Summary
הטכנולוגיה המתהווה של מולטיפלקס מאפשרת הדמיה של סוגי תאים מרובים בתוך הרקמה הקבועה, שאינה מוטבעת ברקמת פרפין (FFPE). הציגו הם הנחיות להבטחת מולטיפלקס 7-צבע מוצלח עם הוראות אופטימיזציה של נוגדנים וריאגנטים, הכנת שקופיות, עיצוב וטיפים להימנעות בעיות נפוצות.
Abstract
הערכה מיקרוסביבתית של רקמות שלמות לניתוח חדירת תאים וארגון מרחבי הינם חיוניים להבנת המורכבות של תהליכי המחלות. הטכניקות העיקריות המשמשות בעבר כוללות אימונוהיסטוכימיה (IHC) ו immunofluorescence (IF) המאפשרים ויזואליזציה של תאים כתמונה בזמן שימוש בין 1 ל 4 סמנים. לשתי הטכניקות יש חסרונות כולל קושי לצביעת מטרות מנוגדות ומגבלות לא מקושרות הקשורות לפעילות מחודשת במינים. IHC אמינים ומיושנים, אבל הטבע של הכימיה וההסתמכות על ספקטרום האור הנראה מאפשר רק כמה סמנים לשמש והופך שיתוף לוקליזציה מאתגרת. השימוש אם מרחיב סמנים פוטנציאליים אך בדרך כלל מסתמך על רקמות קפואות בשל הרקמה המקיפה של הרקמות האוטומטיות לאחר קיבוע פורמלין. Cy, שיטת זרימה, טכניקה המאפשרת תיוג סימולטני של אפיציסקופים מרובים, abrogates רבים של ליקויים של IF ו-IHC, עם זאת, הצורך לבחון תאים כהשעיה תא יחיד מאבד את ההקשר המרחבי של תאים להשליך ביולוגי חשוב יחסים. מולטיפלקס (mfIHC) מגשר על טכנולוגיות אלה ומאפשר הפנוטיפים סלולריים רב אפיטביים ברקמת פרפין קבוע מוטבע (FFPE) רקמה תוך שמירה על הארכיטקטורה הכוללת של המיקרו-סביבה ומרחבי קשר של תאים. בתוך רקמה שאינה מופרת בחוזק פלורסנט גבוהה fluorophores כי קשר בעוצמה לאפירופה רקמות מאפשר יישומים מרובים של הנוגדנים העיקריים ללא חשש של מינים החוצה פעילות משנית על ידי נוגדנים משני. למרות טכנולוגיה זו הוכח לייצר תמונות אמינות ומדויקות לחקר המחלה, תהליך יצירת אסטרטגיה שימושי mfIHC צביעת יכול להיות זמן רב ומדויק עקב אופטימיזציה ועיצוב נרחב. כדי ליצור תמונות חזקות המייצגות אינטראקציות סלולריות מדויקות באתרו ולהמתיק את תקופת האופטימיזציה לניתוח ידני, מוצגות כאן שיטות להכנת שקופיות, אופטימיזציה של נוגדנים, עיצוב מולטיפלקס, כמו גם שגיאות נתקל בדרך כלל במהלך תהליך הצביעת.
Introduction
ויזואליזציה של מיקרוסביבה הגידול ללא פגע (TME) הוא חיוני בהערכת לא רק חדירה תאית בגידולים ממאירים מוצק אלא גם תא לאינטראקציות תאים. מולטיפלקס אימונוהיסטוכימיה (mfihc) התפתחה ככלי יעיל עבור מולטי אנטיגן פנוויקליד של תאים במחקר של סרטן ומחלות הקשורות1,2,3,4, 5,6,7. זאת, בשילוב עם תוכנות ותוכניות הרומן שנועדו לנתח ערכות נתונים גדולות, מאפשר התבוננות באינטראקציות מורכבות בין תאים1,2,4. גורם הגבלת הקצב ברכישת נתונים הוא לעתים קרובות איכות הרקמה המוכתמת לפני ניתוח.
הטכניקות הקודמות השתמשו כדי להתאים את התאים ב-TME כוללים אימונוהיסטוכימיה (IHC), immunofluorescence (IF) ולזרום cy, שכולם מהווה מגבלות משמעותיות. IHC משתמשת במקטעי פרפין קבועים (FFPE) משובצים ברקמות שאינן מוכתמים לפני הכתם על ידי נוגדן אחד לרוב. השימוש של חזרת peroxidase (HRP) נוגדן משני מאוגד ותגובה כימית מאפשר ויזואליזציה של אפיגניים אחד נגד הגנים8. בעוד IHC הוא אמין ומבוצע על רקמת FFPE אשר קל לעבוד עם, מגבלות על ספקטרום אור גלוי פירושו רק אחד או שניים סמנים יכול להיות אמין מכובד ולוקליזציה של אנטיגנים די קשה8. דרך להרחיב סמנים זמינים ולכן אנטיגנים שניתן לנחקר על מקטע אחד היא לשנות את הזריחה המאפשרת להשתמש במגוון רחב יותר של הספקטרום החזותי. עבור IF, מוקפא או רקמת FFPE מועבר על שקופיות ונוגדנים בשימוש כי הם מושכן fluorophores שונים. בעוד זה מגדיל את מספר אנטיגנים שניתן לנחקר, קיימות מספר מגבלות חשובות. ראשון, כי כל נוגדן בדרך כלל רק מצורף אחד fluorophore הבהירות היא לעתים קרובות לא חזק מספיק כדי להתגבר על הרקמה האוטומטית של רקמות. מסיבה זו, רוב IF מבוצע על רקמות קפואות אשר יקר לאחסן וקשה לעבוד עם. מספר מצומצם של תגי פלורסנט זמינים לשימוש עקב חפיפה ספקטרלית ומינים לחצות פעילות מחודשת במיוחד כאשר נוגדנים לא מצובית משמשים. זרימה cy, אשר מורכב עיבוד רקמות טריות לתוך השעיה תא אחד ותיוג עם נוגדנים פלורסנט היה תקן זהב עבור immunophenotyping קלדה במשך עשורים9,10. היתרון של cytometry זרימה היא היכולת לתייג נוגדנים מרובים בלי לדאוג מינים לחצות פעילות מחדש כמו רוב מצוחים. בגלל התאים הם "דמיינו" על ידי מכונה ולא העיניים האנושיות, יש fluorophores הרבה יותר זמין אבל זה מגיע עם עלות. יש לבצע פיצוי באופן ידני שיכול לשנות באופן משמעותי את התוצאות המייצרות אוכלוסיות חיוביות ושליליות כוזבות. המגבלה המשמעותית ביותר של הזרימה cy, מנסה להיות בארכיטקטורת רקמות ולאחר מכן כל מידע מרחבי אובד על-ידי הצורך עבור תאים בודדים ההשעיה.
