Summary
La inmunohistoquímica fluorescente multiplex es una tecnología emergente que permite la visualización de múltiples tipos de células dentro del tejido integrado en parafina (FFPE) fijo en formalina. Se presentan pautas para asegurar un multiplex de 7 colores exitoso con instrucciones para optimizar anticuerpos y reactivos, preparar diapositivas, diseño y consejos para evitar problemas comunes.
Abstract
La evaluación del microambiente del tejido intacto para el análisis de la infiltración celular y la organización espacial son esenciales para comprender la complejidad de los procesos de la enfermedad. Las técnicas principales utilizadas en el pasado incluyen inmunohistoquímica (IHC) e inmunofluorescencia (IF) que permiten la visualización de las células como una instantánea en el tiempo utilizando entre 1 y 4 marcadores. Ambas técnicas tienen deficiencias, incluida la dificultad para manchar objetivos malgénicos y limitaciones relacionadas con la reactividad entre especies. IHC es confiable y reproducible, pero la naturaleza de la química y la dependencia del espectro de luz visible permite utilizar sólo unos pocos marcadores y hace que la colocalización sea un reto. El uso de IF amplía los marcadores potenciales, pero normalmente se basa en el tejido congelado debido a la extensa autofluorescencia del tejido después de la fijación de formalina. La citometría de flujo, una técnica que permite el etiquetado simultáneo de múltiples epítopos, deroga muchas de las deficiencias de IF e IHC, sin embargo, la necesidad de examinar las células como una suspensión de una sola célula pierde el contexto espacial de las células que descartan Relaciones. La inmunohistoquímica fluorescente multiplex (mfIHC) puentes de estas tecnologías que permiten el fenotipado celular multiepitope en tejido de parafina fija inhacina (FFPE) de formalina, preservando al mismo tiempo la arquitectura general del microambiente y el espacio relación de las células dentro del tejido intacto no interrumpido. Los fluoróforos de alta intensidad fluorescente que se unen covalentemente al epítopo tisular permiten múltiples aplicaciones de anticuerpos primarios sin preocuparse de la reactividad cruzada específica de la especie por anticuerpos secundarios. Aunque se ha demostrado que esta tecnología produce imágenes fiables y precisas para el estudio de enfermedades, el proceso de creación de una estrategia de tinción mfIHC útil puede llevar mucho tiempo y ser exigente debido a la amplia optimización y diseño. Con el fin de hacer imágenes robustas que representen interacciones celulares precisas in situ y para mitigar el período de optimización para el análisis manual, presentados aquí son métodos para la preparación de diapositivas, optimización de anticuerpos, diseño multiplex, así como errores, así como errores comúnmente durante el proceso de tinción.
Introduction
La visualización de un microambiente tumoral intacto (TME) es esencial para evaluar no sólo la infiltración celular en neoplasias malignas sólidas, sino también las interacciones de células a células. La inmunohistoquímica fluorescente multiplex (mfIHC) ha surgido como una herramienta eficaz para el fenotipado multiantígeno de células en el estudio del cáncer y las enfermedades asociadas1,2,3,4, 5,6,7. Esto, en combinación con nuevos programas y software diseñados para analizargrandes conjuntos de datos, permite la observación de interacciones complejas entre las células 1,2,4. El factor limitante de la velocidad en la adquisición de datos es a menudo la calidad del tejido manchado antes del análisis.
Las técnicas anteriores utilizadas para las células fenotipo en el TME incluyen inmunohistoquímica (IHC), inmunofluorescencia (IF) y citometría de flujo, todas las cuales presentan limitaciones significativas. IHC utiliza secciones de tejido de parafina fija incrustada de formalina (FFPE) que se deparan y rehidratan antes de ser manchadas por la mayoría de las veces un anticuerpo. El uso de un anticuerpo secundario ligado a la peroxidasa de rábano picante(HRP) y una reacción química permite la visualización de un solo epítopo antigénico 8. Mientras que IHC es confiable y se realiza en el tejido FFPE que es fácil de trabajar con, limitaciones al espectro de luz visible significa que sólo uno o dos marcadores pueden ser confiables distinguidos y la colocación de antígenos bastante difícil8. Una forma de ampliar los marcadores disponibles y, por lo tanto, los antígenos que se pueden sondear en una sola sección es cambiar a fluorescencia que permite el uso de una gama más amplia del espectro visual. Para IF, el tejido congelado o FFPE se transfiere a diapositivas y anticuerpos utilizados que se conjugan a varios fluoróforos. Si bien esto aumenta el número de antígenos que se pueden sondear, hay varias limitaciones importantes. En primer lugar, debido a que cada anticuerpo normalmente sólo tiene un fluoróforo unido, el brillo a menudo no es lo suficientemente fuerte como para superar la autofluorescencia tisular. Es por esta razón, la mayoría de IF se realiza en tejido congelado que es caro de almacenar y difícil de trabajar con. Un número limitado de etiquetas fluorescentes están disponibles para su uso debido a la superposición espectral y la reactividad de las especies cruzadas, especialmente cuando se utilizan anticuerpos no conjugados. La citometría de flujo, que consiste en el procesamiento de tejido fresco en una suspensión de una solacélula y el etiquetado con anticuerpos fluorescentes ha sido el estándar de oro para el inmunofenotipado durante décadas 9,10. Un beneficio de la citometría de flujo es la capacidad de etiquetar múltiples anticuerpos sin preocupación por la reactividad cruzada de las especies, ya que la mayoría se conjugan. Debido a que las células son "visualizadas" por una máquina y no los ojos humanos, hay muchos más fluoróforos disponibles, pero esto tiene un costo. La compensación debe hacerse manualmente, lo que puede alterar significativamente los resultados produciendo poblaciones falsas positivas y negativas. La limitación más significativa de la citometría de flujo es que la arquitectura tisular y posteriormente toda la información espacial se pierde por la necesidad de la suspensión de células individuales.
