvises ved Matching av foreslåtte antistoffer med fluorophores for å begrense Spectral overlapping og potensiell blødning av markører. En god strategi er å velge bølgelengder langt fra hverandre for co-lokalisere antistoffer for å redusere overflødig Spectral overlapping gir et skarpt bilde og mer pålitelig bestemmelse av fenotype13. For eksempel, inne det multiplex strategi vist (skikkelsen 4), CD8 er par med fluoroforen 570 stund CD3 er par med fluoroforen 520. Man bør unngå bruk av fluoroforen 540 og 570 i co-lokaliserte mål som disse pleier å være den mest undiscriminating og kan svekke resultatene. Fluoroforen 620 tendens til å være svært lyse og bør brukes for antistoffer som ikke er rikelig i vevet. En fersk biblioteket brukes som referanse for hver fluoroforen også hjelpemidler i å redusere Spectral overlapping av fluorophores. Et blankt lysbilde som gjennomgår alle runder med antigen henting er nødvendig for å sikre autofluorescence ekstraksjon fra det sammensatte bildet. Dette blanke lysbildet vil gjennomgå den samme behandlingen som multiplex lysbilder unntatt i stedet for en fungerende primære antistoff og fluoroforen, antistoff fortynningsmiddel og fluoroforen fortynningsmiddel vil bli brukt henholdsvis figur 4b.
For å sikre at multiplex design fungerte ordentlig og markørene sett i det sammensatte bildet er spesifikke, bruk "patologi bildet" i kombinasjon med "brightfield" innstilling alternativet ved hjelp av mikroskop programvare som skaper en faux IHC bilde som deretter kan sammenlignet med tidligere IHC-analyser omtalt i avsnitt 1. Dessverre kan vakre sammensatte bilder ikke nødvendigvis gjenspeile en nøyaktig flekk, og dette er et viktig skritt for å kvalitets kontrollere prosessen og forhindre falske positive resultater. Figur 5a demonstrerer et sammensatt bilde uten innledende bekymring. CD3 er avbildet og viser spesifikke flekker (grønn) og bekreftes av patologi brightfield bildet i figur 5B. CD163 (oransje) er sett i det sammensatte bildet (figur 5a); men i evalueringen av patologi brightfield syn på CD163 (figur 5c) er antistoff uspesifisert. Et eksempel på et optimalt multiplex bilde med bestemte flekker er demonstrert i et sammensatt bilde (figur 5D). CD3 og CD163 spesifisitet er bekreftet ved hjelp av patologi brightfield visning (figur 5e og figur 5F, henholdsvis) og SAMMENLIGNER gunstig til tidligere IHC analyser utført ved hjelp av disse antistoffene (ikke vist).
Figur 1: fargearbeidsflyt skjema.
Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Monoplex utvikling.
(A) kolon kreft LYSBILDE med FOXP3 i posisjon 1. (B) tykktarmskreft LYSBILDE med FOXP3 i posisjon 2. (C) kolon kreft LYSBILDE med FOXP3 i posisjon 3. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: suksesser og fallgruver av monoplex og multiplex.
(A) Monoplex analysen av primær tykktarm kreft med FOXP3 i posisjon 3, fluorescerende intensitet etiketten vist. (B) multiplex-analysen av primær tykktarmskreft med FOXP3 i posisjon 3 og CD3 i posisjon 2. (C) Monoplex-analysen av primær tykktarmskreft med FOXP3 på posisjon 1, lysstoffrør etikett vist. (D) multiplex-analysen av primær tykktarmskreft med FOXP3 i posisjon 1 og CD3 i posisjon 2. (E) multiplex analysen av primær tykktarmskreft med rekkefølgen av antistoffer som følger: CD8 (gul), CD3 (grønn), CD163 (oransje), pancytokeratin (hvit), PD-L1 (magenta), FOXP3 (rød), arbeider DAPI (blå). (F) multiplex-analysen av primær tykktarmskreft med rekkefølgen av antistoffer som følger: CD8 (gul), CD3 (grønn), CD163 (oransje), pancytokeratin (hvit), PD-L1 (magenta), FOXP3 (rød), ikke-arbeidende DAPI (blå). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: multiplex utvikling.
(A) multiplex lysbilde av tykktarmskreft i en 7-farge multiplex. (B) blank Slide i en 7-fargers multiplex med kolon kreft vev. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: analysere spesifisitet av en 7-farge multiplex.