באמצעות מיקרוסקופ פלורסנט אוטומטי בשילוב עם התוכנה הרומן משלבת את היתרונות של ihc, IF וזרימה cy, לנסות על ידי מתן מכתים רקמות רב אנטיגן עם הגברה האות ו שמירה על מערכות יחסים מרחבית ללא צורך בפיצוי. רקמת FFPE מושם על שקופיות טעונה אשר, לאחר אחזור אנטיגן, לעבור סיבוב של יישום הנוגדן העיקרי אנטיגן היעד של עניין ואחריו נוגדן משני עם תג כימי HRP, דומה ל-IHC. לאחר המיקום של הנוגדן המשני, תגובה מסוימת HRP התוצאות מחייב מחייבת fluorophore כריכה האפירופה של ריבית11. לאחר הרקמה מתויג, סיבוב נוסף של חימום השקופיות הושלמה הסרת מורכב הנוגדן העיקרי הקודם והמשני משאיר רק את תג פלורסנט מאוגד לרקמות הרקמה11. הדבר מאפשר למרוח מחדש נוגדנים מרובים של מינים כלשהם מבלי לדאוג לפעילות חוצת-שתיים11,12. כדי למזער כל צורך פיצוי ידני של צבעי פלורסנט מרובים, אוסף של fluorophores עם חפיפה מעט ספקטרלית כולל כתם גרעיני משמש להשלמת mfIHC. כדי להסביר את הגרסה האוטומטית הנתקלת עם רקמת FFPE, התוכנה מפחית את הקרינה האוטומטית מהתמונה הסופית באמצעות תמונה משקופית ריקה האפשרית בגלל כוחה של אנטיגן מסוים של פלואורסצנטית הבאים fluorophore . הגברה של האות שימוש בתוכניות הרומן המיועדות לערכות נתונים גדולות, ניתן לזהות ולנתח מיקומי תאים עבור הקשר מרחבי1,2,4. המגבלה המשמעותית ביותר של טכניקה זו היא זמן אופטימיזציה. מתודולוגיה מפורטת עם הנחיות לתכנון ניסיוני ולצביעת ואסטרטגיית דימות נמצאה כאן. mfIHC יהיה שימושי עבור מעבדות כי לא כרגע יש מערכת ממוטבת מכתים אוטומטית שרוצה להבין טוב יותר את ההקשר המרחבי של האינטראקציה תא לתאים ברקמת FFPE שלמים באמצעות הטכניקה הידנית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל העבודה אושרה על ידי לוח הביקורת הפנימית של אוניברסיטת מישיגן.
1. מיטוב נוגדנים ראשוניים והכנת שקופיות
- קביעת הריכוז האידיאלי של נוגדנים עבור מולטיפלקס באמצעות IHC קונבנציונאלי.
- בדקו את הנוגדנים לקולנוע באמצעות האימונוהיסטוכימיה הידנית (IHC)13.
- השתמש ברקמות ספציפיות שיש להם סוג תא שופע עבור כל נוגדן נבדק כגון באמצעות רקמת שקדים עבור בדיקות CD3 נוגדן.
- השתמש בריכוז הייחוס עבור IHC המומלץ על ידי החברה ולאחר מכן מלא IHC עם ריכוזי נוגדנים בריכוזים המומלצים, כמו גם ריכוזים מעל ומתחת לריכוז המומלץ.
- הכינו את הרקמה המוטבעת. של פורמאלין לשקופיות
- באמצעות מיקרוטומה, בלוקים לחתוך של רקמת ffpe בעובי בין 4 ו 6 יקרומטר ולהחיל על שקופיות טעונה.
הערה: השימוש במים מזוקקים מבטיח הרכבה נכונה של רקמות ודבקות ברחבי הקולנוע. - מניחים את השקופיות שטוחות, בצד הרקמה מעלה, ומאפשרים להתייבש ב-37 ° c למשך הלילה.
- אחסן שקופיות בתיבת שקופיות הרחק מטמפרטורה קיצונית עד שתהיה מוכן להשלמת המגה-בית.
- באמצעות מיקרוטומה, בלוקים לחתוך של רקמת ffpe בעובי בין 4 ו 6 יקרומטר ולהחיל על שקופיות טעונה.
2. שיטת הצביעת הכללי
- הכנת פתרונות כביסה ואחזור אנטיגן
- הכינו את פתרון השטיפה של 0.1% TBST על ידי ערבוב 9 L של מים מיוהים, 1 L של מלוחים באגירה טריס (TBS) ו-10 מ ל של פוליסורbate 20.
- להכין הן פתרונות אחזור אנטיגן (pH 6 ו-pH 9; רשימת חומרים) על-ידי דילול ל-1x עם מים מאוהים.
- לחות והתחדשות
- לאפות שקופיות, שוכב שטוח, רקמות למעלה ב 60 ° c עבור 1 h בתנור הכלאה1. הסר שקופיות מהתנור ואפשר לצנן לפחות 5 עד 10 דקות מקום במדף שקופיות אנכי.
- פנקו את השקופיות בפתרונות הבאים ברציפות: קסילן ב טרילקאט, ואחריו טיפול יחיד של 100% אתנול, 95% אתנול, ולבסוף 70% אתנול עבור 10 דקות כל אחד באמצעות מכתים שקופית ערכת1.
- שטוף את מתלה השקופיות במשך 2 דקות עם מים מיוהים על-ידי שטיפה בתיבת שקופיות פלסטיק ולאחריה קיבוע על-ידי שטיפת שקופיות בתיבת פלסטיק מלאה בפורמאלין נייטרלי עבור 30 דקות13. לשטוף את השקופיות במים מוכי 2 דקות ולאחר מכן להמשיך לאחזור אנטיגן.
- שליפת אנטיגן
- מניחים את מתלה השקופיות לתוך תיבה עמידים בחום ממולא לקו הפנימי (כ 300 mL) עם מאגר אחזור אנטיגן של pH 6 או pH 9.