La inmunohistoquímica fluorescente multiplex (mfIHC) utilizando un microscopio fluorescente automatizado en combinación con un software novedoso combina los beneficios de IHC, IF y la citometría de flujo al permitir la tinción de tejido multiantígeno con amplificación de señal y retención de relaciones espaciales sin necesidad de compensación. El tejido FFPE se coloca en diapositivas cargadas que, después de la recuperación del antígeno, se someten a una ronda de aplicación de anticuerpos primarios al antígeno objetivo de interés seguido de un anticuerpo secundario con una etiqueta química HRP, similar a IHC. Después de la colocación del anticuerpo secundario, una reacción específica de HRP da como resultado una unión covalente de fluoróforo al epítopo de interés11. Una vez que el tejido está etiquetado, se completa otra ronda de calentamiento de las diapositivas eliminando el complejo de anticuerpos primarios y secundarios previamente aplicados dejando sólo la etiqueta fluorescente unida al epítopo de tejido11. Esto permite que múltiples anticuerpos de cualquier especie sean reaplicados sin preocupación por la reactividad cruzada11,12. Para minimizar cualquier necesidad de compensación manual de múltiples colorantes fluorescentes, se utiliza una colección de fluoróforos con poca superposición espectral, incluida una mancha de contador nuclear, para completar el mfIHC. Para tener en cuenta la autofluorescencia encontrada con el tejido FFPE, el software resta la autofluorescencia de la imagen final utilizando una imagen de una diapositiva en blanco que es posible debido a la fuerza de fluorescencia específica de antígeno después del fluoróforo amplificación de la señal. Utilizando programas novedosos diseñados para grandes conjuntos de datos, las ubicaciones de celdas se pueden identificar y analizar para el contexto espacial1,2,4. La limitación más significativa de esta técnica es el tiempo de optimización. Una metodología detallada con instrucciones para el diseño experimental y la estrategia de tinción e imagen se encuentra aquí. mfIHC será útil para laboratorios que actualmente no tienen un sistema de tinción automatizado optimizado que le gustaría entender mejor el contexto espacial de las interacciones de célula a célula en el tejido FFPE intacto utilizando la técnica manual.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Todo el trabajo ha sido aprobado por la junta de revisión interna de la Universidad de Michigan.
1. Optimización de anticuerpos primarios y preparación de diapositivas
- Determinar la concentración ideal de anticuerpos para multiplex utilizando IHC convencional.
- Pruebe los anticuerpos para el multiplex mediante inmunohistoquímica convencional manual (IHC)13.
- Utilice tejidos específicos que tengan un tipo de célula abundante para cada anticuerpo analizado, como el uso de tejido de amígdala para pruebas de anticuerpos CD3.
- Utilice la concentración de referencia para IHC recomendada por la empresa y luego complete el IHC con concentraciones de anticuerpos a las concentraciones recomendadas, así como las concentraciones superiores y inferiores a la concentración recomendada.
- Prepare el tejido incrustado de parafina fija de formalina en las diapositivas.
- Usando un microtome, corte bloques de tejido FFPE a un espesor de entre 4 y 6 m y aplíquelos a las diapositivas cargadas.
NOTA: El uso de agua destilada garantiza un montaje y adherencia adecuados del tejido en todo el multiplex. - Coloque las diapositivas planas, el lado del tejido hacia arriba y deje secar a 37 oC durante la noche.
- Guarde las diapositivas en una caja deslizante lejos de las temperaturas extremas hasta que estén listas para completar el multiplex.
- Usando un microtome, corte bloques de tejido FFPE a un espesor de entre 4 y 6 m y aplíquelos a las diapositivas cargadas.
2. Método general de tinción
- Preparación de soluciones de lavado y recuperación de antígenos
- Preparar la solución de lavado de 0,1% TBST mezclando 9 L de agua desionizada, 1 L de solución salina tamponada (TBS) y 10 ml de polisorbato 20.
