手动复用荧光免疫学的优化、设计和避免陷阱
Summary
多路荧光免疫组织化学是一项新兴技术,能够可视化完整形式固定的石蜡嵌入(FFPE)组织内的多种细胞类型。介绍了确保成功7色多路复用的指南,其中包含优化抗体和试剂、准备幻灯片、设计和避免常见问题的技巧的说明。
Abstract
对完整组织进行微环境评估,用于分析细胞渗透和空间组织,对于了解疾病过程的复杂性至关重要。过去使用的主要技术包括免疫组织化学 (IHC) 和免疫荧光 (IF),这些技术能够使用 1 到 4 个标记将细胞可视化为快照。这两种技术都有缺点,包括难以染色不良的抗原靶点和与跨物种反应相关的局限性。IHC 是可靠和可重现的,但化学性质和对可见光光谱的依赖只允许使用几个标记,使共同本地化具有挑战性。使用IF拓宽了潜在的标记,但通常依赖于冷冻组织,由于形式固定后广泛的组织自荧光。流式细胞学,一种能够同时标记多个表位的技术,可消除IF和IHC的许多缺陷,然而,需要将细胞作为单个细胞悬浮液检查,从而失去了放弃重要生物的细胞的空间环境关系。多路复用荧光免疫组织化学 (mfIHC) 桥接这些技术,允许在形式固定石蜡嵌入 (FFPE) 组织中进行多表细胞表型,同时保留整体微环境架构和空间完整未破坏组织内细胞的关系。高荧光强度荧光荧光荧光荧光荧光荧光荧光 , 共价结合组织表位 , 使初级抗体的多种应用 , 而不必担心二次抗体的物种特异叉反应。尽管该技术已被证明能够产生可靠和准确的疾病研究图像,但由于广泛的优化和设计,创建有用的 mfIHC 染色策略的过程可能非常耗时且耗时。为了制作能够准确定位的细胞交互的可靠图像,并减轻手动分析的优化周期,这里介绍了用于幻灯片准备、优化抗体、多路复用设计以及错误的方法在染色过程中经常遇到。
Introduction
完整的肿瘤微环境(TME)的可视化对于评估固体恶性肿瘤中的细胞渗透以及细胞与细胞的相互作用至关重要。多路荧光免疫组织化学(mfIHC)已成为研究癌症和相关疾病1、2、3、4, 5,6,7.这与设计用于分析大型数据集的新型软件和程序相结合,能够观察单元1、2、4之间的复杂相互作用。数据采集中的速率限制因子通常是分析前染色组织的质量。
以前用于 TME 中表型细胞的技术包括免疫组织化学 (IHC)、免疫荧光 (IF) 和流式细胞学,所有这些都存在重大限制。IHC使用形式固定石蜡嵌入(FFPE)组织部分,在被最常见的一种抗体染色之前,这些组织部分是去蜡化和再水化的。使用马萝卜过氧化物酶 (HRP) 结合二级抗体和化学反应允许可视化单个抗原表位8。虽然IHC是可靠的,并在FFPE组织上执行,这是容易使用,对可见光光谱的限制意味着只有一个或两个标记可以可靠地区分和共定位抗原相当困难8。扩展可用标记物,因此可在单个部分探测抗原的一种方法是更改为荧光,从而允许使用更广泛的视觉光谱。对于IF,冷冻或FFPE组织被转移到幻灯片上,并结合各种荧光团使用的抗体。虽然这会增加可以探测的抗原的数量,但有几个重要的局限性。首先,由于每个抗体通常只有一个荧光团,亮度通常不足以克服组织自荧光。正因如此,大多数IF是在冷冻组织上执行的,这种组织储存成本高昂,难以使用。由于光谱重叠和跨物种反应,可以使用数量有限的荧光标记,特别是在使用非结合抗体时。流动细胞学,包括新鲜组织加工成单个细胞悬浮液和荧光抗体标签,是免疫吸血功能的几十年9,10的黄金标准。流式细胞学的一个好处是能够标记多个抗体,而不必担心物种交叉反应,因为大多数是结合的。因为细胞是由机器而不是人眼”可视化”的,因此有更多的荧光道可用,但这样做是有代价的。补偿必须手动进行,这能显著改变产生假阳性和阴性群体的结果。流动细胞学的最大限制是组织架构和随后的所有空间信息因单细胞悬浮的必要性而丢失。
使用自动荧光显微镜与新型软件相结合的多路荧光免疫组织化学 (mfIHC) 结合了 IHC、IF 和流式细胞学的优点,允许多抗原组织染色,并实现信号扩增和无需补偿即可保留空间关系。FFPE组织被放置在带电的幻灯片上,在抗原检索后,对目标抗原进行一轮初级抗体应用,然后使用具有HRP化学标记的次级抗体,类似于IHC。放置二级抗体后,HRP特异性反应导致荧光团与兴趣表位11共价结合。一旦组织被标记,另一轮加热幻灯片完成删除先前应用的初级和二级抗体复合物只留下荧光标记绑定到组织表位11。这允许任何物种的多种抗体重新应用,而不必担心交叉反应11,12。为了尽量减少对多种荧光染料的人工补偿的需要,使用一组光谱重叠小(包括核计数器染色)的荧光光道来完成 mfIHC。为了考虑 FFPE 组织遇到的自荧光,软件使用空白幻灯片中的图像从最终图像中减去自荧光,这可能是由于荧光后抗原特异性荧光的强度信号放大。使用专为大型数据集设计的新型程序,可以识别和分析空间上下文1、2、4 的单元位置。该技术最大的限制是优化时间。此处提供了包含实验设计和染色和成像策略说明的详细方法。mfIHC 将可用于目前尚未优化的自动染色系统的实验室,该系统希望使用手动技术更好地了解完整 FFPE 组织中细胞与细胞间相互作用的空间环境。
Protocol
Representative Results
Discussion
固体肿瘤活检和手术切除的结块组织标本仍然是疾病分析和患者预后的重要诊断和预测工具。多路复用荧光免疫组织化学(mfIHC)是一种将免疫组织化学(IHC)、免疫荧光(IF)和流式细胞学的优点相结合的新技术。以前在原位探测细胞的方法允许评估细胞与细胞在组织环境中的排列8,然而,可探测的表位数量少限制了复杂的分析。流式细胞测定,虽然在分析标本中的许多细胞类型时很有用,?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