הערה: מאגר אחזור אנטיגן יכול להיות pH 6 או pH 9 אשר עשוי להיות ממוטב לכל אפיפי. עם זאת, להתחיל באמצעות pH 9 עבור נוגדנים הכרוך באפיסקופים גרעיניים ו-pH 6 עבור כל הנוגדנים אחרים. - כסו את הקופסה בניילון נצמד והשתמשו בגומייה כדי לאבטח. מניחים את התיבה לתוך המיקרוגל בקצה הצלחת מסתובבת (מיקרוגל חייב להיות מצויד בטכנולוגיה מהפך לחימום אפילו). לחמם את השקופיות עבור 45 s ב 100% כוח ואחריו 15 דקות ב 20% כוח13.
הערה: טיפול במיקרוגל עשוי להזדקק למיטוב בהתאם למיקרוגל שבשימוש. - תנו לשקופיות להתקרר במשך כ-15-20 דקות.
- מניחים את מתלה השקופיות לתוך תיבה עמידים בחום ממולא לקו הפנימי (כ 300 mL) עם מאגר אחזור אנטיגן של pH 6 או pH 9.
- הכינו פתרונות עבודה של נוגדנים ו-fluorophores תוך שקופיות קריר.
- להכין את הנוגדן העיקרי מדלל על ידי המסת 0.5 g של סרום הפרה אלבומין לתוך 50 mL של TBST. לחילופין, השתמש 50 mL של מלוחים 1 x פוספט מאגור (PBS) כדי לפזר גרגירים.
- להפוך כל נוגדן העיקרי לעבוד פתרון ריכוז אופטימיזציה נקבע בסעיף 1, את הנוגדן העיקרי מדלל. הערכת כ-200 μL לכל שקופית.
- להכין את הפתרון fluorophore לעבוד על ידי דילול כל fluorophore ב fluorophore מדלל בריכוז של 1:100.
הערה: ייתכן שיהיה צורך למטב בהתאם לנוגדן. הערכת כ-100 μL לכל שקופית. - ביום האחרון של כתמים, להכין את 4 ′, 6-diamidino-2-פניינידול (DAPI) פתרון העבודה על ידי הוספת 3 טיפות של DAPI לתוך 1 מ ' TBST.
- מכתים שקופית (כביסה וחסימה)
- להסיר את הקופסה מהמייקרוגל לאחר קירור ולהסיר את עטיפת הפלסטיק, לשטוף את השקופיות עם מים מוכי עבור 2 דקות ואחריו 2 דקות לשטוף בתיבת שקופית פלסטיק מלא TBST13.
- לאחר ייבוש כל שקופית סביב הרקמה עם מחיקה עדין משימה להיזהר לא לתת את הרקמה להתייבש, מעקב סביב החלק החיצוני של הרקמה באמצעות עט המכשול הידרופובי. אין לגעת ברקמה עם מחיקה או עט משימה עדינה.
- מניחים כל שקופית בחדר החות ומוסיפים פתרון חסימה (כ -4 טיפות) לרקמה. מודטה למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
- מכתים שקופית (יישום נוגדן ראשי)
- קח כל שקופית והסר את פתרון החסימה על-ידי הקשה על צד השקופית על ערימת מגבות נייר ובאמצעות מחיקה עדינה של משימה כדי להסיר סוכן חוסם עודף מסביב לרקמה.
- הנח את השקופית חזרה לתוך החדר מחולל לחות ולהוסיף כ 200 μL של הנוגדן הראשי עובד. מודטה בחדר מחולל לחות במשך 1 h ב RT.
- לשטוף עם TBST עבור 2 דקות על ידי שייט בטריליטה13.
הערה: לאחר כל צעד שוטף, שינוי ה-TBST יסייע להבטיח דימוי נקי יותר.
- החלקת צביעת (יישום נוגדן משני)
- ביטול של TBST הנותרים מכל שקופית ולהחיל כ 3 כדי 4 טיפות של נוגדן משני (תערובת של ארנב ועכבר משני HRP נוגדנים מצופנים). המשך 10 דקות בחדר המיחולל. בשעה13
הערה: אם מתכנן להשתמש בנוגדן העיקרי המחייב נוגדן משני מאשר עכבר או ארנב או בחירה להשתמש בנוגדן משני חלופי, להחיל את HRP המתאים מעלה משני לשקופיות ו-הדגירה ב-RT עבור 45 דקות. אופטימיזציה של זמן דגירה עשוי להיות צורך עבור השני החלופי14. - לאחר הדגירה, לשטוף עם TBST עבור 2 דקות בטרילקאט13.
- ביטול של TBST הנותרים מכל שקופית ולהחיל כ 3 כדי 4 טיפות של נוגדן משני (תערובת של ארנב ועכבר משני HRP נוגדנים מצופנים). המשך 10 דקות בחדר המיחולל. בשעה13
- צביעת שקופיות (יישום fluorophore)
- החל כ 100 μL של פתרון העבודה fluorophore ו הדגירה בחדר מחולל לחות ב-RT עבור 10 דקות13.
- לשטוף עם TBST עבור 2 דקות בטריליטה13.
- הסרת נוגדנים
- שקופיות מיקרוגל (45 s ב 100% לאחר מכן 15 דקות ב -20%) בתיבה עמיד בחום (ראה שלב 2.3.2) להסרת נוגדנים13,14.
הערה: הדבר משלים סיבוב אחד של המגה-פלקס. זוהי הנקודה היחידה שבה ניתן להשהות את הפרוטוקול. כדי להשהות את הפרוטוקול, השאר את השקופיות מתחת למאגר אחזור האנטיגן לילה בטמפרטורת החדר.
- שקופיות מיקרוגל (45 s ב 100% לאחר מכן 15 דקות ב -20%) בתיבה עמיד בחום (ראה שלב 2.3.2) להסרת נוגדנים13,14.
- המשך סיבובים נוספים של כתמים. חזור על הצעדים 2.5.1-2.9.1 עבור שאר הצמדים-fluorophore. לאחר כל נוגדנים fluorophores השתמשו, להמשיך בסעיף 2.11.
- יישום DAPI והרכבה
- לאחר הסיבוב האחרון הכתים בתוך הקולנוע, להסיר את יישום הנוגדן האחרון עם הפתרון לאחזור אנטיגן pH 613. לשטוף עם מים מוכי ואחריו TBST עבור 2 דקות כל13.
- החל כ 150 μL של פתרון DAPI העבודה לשקופיות ו-דגירה בחדר מחולל לחות עבור 10 דקות ב-RT1.
- לשטוף עם TBST עבור כ 30 s ואת הכיסויים מחליק עם השוטר נגד עמעום. החל לק ציפורן ברור בארבע פינות של שמיכות פעם אחת המדיה ההרכבה התייבש כדי לאבטח coverslip (אופציונלי).