- Preparar ambas soluciones de recuperación de antígenos (pH 6 y pH 9; Tabla de Materiales) diluyendo a 1x con agua desionizada.
- Desparafinación y rehidratación
- Hornee los portaobjetos, acostados, el lado del tejido hacia arriba a 60 oC durante 1 h en un horno de hibridación1. Retire los portaobjetos del horno y deje enfriar durante al menos 5 x 10 minutos y luego colóquelos en un portaobjetos vertical.
- Tratar las diapositivas en las siguientes soluciones secuencialmente: xileno en triplicado, seguido de un único tratamiento de 100% etanol, 95% etanol, y por último 70% etanol para 10 min cada uno utilizando un conjunto de tinción de diapositivas1.
- Lavar el bastidor de los portaobjetos durante 2 minutos con agua desionizada por inmersión en una caja de plástico, seguido de fijación por inmersión en una caja de plástico rellena de formalina tamponada neutra durante 30 min13. Lavar los portaobjetos en agua desionizada durante 2 minutos y luego proceder a la recuperación de antígenos.
- Recuperación de antígenos
- Coloque el bastidor de los portaobjetos en una caja resistente al calor llena a la línea interna (aproximadamente 300 ml) con tampón de recuperación de antígeno pH 6 o pH 9.
NOTA: El tampón de recuperación de antígenos puede ser pH 6 o pH 9, que puede necesitar ser optimizado por epítopo. Sin embargo, comience por usar pH 9 para anticuerpos que se unen a epítopos nucleares y pH 6 para todos los demás anticuerpos. - Cubra la caja con una envoltura de plástico y use una banda de goma para asegurarla. Coloque la caja en el microondas en el borde de la placa giratoria (microondas debe estar equipado con tecnología de inversor para calefacción uniforme). Calentar los portaobjetos durante 45 s al 100% de potencia seguido de 15 min a 20% de potencia13.
NOTA: El tratamiento de microondas puede necesitar optimización dependiendo del microondas utilizado. - Deje que las diapositivas se enfríen durante aproximadamente 15 x 20 minutos.
- Coloque el bastidor de los portaobjetos en una caja resistente al calor llena a la línea interna (aproximadamente 300 ml) con tampón de recuperación de antígeno pH 6 o pH 9.
- Prepare soluciones de trabajo de anticuerpos y fluoróforos mientras se enfrían los portaobjetos.
- Preparar el diluyente de anticuerpos primarios disolviendo 0,5 g de gránulos de albúmina sérica bovina en 50 ml de TBST. Alternativamente, utilice 50 ml de 1x solución salina tamponada de fosfato (PBS) para disolver gránulos.
- Realizar cada solución de trabajo de anticuerpos primarios a la concentración optimizada determinada en la sección 1, en el diluyente de anticuerpos primarios. Estimar aproximadamente 200 l por diapositiva.
- Preparar la solución de trabajo de fluoróforo diluyendo cada fluoróforo en el diluyente de fluoróforo a una concentración de 1:100.
NOTA: Esto puede necesitar ser optimizado dependiendo del anticuerpo. Estimar aproximadamente 100 l por diapositiva. - En el último día de tinción, prepare la solución de trabajo de 4o,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) añadiendo 3 gotas de DAPI en 1 ml de TBST.
- Tinción de diapositivas (lavado y bloqueo)
- Retire la caja del microondas después de enfriar y quite la envoltura de plástico, lave los portaobjetos con agua desionizada durante 2 minutos seguido de un lavado de 2 minutos en una caja de plástico llena de plástico TBST13.
- Después de secar cada diapositiva alrededor del tejido con una delicada tarea limpiar con cuidado de no dejar que el tejido se seque, rastrear alrededor del exterior del tejido usando una pluma de barrera hidrófoba. No toque el tejido con la delicada toallita o pluma de la tarea.
- Coloque cada diapositiva en la cámara humidificada y agregue la solución de bloqueo (aproximadamente 4 gotas) al tejido. Incubar durante 10 min a temperatura ambiente (RT).
- Tinción por diapositivas (aplicación de anticuerpos primarios)
- Tome cada diapositiva y retire la solución de bloqueo tocando el lado de la diapositiva en una pila de toallas de papel y usando una toallita de tarea delicada para eliminar el exceso de agente de bloqueo alrededor del tejido.
- Vuelva a poner el portaobjetos en la cámara humidificada y añada aproximadamente 200 ml del anticuerpo primario de trabajo. Incubar en la cámara humidificada durante 1 h a RT.
- Lavar con TBST durante 2 min por inmersión en triplicado13.
NOTA: Después de cada paso de lavado, cambiar el TBST ayudará a garantizar una imagen más limpia.
- Tinción por deslizamiento (aplicación secundaria de anticuerpos)
- Elimina el TBST restante de cada diapositiva y aplica aproximadamente de 3 a 4 gotas de anticuerpo secundario (mezcla de anticuerpos conjugados secundarios de HRP de conejo y ratón). Incubar durante 10 min en la cámara humidificada aRT 13.