作者要感谢EdStack,以前来自珀金埃尔默,他协助设置和优化原始多路复用染色。作者还希望感谢来自阿科亚生物科学的克里斯汀·施密特使用分析软件的提示。本出版物中报道的研究得到了国家癌症研究所的支持,奖励编号为P30CA046592, K08CA201581(tlf),K08CA234222(js),R01CA15158807(mpm),RSG1417301CSM(mpm),R01CA19807403(mpm),U01CA22414501(mpm,hc),CA170568 (hc)。内容完全由作者负责,不一定代表国家卫生研究院的官方观点。杰弗瑞·科尔比结肠癌和汤姆·刘纪念研究基金提供了额外的支持。
Materials
| 100% ethanol | Fisher | HC8001GAL | |
| 70% ethanol | Fisher | HC10001GL | |
| 95% ethanol | Fisher | HC11001GL | |
| Analysis software | Akoya Biosciences | CLS135783 | inForm version 2.3.0 |
| Antifade mountant | ThermoFisher | P36961 | ProLong Diamond |
| Blocking solution | Vector | SP-6000 | Bloxall |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Life Sciences | A9647-100G | |
| Cover Slips | Fisher | 12-548-5E | |
| Delicate task wipe | Kimberly-Clark | 34120 | |
| Fluorescent diluent | Akoya Biosciences | ARD1A01EA | Opal TSA diluent |
| Fluorophore 520 | Akoya Biosciences | FP1487001KT | 1:100 |
| Fluorophore 540 | Akoya Biosciences | FP1494001KT | 1:100 |
| Fluorophore 570 | Akoya Biosciences | FP1488001KT | 1:100 |
| Fluorophore 620 | Akoya Biosciences | FP1495001KT | 1:100 |
| Fluorophore 650 | Akoya Biosciences | FP1496001KT | 1:100 |
| Fluorophore 690 | Akoya Biosciences | FP1497001KT | 1:100 |
| Fluorophore DAPI | Akoya Biosciences | FP1490 | 3 drops in TBST or PBS |
| Heat resistant box | Tissue-Tek | 25608-904 | Plastic slide box-green |
| Humidified Chamber | Ibi Scientific | AT-12 | |
| Hybridization oven | FisherBiotech | ||
| Hydrophobic barrier pen | Vector | H-4000 | ImmEdge |
| Microscope | Perkin Elmer | CLS140089 | Mantra quantitative pathology workstation |
| Microwave | Panasonic | NN-A661S | with inverter technology |
| Neutral buffered formalin | Fisher Scientific | SF100-4 | 10% neutral buffered formalin |
| pH 6 antigen retrieval buffer | Akoya Biosciences | AR600 | AR6 |
| pH 9 antigen retrieval buffer | Akoya Biosciences | AR900 | AR9 |
| Phosphate buffered saline | Fisher | BP3994 | PBS |
| Plastic slide box | Tissue-Tek | 25608-906 | |
| Plastic wrap | Fisher | NC9070936 | |
| Polysorbate 20 | Fisher | BP337-800 | Tween 20 |
| Primary antibody CD163 | Lecia | NCL-LCD163 | 1:400 |
| Primary antibody CD3 | Dako | A0452 | 1:400 |
| Primary antibody CD8 | Spring Bio | M5390 | 1:400 |
| Primary antibody FOXP3 | Dako | M3515 | 1:400 |
| Primary antibody pancytokeratin | Cell Signaling | 12653 | 1:500 |
| Primary antibody PD-L1 | Cell Signaling | 13684 | 1:200 |
| Secondary antibody | Akoya Biosciences | ARH1001EA | Opal polymer |
| Slide stain set | Electron Microscopy Sciences | 6254001 | |