3. פרטים עבור הספריה, מונוליסים ומולטיפלקס
- בחרו שקופיות לבניית ספריית פלואורואופפור.
- עבור הקולנוע 7-צבע לאסוף 7 תאים חיסוניים שקופיות רקמות עשירות (כלומר, tonsil, טחול, וכו ') עבור הספריה.
הערה: בחר שקופיות בקרה שישמשו עבור ספריית fluorophore עם כל שקופית המייצגת כל פלואורואופפור ייחודיים שישמשו במגה-בית. שקופיות בקרה צריך להיות אפירופה שופע של הבחירה יכול להיות אותו סוג של רקמות עבור כל fluorophore.
- עבור הקולנוע 7-צבע לאסוף 7 תאים חיסוניים שקופיות רקמות עשירות (כלומר, tonsil, טחול, וכו ') עבור הספריה.
- שקופיות של ספריות כתמים ותמונות לשימוש עם מונוקסים וריבוב.
- בצע את השלבים 2.1 ל2.9.1 באמצעות שקופיות הבקרה ובקרת שקופיות רקמת הבחירה. מניחים פלואורואופפור שונים על כל שקופית בריכוז של 1:100; שקופית אחת צריכה להכיל DAPI בלבד.
- המשך לסעיף 2.11 למעט השמטת צביעת DAPI ובמקום זאת השתמש ב-TBST ו-mount כמתואר.
- לאחר שנתן שקופיות יבש בן לילה, התמונה עם כל הערוצים DAPI, CY3, CY5, CY7, טקסס האדום, מוליך למחצה נקודות קוואנטום, ופלואורואסעין isothiocyanate (FITC) הגדרת החשיפה 250 ms עם הגנה על הרוויה תכונה1.
הערה: ניתן לקבוע את זמני החשיפה ב-50-250 ms13. - העלה את תמונות הספרייה אל התוכנה והשתמש בניתוח של מונוליסים ומולטיפלקס.
- בחר שקופיות עבור מונוליסים.
- בחר שקופיות בקרה בעלי אפירופה שופע של בחירה המבוססת על נוגדנים ממוטבים (סעיף 1). עבור כל סיבוב של כתמים להתבצע באולמות הקולנוע, בחר את מספר שקופיות הבקרה כדי ליצור מונוליסים.
הערה: מטרת הונולקס היא לקבוע את המיקום הטוב ביותר (סדר) עבור כל נוגדן לשמש בחדרי הקולנוע.
- בחר שקופיות בקרה בעלי אפירופה שופע של בחירה המבוססת על נוגדנים ממוטבים (סעיף 1). עבור כל סיבוב של כתמים להתבצע באולמות הקולנוע, בחר את מספר שקופיות הבקרה כדי ליצור מונוליסים.
- . כתמי מונוליסים
- בצע את סעיפים 2.1 ל2.11 באמצעות הנוגדן העיקרי בסדר אחר (מיקום) עבור כל אחת מהשקופיות. כל שקופית צריכה להיות רק נוגדן ראשי אחד שהוחל בסדר (מיקום) שונה מהשקופיות האחרות.
הערה: עבור כל שקופית שבה הסיבוב קורא ללא נוגדן ראשוני או fluorophore במקום זאת להשתמש נוגדן העיקרי דילול ו fluorophore מדלל13.
- בצע את סעיפים 2.1 ל2.11 באמצעות הנוגדן העיקרי בסדר אחר (מיקום) עבור כל אחת מהשקופיות. כל שקופית צריכה להיות רק נוגדן ראשי אחד שהוחל בסדר (מיקום) שונה מהשקופיות האחרות.
- תמונה שקופיות ולנתח את הונולקס.
- באמצעות המיקרוסקופ וקביעת זמן חשיפה ל 250 ms עבור כל הערוצים ללכוד כל תמונה ניצול DAPI להתמקד.
הערה: ניתן לקבוע את זמני החשיפה ב-50/250 אלפיות14. - באמצעות תוכנת הניתוח להעריך כל שקופית מונולקס על ידי מסתכל על עוצמת פלורסנט של סמן מוכתם.
- השווה עוצמה זו לרקע. אם הוא גבוה פי 5 מאשר ברקע, מיקומו של שקופית זו הוא מיקום אופטימלי לשימוש בבית הקולנוע הסופי.
- באמצעות המיקרוסקופ וקביעת זמן חשיפה ל 250 ms עבור כל הערוצים ללכוד כל תמונה ניצול DAPI להתמקד.
- בחרו שקופיות למגה-פלקס.
- בחר את שקופיות הריבית והוסף שקופית נוספת שישמשו כשקופית ריקה עבור חיסור של פלואורסצנטית אוטומטי לאחר כתמים והדמיה.
- . להכתים את הקולנוע
- בהתבסס על תוצאות מונולקס, לבחור את הסדר המתאים (עמדות) עבור כל נוגדן מבוסס על שלב 3.5.3. הקצה כל פלואורואופפור לנוגדן.
הערה: ייתכן שיהיה צורך במיטוב; עם זאת, תוכנית להשתמש בנוגדנים בהירים עבור סמנים שופע פחות1, שיתוף נוגדנים לוקליזציה צריך להיות מותאם עם fluorophores במרחק נסרה מן השני13, ו fluorophores עם הספקטרום 540 ו 570 לא צריך להיות שיתוף מקומי בשל לחפיפה ספקטרלית בעיות1. - המשך עם סעיפים 2.1-2.11 המבטיח שהשקופית הריקה אינה מקבלת נוגדן ראשוני, fluorophore או DAPI, במקום זאת להשתמש בנוגדן מדלל, fluorophore מדלל, ו TBST בהתאמה במקומו.
- בהתבסס על תוצאות מונולקס, לבחור את הסדר המתאים (עמדות) עבור כל נוגדן מבוסס על שלב 3.5.3. הקצה כל פלואורואופפור לנוגדן.
- מולטיפלקס תמונה ולנתח עבור תקינות של צביעת
- באמצעות המיקרוסקופ וקביעת זמן חשיפה ל 250 ms עבור כל הערוצים, ללכוד כל תמונה ניצול DAPI להתמקד.
- באמצעות תוכנת הניתוח (טבלה של חומרים), להעריך כל מולטיפלקס על ידי צבע שווא פלורסנט.