NOTA: Si planea utilizar un anticuerpo primario que requiera un anticuerpo secundario que no sea ratón o conejo o elija utilizar un anticuerpo secundario alternativo, aplique el HRP conjugado secundario adecuado a las diapositivas e incubar en RT durante 45 minutos. tiempo de incubación puede ser necesario para la secundaria alternativa14. - Después de la incubación, lavar con TBST durante 2 min en triplicado13.
- Elimina el TBST restante de cada diapositiva y aplica aproximadamente de 3 a 4 gotas de anticuerpo secundario (mezcla de anticuerpos conjugados secundarios de HRP de conejo y ratón). Incubar durante 10 min en la cámara humidificada aRT 13.
- Tinción por diapositivas (aplicación de fluoróforo)
- Aplicar aproximadamente 100 l de la solución de trabajo del fluoróforo e incubar en la cámara humidificada a RT durante 10 min13.
- Lavar con TBST durante 2 min en triplicado13.
- Eliminación de anticuerpos
- Toboganes de microondas (45 s al 100% y 15 min a 20%) en la caja resistente al calor (ver paso 2.3.2) para la eliminación de anticuerpos13,14.
NOTA: Esto completa una ronda del multiplex. Este es el único punto en el que se puede pausar el protocolo. Para pausar el protocolo, deje las diapositivas sumergidas en el búfer de recuperación de antígenos durante la noche a temperatura ambiente.
- Toboganes de microondas (45 s al 100% y 15 min a 20%) en la caja resistente al calor (ver paso 2.3.2) para la eliminación de anticuerpos13,14.
- Continúe rondas adicionales de tinción. Repita los pasos 2.5.1-2.9.1 para el resto de los pares de anticuerpos-fluoróforos. Una vez utilizados todos los anticuerpos y fluoróforos, proceda a la sección 2.11.
- Aplicación y montaje DAPI
- Después de la última ronda de tinción en el multiplex, retire la última aplicación de anticuerpos con solución de recuperación de antígenos pH 613. Lavar con agua desionizada seguido de TBST durante 2 min cada13.
- Aplicar aproximadamente 150 l de la solución DAPI en funcionamiento a los portaobjetos e incubar en la cámara humidificada durante 10 min a RT1.
- Lavar con TBST durante aproximadamente 30 s y montar los cubreobjetos con un soporte antidescolor. Aplique esmalte de uñas transparente en las cuatro esquinas del cubreobjetos una vez que el soporte de montaje se haya secado para asegurar el cubreobjetos (opcional).
3. Detalles de biblioteca, monoplexes y multiplex
- Elija diapositivas para crear una biblioteca de fluoróforos.
- Para un multiplex de 7 colores, recopile 7 diapositivas de tejido rico en células inmunitarias (es decir, amígdalas, bazo, etc.) para la biblioteca.
NOTA: Elija las diapositivas de control que se utilizarán para una biblioteca de fluoróforos con cada diapositiva que represente cada fluoróforo único que se utilizará en el multiplex. Las diapositivas de control deben tener un epítopo abundante de elección y pueden ser el mismo tipo de tejido para cada fluoróforo.
- Para un multiplex de 7 colores, recopile 7 diapositivas de tejido rico en células inmunitarias (es decir, amígdalas, bazo, etc.) para la biblioteca.
- Diapositivas de la biblioteca de imágenes y manchas para su uso con monoplexes y multiplexores.
- Siga los pasos 2.1 a 2.9.1 utilizando las diapositivas de control y las diapositivas de tejido de control de su elección. Coloque un fluoróforo diferente en cada diapositiva a una concentración de 1:100; una diapositiva debe contener sólo DAPI.
- Continúe con la sección 2.11 excepto omitir la tinción DAPI y, en su lugar, utilice TBST y monte como se describe.
- Después de dejar que las diapositivas se sequen durante la noche, la imagen con todos los canales DAPI, CY3, CY5, CY7, Texas Red, puntos cuánticos semiconductores y isotiocianato de fluoresceína (FITC) estableciendo la exposición a 250 ms con la función de protección de saturación1.
NOTA: Los tiempos de exposición se pueden ajustar a 50 a 250 ms13. - Cargue las imágenes de la biblioteca en el software y utilíquelas en el análisis de los monoplexes y multiplex.
- Elija diapositivas para monoplexes.
- Elija diapositivas de control que tengan un abundante epítopo de elección basado en anticuerpos optimizados (sección 1). Para cada ronda de tinción que se realice en el multiplex, seleccione ese número de diapositivas de control para crear monoplexes.
NOTA: El propósito del monoplex es determinar la mejor posición (orden) para cada anticuerpo que se utilizará en el multiplex.
- Elija diapositivas de control que tengan un abundante epítopo de elección basado en anticuerpos optimizados (sección 1). Para cada ronda de tinción que se realice en el multiplex, seleccione ese número de diapositivas de control para crear monoplexes.
- Monoplexes de manchas.