| Tris buffered saline | Corning | 46-012-CM | TBS |
| Vertical slide rack | Electron Microscopy Sciences | 50-294-72 | |
| Xylene | Fisher | X3P1GAL |
References
- Lazarus, J., et al. Spatial and phenotypic immune profiling of metastatic colon cancer. JCI Insight. 3 (22), (2018).
- Barua, S., et al. A Functional Spatial Analysis Platform for Discovery of Immunological Interactions Predictive of Low-Grade to High-Grade Transition of Pancreatic Intraductal Papillary Mucinous Neoplasms. Cancer Informatics. 17, 1176935118782880 (2018).
- Yang, L., Liu, Z., Tan, J., Dong, H., Zhang, X. Multispectral imaging reveals hyper active TGF-beta signaling in colorectal cancer. Cancer Biology & Therapy. 19 (2), 105-112 (2018).
- Carstens, J. L., et al. Spatial computation of intratumoral T cells correlates with survival of patients with pancreatic cancer. Nature Communications. 8, 15095 (2017).
- Steele, K. E., Brown, C. Multiplex Immunohistochemistry for Image Analysis of Tertiary Lymphoid Structures in Cancer. Methods In Molecular Biology. 1845, 87-98 (2018).
- Gorris, M. A. J., et al. Eight-Color Multiplex Immunohistochemistry for Simultaneous Detection of Multiple Immune Checkpoint Molecules within the Tumor Microenvironment. The Journal Of Immunology. 200 (1), 347-354 (2018).
- Parra, E. R., et al. Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues. Scientific Reports. 7, (2017).
- Katikireddy, K. R., O’Sullivan, F. Immunohistochemical and immunofluorescence procedures for protein analysis. Methods In Molecular Biology. 784, 155-167 (2011).
- Adan, A., Alizada, G., Kiraz, Y., Baran, Y., Nalbant, A. Flow cytometry: basic principles and applications. Critical Reviews In Biotechnology. 37 (2), 163-176 (2017).
- Zaritskaya, L., Shurin, M. R., Sayers, T. J., Malyguine, A. M. New flow cytometric assays for monitoring cell-mediated cytotoxicity. Expert Review of Vaccines. 9 (6), 601-616 (2010).
- Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70 (1), 46-58 (2014).
- Zhang, W., et al. Fully automated 5-plex fluorescent immunohistochemistry with tyramide signal amplification and same species antibodies. Laboratory Investigation. 97 (7), 873-885 (2017).
- Phenoptics Research Solutions. . Perkin Elmer Manual. , 32 (2016).
- . . Opal Multiplex IHC Assay Development Guide. , (2014).
- Carey, C. D., et al. Topological analysis reveals a PD-L1-associated microenvironmental niche for Reed-Sternberg cells in Hodgkin lymphoma. Blood. 130 (22), 2420-2430 (2017).