הערה: תמונה ברורה צריך להדגים כל סמן בבירור. אם הסמן נראה מפוזר או גרעינית או לא קיים, סביר להניח כי הסמן לא עבד וצריך להיות ממוטב מחדש. - באמצעות תוכנת הניתוח, הערך כל מולטיפלקס באמצעות מראה פתולוגיה. הראייה הפתולוגית תאשר. את הספציפיות של כל סמן השווה ל-IHC בעבר אופטימיזציה (סעיף 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
התהליך הכולל של קבלת שיטת מולטיצבעוניות בעלת 7 צבעים מלווה בדפוס חוזר. איור 1 מתאר את התהליך בצורת דיאגרמה. ברגע שהגלשות מיובשות ומתייבשות או מתקבלות מהמעבדה ומעואפות בתנור הכלאה ב-60 ° c עבור 1, לאחר מכן המשיכו לדאפיזציה ומחזור, לתקן את השקופיות בפורמאלין שוב ולאחר מכן לאחר מכן על ידי אחזור אנטיגן. כל סיבוב של ריבוב מתחיל באחזור אנטיגן וגימורים בהסרת נוגדנים (איור 1).
אופטימיזציה של כל שלב בתהליך הוא העליונה כדי להשיג תמונה ברורה ושמיש. נוגדנים צריך להיבדק על ידי IHC הראשון באמצעות מאגרים אחזור אנטיגן עם pH 6 ו-pH 9 עבור כל נוגדן כדי להמחיש איזה מאגר לאחזור אנטיגן עובד הטוב ביותר עם זה נוגדן מסוים. בדרך כלל, מטרות גרעיניות להגיב לאחזור אנטיגן עם מאגר pH 9. לדוגמה, FOXP3 עובד הטוב ביותר כאשר מאגר אחזור אנטיגן של pH 9 משמש לעומת CD3 אשר עובד הטוב ביותר עם מאגר אחזור אנטיגן של pH 6. יש להשתמש בתמונות שנלקחו מתהליך ה-IHC כדי לאמת את הספציפיות של ניתוח המגה-בתים.
הכרחי לקבוע את הסדר. של כל נוגדן בבית הקולנוע בעת שימוש בערכת 4 או 7 צבעים, לכל נוגדן תהיה הזמנה מועדפת במערך. עבור מספר הנוגדנים שישמשו, אסוף את שקופיות הבקרה המתאימות (כלומר, עבור מולטיפלקס בן 7 צבעים שבהם צבע אחד הוא DAPI, בחר 6 שקופיות מסוימות של בקרת נציגים של המייצג עבור 6 fluorophores אחרים). איור 2 A-C היא ייצוג סכמטי של שיטת מונולקס באמצעות 3 שקופיות עם רקמת סרטן המעי הגס ffpe. כל שקופית יש FOXP3 במיקום אחר במערך באמצעות fluorophore 570 כתגית שלה. DAPI משמש ככתם מונה כדי להמחיש כראוי גרעינים. באיור 3, תמונות מייצגות של מונולקס ומולטיפלקס עם מיקום FOXP3 שונים מוצגים. באיור 3A, B שם FOXP3 נמצא במיקום השלישי (המתאים לסדר המוצג באיור 2c), כתמים ספציפיים וחזקים של FOXP3 (אדום) הוא ראה כפי הפגינו על ידי בהיר האטום מכתים איור 3a ושיתוף לוקליזציה עם CD3 איור 3B. עוצמת האות fluorophore מאשרת את הספציפיות של FOXP3 ללא כתמים לא ספציפיים במקום אחר בדמות רקמת 3A. באיור 3C, כאשר FOXP3 נמצא במיקום הראשון (המתאים לסדר באיור 2 א), יש כתמים לא ספציפיים של FOXP3. אזורים מוקפאים של כיסוי אדום המכסה את רוב השקופית ואת עוצמת פלורסנט באזורים אלה הם פחות מ 1. מנסה לעשות קולנוע ללא השלמת מונולקס הראשון כדי לבדוק את הסדר של תוצאות מכתים בתוצאה דומה יהיה לבזבז ריאגנטים. צעד קריטי נוסף שלא ניתן להתעלם ממנו בתהליך הקולנוע הוא צביעת DAPI. כתם עבודה של DAPI הוא הבסיס לזיהוי תאים וניתוח מרחבי נוסף באמצעות תוכנת הניתוח. ניגודיות חשובה ניתן לראות בתמונה מורכבת עם DAPI עובד (כחול) באיור 3E ו-dapi שאינו עובד באיור 3e. אין אפשרות להשתמש בתמונה באיור 3F כדי לזהות תאים בתוכנת הניתוח. ניסיון להציל את הקולנוע ואת ניתוח רקמות, coverslip אולי הוסרו על ידי השרטת השקופית ב TBST ואחריו צעד המיקרוגל ב-pH 6 מאגר אנטיגן לאחזור עם יישום נוסף של DAPI.
לאחר השלמת שינוי מונולקס הושלמה וסדר הנוגדן האופטימלי אישר, אסטרטגיה מולטיפלקס ניתן לבנות איור 4. עבור כל מטרה. יש לבחור בפלואורוורידים שונים המספר המשויך לכל fluorophore בערך מייצג את אורך הגל הניאון הספקטרלי הנפלט לאחר עירור, בדומה לזרימה cy, לנסות. טיפול צריך להילקח כאשר התאמה הציע נוגדנים עם fluorophores להגביל חפיפה ספקטרלית ודימום פוטנציאלי של סמנים. אסטרטגיה טובה היא לבחור אורכי גל הרחק זה מזה עבור נוגדנים שיתוף לוקליזציה כדי להפחית חפיפה ספקטרלית עודף מתן תמונה חדה ופנוטיפים אמין יותר13. לדוגמה, באסטרטגיה הקולנוע המוצג (איור 4), CD8 מזווג עם fluorophore 570 בעוד CD3 מזווג עם fluorophore 520. אחד צריך להימנע משימוש fluorophore 540 ו 570 במטרות שיתוף מקומי כמו אלה נוטים להיות בלתי מפלה ביותר והוא יכול לפגוע בתוצאות. Fluorophore 620 נוטה להיות בהיר מאוד, יש להשתמש בנוגדנים כי הם לא שופע ברקמה. הספרייה האחרונה המשמשת כהפניה עבור כל fluorophore גם מסייע בהפחתת חפיפה ספקטרלית של fluorophores. שקופית ריקה העוברת את כל הסיבובים של אחזור אנטיגן היא הכרחית כדי להבטיח הפקת קרינה אוטומטית מהתמונה המורכבת. שקופית ריקה זו תעבור את אותו הטיפול כמו שקופיות מולטיפלקס, למעט במקום הנוגדן העיקרי העבודה, fluorophore הנוגדן מדלל ו fluorophore מדלל בהתאמה לדמות 4B.