- Siga las secciones 2.1-2.11 utilizando el anticuerpo primario en un orden diferente (posición) para cada una de las diapositivas. Cada diapositiva debe tener un solo anticuerpo primario aplicado en un orden (posición) diferente de las otras diapositivas.
NOTA: Para cada diapositiva en la que la ronda no solicite ningún anticuerpo primario o fluoróforo, utilice en su lugar diluyente de anticuerpos primarios y diluyente de fluoróforo13.
- Siga las secciones 2.1-2.11 utilizando el anticuerpo primario en un orden diferente (posición) para cada una de las diapositivas. Cada diapositiva debe tener un solo anticuerpo primario aplicado en un orden (posición) diferente de las otras diapositivas.
- Diapositivas de imagen y analizar el monoplex.
- Usando el microscopio y ajustando el tiempo de exposición a 250 ms para todos los canales capturacadacada cada imagen utilizando DAPI para enfocar.
NOTA: Los tiempos de exposición se pueden ajustar a 50 a 250 ms14. - Usando el software de análisis evaluar cada diapositiva monoplex mirando la intensidad fluorescente del marcador manchado.
- Compare esta intensidad con el fondo. Si es al menos 5 a 10 veces mayor que el fondo, la posición de esa diapositiva es una posición óptima para usar en el multiplex final.
- Usando el microscopio y ajustando el tiempo de exposición a 250 ms para todos los canales capturacadacada cada imagen utilizando DAPI para enfocar.
- Elija diapositivas para el multiplex.
- Elija las diapositivas de interés y agregue una diapositiva adicional que se utilizará como diapositiva en blanco para la resta de autofluorescencia después de la tinción y la creación de imágenes.
- Mancha el multiplex.
- Sobre la base de los resultados monoplex, elija el orden apropiado (posiciones) para cada anticuerpo basado en el paso 3.5.3. Asigne cada fluoróforo a un anticuerpo.
NOTA: Esto puede necesitar optimización; sin embargo, el plan de utilizar anticuerpos brillantes para marcadores menos abundantes1, los anticuerpos colocalizadores deben combinarse con fluoróforos en espectros lejanos entresí 13,y los fluoróforos con el espectro 540 y 570 no deben ser colocalizados debido a a los problemas de superposición espectral1. - Continúe con las secciones 2.1 a 2.11 asegurando que la diapositiva en blanco no reciba anticuerpos primarios, fluoroforós o DAPI, en su lugar use diluyente de anticuerpos, diluyente de fluorofótesis y TBST respectivamente en su lugar.
- Sobre la base de los resultados monoplex, elija el orden apropiado (posiciones) para cada anticuerpo basado en el paso 3.5.3. Asigne cada fluoróforo a un anticuerpo.
- Multiplexdez de imagen y análisis de la integridad de la tinción
- Usando el microscopio y ajustando el tiempo de exposición a 250 ms para todos los canales, capture cada imagen utilizando DAPI para enfocar.
- Utilizando el software de análisis (Tablade materiales),evalúe cada multiplex por color falso fluorescente.
NOTA: Una imagen clara debe demostrar cada marcador claramente. Si un marcador se ve difuso y granulado o es inexistente, es probable que el marcador no funcionara y necesite volver a optimizarse. - Usando el software de análisis, evalúe cada multiplex por vista patológico. La vista patopatos confirmará la especificidad de cada marcador. Comparar con IHC previamente optimizado (sección 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
El proceso general de obtención de un ensayo multiplex de 7 colores sigue un patrón repetitivo. La Figura 1 describe el proceso en forma diagramamática. Una vez que los portaobjetos se cortan y secan o se reciben del laboratorio y se hornean en un horno de hibridación a 60 oC durante 1 h, luego proceder a la desfinación y rehidratación, fijar los portaobjetos en formalina de nuevo seguido de recuperación de antígeno. Cada ronda de multiplexación comienza en la recuperación del antígeno y termina en la eliminación de anticuerpos (Figura1).
La optimización de cada paso del proceso es primordial para lograr una imagen clara y útil. Los anticuerpos deben ser probados por IHC primero utilizando tampones de recuperación de antígenos con pH 6 y pH 9 para cada anticuerpo para visualizar qué tampón de recuperación de antígenos funciona mejor con ese anticuerpo en particular. Generalmente, los objetivos nucleares responden a la recuperación de antígenos con pH tampón 9. Por ejemplo, FOXP3 funciona mejor cuando se utiliza el búfer de recuperación de antígenos de pH 9 en comparación con CD3, que funciona mejor con el búfer de recuperación de antígenos de pH 6. Las imágenes tomadas del proceso IHC deben utilizarse para validar la especificidad del análisis multiplex.