(A) multiplex sammensatt bilde med antistoffer som følger: CD8 (gul), CD3 (grønn), CD163 (oransje), pancytokeratin (hvit), Ki67 (rød), DAPI (blå). (B) patologi brightfield visning av bildet i panel A på CD3 eneste visningen. (C) patologi brightfield visning av bildet i panel A på CD163 bare vise. (D) multiplex sammensatt bilde med antistoffer som følger: CD8 (gul), CD3 (grønn), CD163 (oransje), pancytokeratin (hvit), PD-L1 (magenta), FOXP3 (rød), DAPI (blå). (E) patologi brightfield visning av bildet i panelet D på CD3 bare vise. (F) patologi brightfield visning av bildet i panelet D på CD163 bare vise. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Intakt vevsprøver fra solid tumor biopsi og kirurgiske reseksjon er fortsatt viktig diagnostiske og prediktiv verktøy for sykdoms analyse, samt pasient prognose. Multiplex fluorescerende immunhistokjemi (mfIHC) er en ny teknikk som kombinerer fordelene ved immunhistokjemi (IHC), immunofluorescence (IF) og Flow flowcytometri. Tidligere metoder for å granske celler in situ har tillatt for evaluering av celle-til-celle-ordninger i et vev miljø8, men det lave antallet epitopes som kan være analysert begrenser kompleks analyse. Flow flowcytometri, men nyttig i å analysere mange celletyper i en prøve, mister romlig kontekst i kraft av å forberede prøvene som en enkelt celle suspensjon9,10. mfIHC broer disse teknikkene ved å beholde den romlige konteksten av mobilnettet mikromiljøet og øke antall epitopes som kan merkes mens forsterke signalet per merket epitope11. Tidligere forskning har brukt mfIHC for bestemmelse av fenotype den cellulære infiltrere i kreft og ikke-kreft vev eksemplarer1,2,3,4,5,15. Post-image analyse har også blitt brukt til å analysere romlige forhold av celler og strukturer i vevet mikromiljøet1,2,4. For pålitelig analyse må et bestemt og nøyaktig bilde først produseres. Den manuelle farge teknikken, i motsetning til et automatisert fargesystem, gjør at mindre og kostnads bevisste laboratorier får tilgang til denne teknologien. Optimalisering tid og farging tid er blant de største barrierene for å oppnå en pålitelig bilde for videre romlig analyse.
Flere generelle regler øke sannsynligheten for vellykket generering av en pålitelig kompositt multiplex bilde og vil spare tid og ressurser. Antistoffer som skal brukes i multiplex bør velges basert på suksess med manuell konvensjonell IHC. Antigen henting buffere med pH 6 og pH 9 bør brukes for IHC for å undersøke riktig antigen henting for bruk i multiplex. Monoplex utvikling er nødvendig for å identifisere plassering av antistoffer i multipleksing protokollen. Begrunnelsen for dette er komplisert og varierer mellom vevsprøver og epitopes. I noen tilfeller kan epitope brytes ned med flere mikrobølgeovnen trinn og markør visualisering er tapt, som ofte er tilfellet med CD3. FOXP3, derimot, blir lysere med mer mikrobølgeovnen trinn og er knapt synlig hvis plassert på første eller andre runde av multiplex13,14.
Fargeprosessen starter med FFPE vev kuttet på ladet lysbilder. Det første problemet som kan oppstå er vevet faller ut av lysbildet etter mikrobølgeovnen. Når ladet lysbilder ikke brukes, er overholdelse av vev til glassoverflaten begrenset og vevet vil ha enten overdreven folding eller kan skli av helt. For ytterligere å sikre at vevet fester seg til lysbildene under fargeprosessen, utføres flere teknikker. Først mens kutte blokkene på lysbilder, den reneste form av vann fungerer best. For noen laboratorier, deionisert vann kan være tilstrekkelig, men destillert vann har fungert best. Lysbildene skal tørkes flatt umiddelbart etter klipping ved 37 ° c over natten. For ytterligere å sikre etterlevelse, blir lysbildene deretter plassert i en hybridisering ovn og bakt ligger flatt på 60 ° c i en time like før bruk. Selv om formalin fiksering allerede har funnet sted under den første prosessen med vevs forberedelser, vil det å plassere lysbildene i nøytrale, bufrede formalin i 30 minutter etter deparaffinization og rehydrering prosessen forbedrer den strukturelle integriteten til den monterte Tissue1,13.
Den manuelle fargeprosessen kan ta opptil tre, åtte timers dager, avhengig av hvor mange antistoffer som brukes. Å unngå fallgruver er avgjørende for å spare tid og spare reagenser. Den første vanlige feilen oppstår ofte i forberedelse av reagenser. Vann varierer mellom laboratorier og kan være en enkelt forskjell i resultater fra en lab til den neste. Bruk av samme samt en ren vannkilde for alle reaksjoner og reagenser sikrer et konsistent resultat. Antistoffene, blokkerings løsningen og fluorophores fungerer best ved romtemperatur. For å unngå fallgruver i forberedelse av reagens og arbeids løsning, bruk det samme vannet til alle reagenser. Bruk også alle arbeidsløsninger og reagenser ved romtemperatur.