כדי להבטיח את העיצוב מולטיפלקס עבד כראוי את הסמנים לראות את התמונה המורכב הם ספציפיים, להשתמש "התמונה פתולוגיה" בשילוב עם "ברייטפילד" אפשרות ההגדרה באמצעות תוכנת מיקרוסקופ אשר יוצר תמונת IHC מזויף, אשר לאחר מכן יכול להיות בהשוואה ל-IHC הקודמת שנדונו בסעיף 1. למרבה הצער, תמונות מרוכבים יפה לא יכול בהכרח לשקף כתם מדויק וזה צעד חשוב לשלוט באיכות התהליך ולמנוע תוצאות חיוביות שווא. איור 5A מדגים תמונה מורכבת ללא חשש ראשוני. CD3 הוא דמיינו ומראה כתמים ספציפיים (ירוק) והוא מאושר על ידי התמונה פתולוגיה ברייטספילד באיור 5B. CD163 (כתום) נראה בתמונה ללא הפרדות צבע (איור 5A); עם זאת, בהערכת הפתולוגיה ברייטביט בשדה של CD163 (איור 5C), הנוגדן הוא לא ספציפי. דוגמה לתמונת מולטיפלקס מיטבית עם כתמים ספציפיים ממחישה בתמונה ללא הפרדות צבע (איור 5D). CD3 ו CD163 ספציפיות הוא אישר באמצעות השקפה ברייטפילד תצוגה (איור 5E ואיור 5e, בהתאמה) ומשווה לחיוב ihc הקודם ביצע באמצעות נוגדנים אלה (לא מוצג).
איור 1: צביעת דיאגרמת זרימת עבודה.
אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: ההתפתחות של מונולקס.
(A) סרטן המעי הגס עם FOXP3 במיקום 1. (ב) השקופית סרטן המעי הגס עם FOXP3 במיקום 2. (ג) סרטן המעי הגס שקופית עם FOXP3 במיקום 3. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: הצלחות ומלכודות של מונוקס ומולטיפלקס.
(A) מונולקס שיטת סרטן המעי הגס העיקרי עם FOXP3 במיקום 3, התווית עוצמת פלורסנט המוצגת. (ב) שיטת מולטיפלקס של סרטן המעי הגס העיקרי עם FOXP3 במיקום 3 ו CD3 במיקום 2. (ג) מונולקס שיטת הסרטן המעי הגס העיקרי עם FOXP3 במיקום 1, עוצמת הפלורסנט תווית המוצג. (ד) מולטיפלקס של סרטן המעי הגס העיקרי עם FOXP3 במיקום 1 ו CD3 במיקום 2. (ה) מולטיפלקס של סרטן המעי הגס העיקרי עם סדר של נוגדנים כדלקמן: CD8 (צהוב), CD3 (ירוק), CD163 (כתום), pancytokeratin (לבן), PD-L1 (מגנטה), FOXP3 (אדום), עובד dapi (כחול). (ו) מולטיפלקס של סרטן המעי הגס העיקרי עם סדר של נוגדנים כדלקמן: CD8 (צהוב), CD3 (ירוק), CD163 (כתום), pancytokeratin (לבן), PD-L1 (מגנטה), FOXP3 (אדום), לא עובד dapi (כחול). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: פיתוח מולטיפלקס.
(A) מולטיפלקס שקופית של סרטן המעי הגס ב 7-צבע מולטיפלקס. (ב) שקופית ריקה בתוך 7-צבעי מולטיפלקס באמצעות רקמת סרטן המעי הגס. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: ניתוח ספציפיות של מולטיפלקס עם 7 צבעים.
(א) דימוי משולב עם נוגדנים כדלקמן: CD8 (צהוב), CD3 (ירוק), CD163 (כתום), pancytokeratin (לבן), Ki67 (אדום), dapi (כחול). (ב) פתולוגיה ברייטבית תצוגה של התמונה בלוח A על CD3 בלבד. (ג) פתולוגיה ברייטביט השקפה של התמונה בלוח A על CD163 רק להציג. (ד) מולטיפלקס תמונה מורכבת עם נוגדנים כדלקמן: CD8 (צהוב), CD3 (ירוק), CD163 (כתום), pancytokeratin (לבן), PD-L1 (מגנטה), FOXP3 (אדום), dapi (כחול). (ה) פתולוגיה ברייטביט בשדה הראייה של התמונה בלוח D על CD3 בלבד. (ו) פתולוגיה ברייטביט בשדה הראייה של התמונה בלוח D על CD163 בלבד. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
דגימות רקמה שלמה של ביופסיה הגידול מוצק כריתת כירורגית להישאר כלים אבחון וחיזוי חשוב לניתוח מחלות, כמו גם פרוגנוזה המטופל. מולטיפלקס (mfIHC) היא טכניקה חדשנית המשלבת את היתרונות של אימונוהיסטוכימיה (IHC), immunofluorescence (IF) ולזרום cy,. השיטות הקודמות כדי לחקור את התאים באתרו הורשו הערכה של תא אל התא הסדרים בסביבה רקמה8, עם זאת, המספר הנמוך של האפיסקופים כי יכול להיות נחקר מגביל ניתוח מורכב. הזרימה cy, למרות שימושי בניתוח סוגי תאים רבים בדגימה, מאבד הקשר מרחבי על ידי הכוח של הכנת דגימות כמו תא אחד ההשעיה9,10. mfIHC מגשר על טכניקות אלה על ידי שמירה על ההקשר המרחבי של הסביבה התאית והגדלת מספר האפיסקופים שניתן לתייג תוך הגברת האות לכל אפירופה המסומן בתווית11. המחקר הקודם השתמש mfihc עבור פנוטיפים לחדור הסלולר בסרטן ודגימות שאינן סרטן רקמות1,2,3,4,5,15. ניתוח לאחר תמונה שימש גם כדי לנתח קשרים מרחביים של תאים ומבנים בתוך מיקרואקולוגיה רקמות1,2,4. לצורך ניתוח אמין, יש להפיק תחילה תמונה ספציפית ומדויקת. טכניקת הצביעה הידנית, בניגוד למערכת הצביעה האוטומטית, מאפשרת גישה למעבדות קטנות ומודעות בעלות המודע לטכנולוגיה זו. זמן אופטימיזציה הזמן מכתים הם בין המחסומים הגדולים ביותר להשגת תמונה אמינה עבור ניתוח מרחבי נוסף.