Un monoplex es necesario para determinar el orden de cada anticuerpo en el multiplex. Cuando se utiliza un kit de 4 o 7 colores, cada anticuerpo tendrá un orden preferido en la matriz. Para el número de anticuerpos que se utilizarán, reúna las diapositivas de control adecuadas (es decir, para un multiplex de 7 colores donde un color es DAPI, seleccione 6 diapositivas de control representativaespecíficas específicas del tejido para los otros 6 fluoróforos). Figura 2 A-C es una representación esquemática de un ensayo monoplex utilizando 3 diapositivas con tejido de cáncer de colon FFPE. Cada diapositiva tiene FOXP3 en una posición diferente en la matriz utilizando el fluoróforo 570 como etiqueta. DAPI se utiliza como una mancha de contador para visualizar adecuadamente los núcleos. En la Figura3, se muestran imágenes representativas de un monoplex y un multiplex con una posición FOXP3 variable. En la Figura 3A,B donde FOXP3 se encuentra en la tercera posición (correspondiente al orden mostrado en la Figura 2C),la tinción específica y robusta de FOXP3 (rojo) se considera como lo demuestra la mancha nuclear brillante Figura 3A y la colocalización con CD3 Figura 3B. La intensidad de la señal de fluoróforo confirma la especificidad de FOXP3 sin manchas inespecíficas en otra parte del tejido Figura 3A. En la Figura 3C, donde FOXP3 se encuentra en la primera posición (correspondiente a la orden en la Figura 2A),hay una tinción no específica de FOXP3. Las áreas difusas granuladas de rojo cubren la mayor parte del deslizamiento y la intensidad fluorescente en estas áreas son inferiores a 1. Intentar hacer un multiplex sin completar un monoplex primero para probar el orden de la tinción resulta en un resultado similar y desperdiciará reactivos. Otro paso crítico que no se puede pasar por alto en el proceso multiplex es la tinción DAPI. Una contramancha DAPI en funcionamiento es la base para la identificación celular y el análisis espacial posterior utilizando el software de análisis. Un contraste importante se puede ver en la imagen compuesta con el DAPI del trabajo (azul) en la figura 3E y en el DAPI no trabajador en la figura 3F. La imagen en el cuadro 3F no pudo ser utilizada para identificar las células en el software de análisis. Un intento de rescatar el multiplex y el análisis de tejido, el cubreobjetos tal vez eliminado por remojo de la diapositiva en TBST seguido de un paso de microwaving en el búfer de recuperación de antígeno pH 6 con una aplicación adicional de DAPI.
Una vez completado el ensayo monoplex y confirmado el orden óptimo de los anticuerpos, se puede construir una estrategia multiplexación en la Figura4. Para cada objetivo se debe elegir un fluoróforo diferente. El número asociado con cada fluoróforo representa aproximadamente la longitud de onda fluorescente espectral emitida después de la excitación, similar a la citometría de flujo. Se debe tener cuidado al emparejar los anticuerpos propuestos con fluoróforos para limitar la superposición espectral y el posible sangrado de marcadores. Una buena estrategia es elegir longitudes de onda alejadas entre sí para co-localizar anticuerpos para reducir el exceso de superposición espectral proporcionando una imagen nítida y un fenotipado más confiable13. Por ejemplo, en la estrategia multiplex mostrada (Figura4), CD8 se empareja con el fluoróforo 570 mientras que CD3 está emparejado con el fluoróforo 520. Uno debe evitar el uso de fluoróforo 540 y 570 en objetivos colocalizados, ya que estos tienden a ser los más indiscriminados y pueden perjudicar los resultados. El fluoróforo 620 tiende a ser muy brillante y debe utilizarse para anticuerpos que no son abundantes en el tejido. Una biblioteca reciente utilizada como referencia para cada fluoróforo también ayuda a reducir la superposición espectral de fluoróforos. Una diapositiva en blanco que se somete a todas las rondas de recuperación de antígenos es necesaria para garantizar la extracción de autofluorescencia de la imagen compuesta. Esta diapositiva en blanco se someterá al mismo tratamiento que las diapositivas multiplex excepto en lugar de un anticuerpo primario de trabajo y un fluoróforo, el diluyente de anticuerpos y el diluyente de fluoróforo se utilizarán respectivamente la Figura 4B.
Para asegurarse de que el diseño multiplex funcionó correctamente y los marcadores vistos en la imagen compuesta son específicos, utilice la "imagen patológico" en combinación con la opción de ajuste "brightfield" utilizando un software de microscopio que crea una imagen IHC falsa que luego puede ser en comparación con los ensayos anteriores del IHC discutidos en la sección 1. Desafortunadamente, hermosas imágenes compuestas pueden no reflejar necesariamente una mancha precisa y este es un paso importante para controlar la calidad del proceso y evitar resultados falsos positivos. La Figura 5A muestra una imagen compuesta sin preocupación inicial. CD3 se visualiza y muestra tinción específica (verde) y se confirma por la imagen de campo brillante patológico en la Figura 5B. CD163 (naranja) se ve en la imagen compuesta (Figura5A); sin embargo, al evaluar la vista patológico de campo brillante de CD163 (Figura5C),el anticuerpo es inespecífico. Un ejemplo de una imagen multiplex óptima con tinción específica se muestra en una imagen compuesta (Figura5D). La especificidad CD3 y CD163 se confirma utilizando la vista de campo brillante patológico (Figura5E y Figura 5F, respectivamente) y se compara favorablemente con los ensayos anteriores de IHC realizados con estos anticuerpos (no se muestra).