Feilsøking av mfIHC er viktig og overholdelse av strenge laboratorie retningslinjer som er avgjørende for å begrense forurensning av komponenter og/eller operatørfeil. Produksjon av suboptimal bilder vil skew resultater og føre til falske positive og negative celle populasjoner som kan negativt påvirke data. Siden den endelige analysen vanligvis inkluderer datagenerert fenotyper basert på maskinlæring, kan små feil i farging forstørres for å påvirke hele datasettet. For eksempel, selv om alle flekker kan fungere perfekt, en feil eller unnlatelse av DAPI vil hindre fremtidig celle segmentering og telling rendering eksperimentet ubrukelig. Analyseprogramvare bruker DAPI farging ikke bare å identifisere celler, men tildeler x og y koordinater til hver celle, og hvis multiplex har Dim, dårlig omskrevet eller diffus DAPI farging, bildet kan ikke bli videre brukt og multiplex må gjøres om eller forsøkt redning og re-farging av DAPI. Bruk av programvarekomponenter som patologi og brightfield synspunkter vil øke tilliten til følsomhet og spesifisitet tidlig i optimaliseringsprosessen og hindre feil tidlig i multiplex prosessen.
Det endrer aspektene av det tenkelig forarbeide kanne likeledes hjelp inne image optimering. For eksempel tar et bilde ved hjelp av DAPI som visuelle hjelpemiddel for å fokusere bidrar til å unngå uskarpe bilder. Tilføyer det ny-fremstilt fluoroforen bibliotek å edb-programmer ville sikre en feilfri image og færre Spectral overlappe av hver fluoroforen under analyse Phase og benytter det fjerne skyve å ekstra det autofluorescence forsterker det markører og forsterker bildet Kvalitet.
Bruken av vevsprøver har og vil forbli som et viktig redskap for å undersøke patofysiologi av sykdom. Emerging teknologi har økt vår forståelse av celle-til-celle interaksjoner og mfIHC er en lovende ny spiller. Optimalisering og nøyaktighet under farging prosessen i denne teknikken er avgjørende for riktig utnyttelse og videre analyse av celle-til-celle interaksjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne vil gjerne takke Ed Stack, tidligere fra Perkin Elmer, for hans hjelp med oppsett og optimalisering av originale multiplex farging. Forfatterne vil også gjerne takke kristen Schmidt fra Akoya biovitenskap for tips ved hjelp av analyseprogramvare. Forskning rapportert i denne publikasjonen ble støttet av National Cancer Institutes of Health under Award nummer P30CA046592, K08CA201581 (tlf), K08CA234222 (js), R01CA15158807 (MPM), RSG1417301CSM (MPM), R01CA19807403 (MPM), U01CA22414501 (MPM, HC), CA170568 (HC). Innholdet er utelukkende ansvaret til forfatterne og representerer ikke nødvendigvis den offisielle synspunktene til National Institutes of Health. Ytterligere støtte ble levert av Jeffery A. Colby Colon Cancer og tom Liu Memorial Research Funds.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100% ethanol | Fisher | HC8001GAL | |
| 70% ethanol | Fisher | HC10001GL | |
| 95% ethanol | Fisher | HC11001GL | |
| Analysis software | Akoya Biosciences | CLS135783 | inForm version 2.3.0 |
| Antifade mountant | ThermoFisher | P36961 | ProLong Diamond |
| Blocking solution | Vector | SP-6000 | Bloxall |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Life Sciences | A9647-100G | |
| Cover Slips | Fisher | 12-548-5E | |
| Delicate task wipe | Kimberly-Clark | 34120 | |
| Fluorescent diluent | Akoya Biosciences | ARD1A01EA | Opal TSA diluent |
| Fluorophore 520 | Akoya Biosciences | FP1487001KT | 1:100 |
| Fluorophore 540 | Akoya Biosciences | FP1494001KT | 1:100 |
| Fluorophore 570 | Akoya Biosciences | FP1488001KT | 1:100 |
| Fluorophore 620 | Akoya Biosciences | FP1495001KT | 1:100 |
| Fluorophore 650 | Akoya Biosciences | FP1496001KT | 1:100 |
| Fluorophore 690 | Akoya Biosciences | FP1497001KT | 1:100 |