כמה כללים כלליים לשפר את הסבירות של דור מוצלח של תמונה משולבת אמין משולב יחסוך זמן ומשאבים. יש לבחור נוגדנים בתוך הקולנוע בהתאם להצלחה עם IHC קונבנציונליים באופן ידני. מאגרי האחזור אנטיגן עם pH 6 ו-pH 9 יש להשתמש ב-IHC כדי לחקור את האחזור אנטיגן המתאים לשימוש בתוך מולטיפלקס. פיתוח מונולקס הוא הכרחי כדי לזהות את המיקום של נוגדנים בתוך הפרוטוקול ריבוב. הרציונל לכך הוא מסובך ומשתנה בין דגימות רקמה לאפיסקופים. במקרים מסוימים, האפירופה יכול לבזות עם שלבים מרובים של המיקרוגל והדמיה של סמן אובד, כמו לעתים קרובות המקרה עם CD3. FOXP3, עם זאת, הופך להיות בהיר יותר עם שלבים יותר במיקרוגל והוא בקושי נראה אם ממוקם בסיבוב הראשון או השני של מולטיפלקס13,14.
תהליך הצביעת מתחיל ברקמת FFPE החתוכים לשקופיות טעונות. הבעיה הראשונה שניתן להיתקל בה היא הרקמה הנופלת מהשקופית לאחר המיקרוגל. כאשר שקופיות טעונה לא נעשה שימוש, הדבקות של הרקמה על פני השטח זכוכית מוגבלת, הרקמה יהיה קיפול מוגזם או עשוי להחליק לחלוטין. כדי להבטיח שהרקמה דבקה בשקופיות במהלך תהליך הצביעת, מתבצעות מספר טכניקות. הראשון בזמן חיתוך בלוקים על שקופיות, הצורה הטהורה ביותר של מים עובד הכי טוב. עבור מעבדות מסוימות, מים מיוהים עשויים להיות מספיקים אך מים מזוקקים עבדו הכי טוב. יש לייבש את השקופיות מיד לאחר קיצוץ של 37 ° c למשך הלילה. כדי להבטיח את הדבקות, השקופיות ממוקמות לאחר מכן בתנור הכלאה ושטוחות משאפות ב-60 ° c לשעה אחת בלבד לפני השימוש. למרות שקיבעון פורמאלין כבר אירע במהלך תהליך הכנת הרקמה הראשונית, הצבת השקופיות בטופסאגירה ניטראלית למשך 30 דקות לאחר שתהליך הספיגה והחידוש מגביר את השלמות המבנית של ההרכבה טישו1,13.
תהליך הצביעה הידנית יכול להימשך עד שלוש, שמונה שעות ימים, בהתאם למספר הנוגדנים הנמצאים בשימוש. הימנעות ממלכודות חיוני בחסכון זמן ומלא לחסוך ריאגנטים. הטעות הנפוצה הראשונה מתרחשת לעתים קרובות בהכנה מגיב. המים שונים בין מעבדות ויכולים להיות הבדל אחד בלבד בתוצאות ממעבדה אחת לשנייה. שימוש זהה, כמו גם מקור מים נקיים עבור כל התגובות והריאגנטים מבטיח תוצאה עקבית. הנוגדנים, פתרון חסימת, ו fluorophores לעבוד הכי טוב בטמפרטורת החדר. כדי למנוע מלכודות הכנה מגיב הפתרון העבודה, להשתמש באותו מים עבור כל הריאגנטים. גם להשתמש בכל הפתרונות עבודה וריאגנטים בטמפרטורת החדר.
פתרון בעיות של mfIHC חשוב ודבקות הנחיות מעבדה קפדנית קריטי כדי להגביל את הזיהום של רכיבים ו/או שגיאה המפעיל. ייצור של תמונות תת-אופטימלית יהיה להטות את התוצאות ולהוביל אוכלוסיות שווא חיוביים ושליליים תאים שיכולים להשפיע על הנתונים לרעה. בגלל הניתוח האולטימטיבי כולל בדרך כלל מחשב פנוטיפים שנוצרו בהתבסס על למידה מחשב, שגיאות קטנות בצביעת יכול להיות מוגדל כדי להשפיע על ערכת הנתונים כולה. לדוגמה, למרות שכל הכתמים עשויים לפעול באופן מושלם, שגיאה או השמטה של DAPI ימנעו פילוח של תאים עתידיים והספירה של הניסוי לא תהיה תועלת. תוכנת ניתוח משתמשת בצביעת DAPI לא רק כדי לזהות תאים, אלא מקצה קואורדינטות x ו-y לכל תא ואם למגה-בוקס יש עמעום, מעבר גרוע או כתמים מסוימים של DAPI, התמונה לא יכולה להיות בשימוש נוסף, והקולנוע חייב להיות משופץ או לנסות הצלה וצביעת מחדש של DAPI. השימוש ברכיבי תוכנה כגון תצוגות הפתולוגיה והברייטנטים ישפר את הביטחון ברגישות ובפירוט מוקדם יותר בתהליך האופטימיזציה וימנע טעויות בשלב מוקדם בתהליך הקולנוע.
ההיבטים השינוי של תהליך הדימות יכולים גם לסייע במיטוב התמונה. לדוגמה, לקיחת תמונה באמצעות DAPI כעזר חזותי להתמקד מסייע להימנע מתמונות מטושטשות. הוספת הספרייה fluorophore החדש שנעשו לתוכנה תבטיח תמונה נקייה וחפיפה פחות ספקטרלית של כל fluorophore במהלך שלב ניתוח באמצעות שקופית ריקה כדי לחלץ את הזריחה האוטומטית מגביר את סמנים ומשפר את התמונה איכות.