Figura 1: Diagrama de flujo de trabajo de tinción.
Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Desarrollo monoplex.
(A) Deslizamiento del cáncer de colon con FOXP3 en la posición 1. (B) Deslizamiento del cáncer de colon con FOXP3 en la posición 2. (C) Deslizamiento del cáncer de colon con FOXP3 en la posición 3. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Los éxitos y escollos de monoplex y multiplex.
(A) Ensayo monoplex del cáncer de colon primario con FOXP3 en la posición 3, se muestra la etiqueta de intensidad fluorescente. (B) Ensayo múltiple del cáncer de colon primario con FOXP3 en la posición 3 y CD3 en la posición 2. (C) Ensayo monoplex de cáncer de colon primario con FOXP3 en la posición 1, se muestra la etiqueta de intensidad fluorescente. (D) Ensayo múltiple del cáncer de colon primario con FOXP3 en la posición 1 y CD3 en la posición 2. (E) Ensayo múltiple del cáncer de colon primario con orden de anticuerpos de la siguiente manera: CD8 (amarillo), CD3 (verde), CD163 (naranja), pancytoqueatin (blanco), PD-L1 (magenta), FOXP3 (rojo), DAPI de trabajo (azul). (F) Ensayo múltiple del cáncer de colon primario con orden de anticuerpos de la siguiente manera: CD8 (amarillo), CD3 (verde), CD163 (naranja), pancytoqueatin (blanco), PD-L1 (magenta), FOXP3 (rojo), DAPI no laborable (azul). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Desarrollo múltiple.
(A) Diapositiva múltiple del cáncer de colon en un multiplexdeo de 7 colores. (B) Diapositiva en blanco en un multiplex de 7 colores usando tejido de cáncer de colon. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Análisis de la especificidad de un multiplex de 7 colores.
(A) Imagen compuesta múltiple con anticuerpos de la siguiente manera: CD8 (amarillo), CD3 (verde), CD163 (naranja), pancytoqueatin (blanco), Ki67 (rojo), DAPI (azul). (B) Vista de campo brillante patológico de la imagen en el panel A en la vista de CD3 solamente. (C) Vista de campo brillante patológico de la imagen en el panel A en la vista CD163 solamente. (D) Imagen compuesta múltiple con anticuerpos de la siguiente manera: CD8 (amarillo), CD3 (verde), CD163 (naranja), pancytoqueatin (blanco), PD-L1 (magenta), FOXP3 (rojo), DAPI (azul). (E) Vista de campo brillante patológico de la imagen en el panel D en la vista de CD3 solamente. (F) Vista de campo brillante patológico de la imagen en el panel D en la vista CD163 solamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Las muestras de tejido intactas de la biopsia de tumores sólidos y la resección quirúrgica siguen siendo importantes herramientas diagnósticas y predictivas para el análisis de la enfermedad, así como el pronóstico del paciente. La inmunohistoquímica fluorescente multiplex (mfIHC) es una técnica novedosa que combina los beneficios de la inmunohistoquímica (IHC), la inmunofluorescencia (IF) y la citometría de flujo. Los métodos anteriores para sondear las células in situ hanpermitido la evaluación de los arreglos de célula a célula en un entorno tisular 8, sin embargo, el bajo número de epítopos que se pueden sondear limita el análisis complejo. La citometría de flujo, aunque útil en el análisis de muchos tipos de células en una muestra, pierde el contexto espacial en virtud de la preparación de muestras como una suspensión de una sola célula9,10. mfIHC une estas técnicas conservando el contexto espacial del microambiente celular y aumentando el número de epítopos que se pueden etiquetar mientras se amplifica la señal por epítopo etiquetado11. Investigaciones anteriores han utilizado mfIHC para fenotipar el infiltrado celular en muestras de cáncer y tejido no canceroso1,2,3,4,5,15. El análisis posterior a la imagen también se ha utilizado para analizar las relaciones espaciales de las células y estructuras dentro del microambiente tisular1,2,4. Para un análisis fiable, primero se debe producir una imagen específica y precisa. La técnica de tinción manual, a diferencia de un sistema automatizado de tinción, permite a los laboratorios más pequeños y conscientes de los costos el acceso a esta tecnología. El tiempo de optimización y el tiempo de tinción se encuentran entre las mayores barreras para lograr una imagen fiable para un análisis espacial posterior.