| Fluorophore DAPI | Akoya Biosciences | FP1490 | 3 drops in TBST or PBS |
| Heat resistant box | Tissue-Tek | 25608-904 | Plastic slide box-green |
| Humidified Chamber | Ibi Scientific | AT-12 | |
| Hybridization oven | FisherBiotech | ||
| Hydrophobic barrier pen | Vector | H-4000 | ImmEdge |
| Microscope | Perkin Elmer | CLS140089 | Mantra quantitative pathology workstation |
| Microwave | Panasonic | NN-A661S | with inverter technology |
| Neutral buffered formalin | Fisher Scientific | SF100-4 | 10% neutral buffered formalin |
| pH 6 antigen retrieval buffer | Akoya Biosciences | AR600 | AR6 |
| pH 9 antigen retrieval buffer | Akoya Biosciences | AR900 | AR9 |
| Phosphate buffered saline | Fisher | BP3994 | PBS |
| Plastic slide box | Tissue-Tek | 25608-906 | |
| Plastic wrap | Fisher | NC9070936 | |
| Polysorbate 20 | Fisher | BP337-800 | Tween 20 |
| Primary antibody CD163 | Lecia | NCL-LCD163 | 1:400 |
| Primary antibody CD3 | Dako | A0452 | 1:400 |
| Primary antibody CD8 | Spring Bio | M5390 | 1:400 |
| Primary antibody FOXP3 | Dako | M3515 | 1:400 |
| Primary antibody pancytokeratin | Cell Signaling | 12653 | 1:500 |
| Primary antibody PD-L1 | Cell Signaling | 13684 | 1:200 |
| Secondary antibody | Akoya Biosciences | ARH1001EA | Opal polymer |
| Slide stain set | Electron Microscopy Sciences | 6254001 | |
| Tris buffered saline | Corning | 46-012-CM | TBS |
| Vertical slide rack | Electron Microscopy Sciences | 50-294-72 | |
| Xylene | Fisher | X3P1GAL |
References
- Lazarus, J., et al. Spatial and phenotypic immune profiling of metastatic colon cancer. JCI Insight. 3 (22), (2018).
- Barua, S., et al. A Functional Spatial Analysis Platform for Discovery of Immunological Interactions Predictive of Low-Grade to High-Grade Transition of Pancreatic Intraductal Papillary Mucinous Neoplasms. Cancer Informatics. 17, 1176935118782880 (2018).
- Yang, L., Liu, Z., Tan, J., Dong, H., Zhang, X. Multispectral imaging reveals hyper active TGF-beta signaling in colorectal cancer. Cancer Biology & Therapy. 19 (2), 105-112 (2018).
- Carstens, J. L., et al. Spatial computation of intratumoral T cells correlates with survival of patients with pancreatic cancer. Nature Communications. 8, 15095 (2017).
- Steele, K. E., Brown, C. Multiplex Immunohistochemistry for Image Analysis of Tertiary Lymphoid Structures in Cancer. Methods In Molecular Biology. 1845, 87-98 (2018).
- Gorris, M. A. J., et al. Eight-Color Multiplex Immunohistochemistry for Simultaneous Detection of Multiple Immune Checkpoint Molecules within the Tumor Microenvironment. The Journal Of Immunology. 200 (1), 347-354 (2018).
- Parra, E. R., et al. Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues. Scientific Reports. 7, (2017).
- Katikireddy, K. R., O'Sullivan, F. Immunohistochemical and immunofluorescence procedures for protein analysis. Methods In Molecular Biology. 784, 155-167 (2011).
- Adan, A., Alizada, G., Kiraz, Y., Baran, Y., Nalbant, A. Flow cytometry: basic principles and applications. Critical Reviews In Biotechnology. 37 (2), 163-176 (2017).
- Zaritskaya, L., Shurin, M. R., Sayers, T. J., Malyguine, A. M. New flow cytometric assays for monitoring cell-mediated cytotoxicity. Expert Review of Vaccines. 9 (6), 601-616 (2010).
- Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70 (1), 46-58 (2014).
- Zhang, W., et al. Fully automated 5-plex fluorescent immunohistochemistry with tyramide signal amplification and same species antibodies. Laboratory Investigation. 97 (7), 873-885 (2017).
- Phenoptics Research Solutions. Perkin Elmer Manual. , 32 (2016).
- Opal Multiplex IHC Assay Development Guide. , Perkin Elmer Manual. (2014).
- Carey, C. D., et al. Topological analysis reveals a PD-L1-associated microenvironmental niche for Reed-Sternberg cells in Hodgkin lymphoma. Blood. 130 (22), 2420-2430 (2017).