השימוש בדגימות רקמות יש ויישאר ככלי חיוני בחקירת pathפסיולוגיה של מחלות. הטכנולוגיה המתעוררים הגדילה את ההבנה שלנו של אינטראקציות תא לתאים ו-mfIHC הוא שחקן חדש ומבטיח. אופטימיזציה ודיוק במהלך תהליך הצביעת בטכניקה זו היא העליונה עבור ניצול תקין וניתוח נוסף של אינטראקציות תא לתאים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
המחברים רוצים להודות לאד סטאק, בעבר Perkin אלמר, על עזרתו עם התקנה ואופטימיזציה של הצביעת המקורי של הקולנוע. המחברים רוצים גם להודות לקריסטן שמידט מתוך מדעי הביולוגיה לטיפים באמצעות תוכנת הניתוח. מחקרים שדווחו בפרסום זה נתמכים על ידי המכון הלאומי לבריאות הסרטן תחת הפרס מספר P30CA046592, K08CA201581 (tlf), K08CA234222 (js), R01CA15158807 (mpm), RSG1417301CSM (mpm), R01CA19807403 (mpm), U01CA22414501 (mpm, hc), CA170568 (hc). התוכן הינו באחריות המחברים בלבד ואינו מייצג בהכרח את ההשקפות הרשמיות של המכון הלאומי לבריאות. תמיכה נוספת סופקה על ידי Jeffery A. קולבי קולון סרטן ו טום ליאו מחקר קרנות.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100% ethanol | Fisher | HC8001GAL | |
| 70% ethanol | Fisher | HC10001GL | |
| 95% ethanol | Fisher | HC11001GL | |
| Analysis software | Akoya Biosciences | CLS135783 | inForm version 2.3.0 |
| Antifade mountant | ThermoFisher | P36961 | ProLong Diamond |
| Blocking solution | Vector | SP-6000 | Bloxall |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Life Sciences | A9647-100G | |
| Cover Slips | Fisher | 12-548-5E | |
| Delicate task wipe | Kimberly-Clark | 34120 | |
| Fluorescent diluent | Akoya Biosciences | ARD1A01EA | Opal TSA diluent |
| Fluorophore 520 | Akoya Biosciences | FP1487001KT | 1:100 |
| Fluorophore 540 | Akoya Biosciences | FP1494001KT | 1:100 |
| Fluorophore 570 | Akoya Biosciences | FP1488001KT | 1:100 |
| Fluorophore 620 | Akoya Biosciences | FP1495001KT | 1:100 |
| Fluorophore 650 | Akoya Biosciences | FP1496001KT | 1:100 |
| Fluorophore 690 | Akoya Biosciences | FP1497001KT | 1:100 |
| Fluorophore DAPI | Akoya Biosciences | FP1490 | 3 drops in TBST or PBS |
| Heat resistant box | Tissue-Tek | 25608-904 | Plastic slide box-green |
| Humidified Chamber | Ibi Scientific | AT-12 | |
| Hybridization oven | FisherBiotech | ||
| Hydrophobic barrier pen | Vector | H-4000 | ImmEdge |
| Microscope | Perkin Elmer | CLS140089 | Mantra quantitative pathology workstation |
| Microwave | Panasonic | NN-A661S | with inverter technology |
| Neutral buffered formalin | Fisher Scientific | SF100-4 | 10% neutral buffered formalin |
| pH 6 antigen retrieval buffer | Akoya Biosciences | AR600 | AR6 |
| pH 9 antigen retrieval buffer | Akoya Biosciences | AR900 | AR9 |
| Phosphate buffered saline | Fisher | BP3994 | PBS |
| Plastic slide box | Tissue-Tek | 25608-906 | |
| Plastic wrap | Fisher | NC9070936 | |
| Polysorbate 20 | Fisher | BP337-800 | Tween 20 |
| Primary antibody CD163 | Lecia | NCL-LCD163 | 1:400 |
| Primary antibody CD3 | Dako | A0452 | 1:400 |
| Primary antibody CD8 | Spring Bio | M5390 | 1:400 |
| Primary antibody FOXP3 | Dako | M3515 | 1:400 |
| Primary antibody pancytokeratin | Cell Signaling | 12653 | 1:500 |
| Primary antibody PD-L1 | Cell Signaling | 13684 | 1:200 |
| Secondary antibody | Akoya Biosciences | ARH1001EA | Opal polymer |
| Slide stain set | Electron Microscopy Sciences | 6254001 | |
| Tris buffered saline | Corning | 46-012-CM | TBS |
| Vertical slide rack | Electron Microscopy Sciences | 50-294-72 | |
| Xylene | Fisher | X3P1GAL |
References
- Lazarus, J., et al. Spatial and phenotypic immune profiling of metastatic colon cancer. JCI Insight. 3 (22), (2018).
- Barua, S., et al. A Functional Spatial Analysis Platform for Discovery of Immunological Interactions Predictive of Low-Grade to High-Grade Transition of Pancreatic Intraductal Papillary Mucinous Neoplasms. Cancer Informatics. 17, 1176935118782880 (2018).
- Yang, L., Liu, Z., Tan, J., Dong, H., Zhang, X. Multispectral imaging reveals hyper active TGF-beta signaling in colorectal cancer. Cancer Biology & Therapy. 19 (2), 105-112 (2018).
- Carstens, J. L., et al. Spatial computation of intratumoral T cells correlates with survival of patients with pancreatic cancer. Nature Communications. 8, 15095 (2017).
- Steele, K. E., Brown, C. Multiplex Immunohistochemistry for Image Analysis of Tertiary Lymphoid Structures in Cancer. Methods In Molecular Biology. 1845, 87-98 (2018).
- Gorris, M. A. J., et al. Eight-Color Multiplex Immunohistochemistry for Simultaneous Detection of Multiple Immune Checkpoint Molecules within the Tumor Microenvironment. The Journal Of Immunology. 200 (1), 347-354 (2018).
- Parra, E. R., et al. Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues. Scientific Reports. 7, (2017).
- Katikireddy, K. R., O'Sullivan, F. Immunohistochemical and immunofluorescence procedures for protein analysis. Methods In Molecular Biology. 784, 155-167 (2011).
- Adan, A., Alizada, G., Kiraz, Y., Baran, Y., Nalbant, A. Flow cytometry: basic principles and applications. Critical Reviews In Biotechnology. 37 (2), 163-176 (2017).
- Zaritskaya, L., Shurin, M. R., Sayers, T. J., Malyguine, A. M. New flow cytometric assays for monitoring cell-mediated cytotoxicity. Expert Review of Vaccines. 9 (6), 601-616 (2010).
- Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70 (1), 46-58 (2014).
- Zhang, W., et al. Fully automated 5-plex fluorescent immunohistochemistry with tyramide signal amplification and same species antibodies. Laboratory Investigation. 97 (7), 873-885 (2017).
- Phenoptics Research Solutions. Perkin Elmer Manual. , 32 (2016).
- Opal Multiplex IHC Assay Development Guide. , Perkin Elmer Manual. (2014).
- Carey, C. D., et al. Topological analysis reveals a PD-L1-associated microenvironmental niche for Reed-Sternberg cells in Hodgkin lymphoma. Blood. 130 (22), 2420-2430 (2017).