Varias reglas generales mejoran la probabilidad de generación exitosa de una imagen multiplex compuesta confiable y ahorrarán tiempo y recursos. Los anticuerpos que se utilizarán en el multiplex deben elegirse en función del éxito con iHC convencional manual. Los búferes de recuperación de antígenos con pH 6 y pH 9 deben utilizarse para IHC para investigar la recuperación de antígeno apropiada para su uso en el multiplex. El desarrollo monoplex es necesario para identificar la colocación de anticuerpos dentro del protocolo de multiplexación. La razón de ser de esto es complicada y varía entre los especímenes de tejido y los epítopos. En algunos casos, el epítopo puede degradarse con varios pasos de microwaving y se pierde la visualización del marcador, como suele ocurrir con CD3. FOXP3, sin embargo, se vuelve más brillante con más pasos de microwaving y es apenas visible si se coloca en la primera o segunda ronda de multiplex13,14.
El proceso de tinción comienza con el corte de tejido FFPE en diapositivas cargadas. El primer problema que se puede encontrar es el tejido que se cae de la diapositiva después del microwaving. Cuando no se utilizan diapositivas cargadas, la adherencia del tejido a la superficie de vidrio es limitada y el tejido tendrá un plegado excesivo o puede deslizarse por completo. Para asegurarse aún más de que el tejido se adhiere a los portaobjetos durante el proceso de tinción, se realizan varias técnicas. Primero mientras cortalos bloques en los portaobjetos, la forma más pura de agua funciona mejor. Para algunos laboratorios, el agua desionizada puede ser suficiente, pero el agua destilada ha funcionado mejor. Las toboganes deben secarse planas inmediatamente después de cortara a 37 oC durante la noche. Para asegurar aún más la adherencia, los portaobjetos se colocan en un horno de hibridación y se hornean a una temperatura plana a 60 oC durante una hora justo antes de su uso. Aunque la fijación de formalina ya se ha producido durante el proceso inicial de preparación del tejido, la colocación de las diapositivas en formalina tamponada neutra durante 30 minutos después del proceso de desfinación y rehidratación mejora la integridad estructural del tejido1,13.
El proceso de tinción manual puede tardar hasta tres, 8 horas días dependiendo del número de anticuerpos utilizados. Evitar los escollos es esencial para ahorrar tiempo y ahorrar reactivos. El primer error común a menudo ocurre en la preparación de reactivos. El agua difiere entre los laboratorios y puede ser la única diferencia en los resultados de un laboratorio a otro. El uso de la misma fuente de agua limpia para todas las reacciones y reactivos garantiza un resultado consistente. Los anticuerpos, la solución de bloqueo y los fluoróforos funcionan mejor a temperatura ambiente. Para evitar escollos en la preparación del reactivo y de la solución de trabajo, utilice el mismo agua para todos los reactivos. Utilice también todas las soluciones de trabajo y reactivos a temperatura ambiente.
La solución de problemas de mfIHC es importante y la adhesión a estrictas directrices de laboratorio cruciales para limitar la contaminación de los componentes y/o el error del operador. La producción de imágenes subóptimas sesgará los resultados y dará lugar a poblaciones de células falsas positivas y negativas que pueden afectar negativamente a los datos. Dado que el análisis final normalmente incluye fenotipos generados por ordenador basados en el aprendizaje automático, se pueden ampliar pequeños errores en la tinción para afectar a todo el conjunto de datos. Por ejemplo, aunque todas las manchas pueden funcionar perfectamente, un error u omisión de DAPI impedirá la segmentación y el recuento de celdas futuras haciendo que el experimento sea inútil. El software de análisis utiliza la tinción DAPI no sólo para identificar celdas sino que asigna coordenadas x e y a cada celda y si el multiplex ox tiene una tinción DAPI tenue, mal circunscrita o difusa, la imagen no se puede utilizar más y el multiplex se debe rehacer o intentar rescate y re-manchación de DAPI. El uso de componentes de software como la patología y las vistas de campo brillante mejorará la confianza en la sensibilidad y la especificidad al principio del proceso de optimización y evitará errores al principio del proceso de multiplex.
Los aspectos modificadores del proceso de creación de imágenes también pueden ayudar en la optimización de imágenes. Por ejemplo, tomar una imagen con DAPI como ayuda visual para enfocar ayuda a evitar imágenes borrosas. La adición de la nueva biblioteca de fluoróforos al software garantizará una imagen limpia y menos superposición espectral de cada fluoróforo durante la fase de análisis y el uso de la diapositiva en blanco para extraer la autofluorescencia intensifica los marcadores y mejora la imagen Calidad.
El uso de muestras de tejido tiene y seguirá siendo como una herramienta esencial en la investigación de la fisiopatología de la enfermedad. La tecnología emergente ha aumentado nuestra comprensión de las interacciones de célula a célula y mfIHC es un nuevo actor prometedor. La optimización y precisión durante el proceso de tinción en esta técnica es primordial para una utilización adecuada y un análisis más profundo de las interacciones de célula a célula.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores quieren agradecer a Ed Stack, anteriormente de Perkin Elmer, por su ayuda con la configuración y optimización de la tinción multiplex original. Los autores también quieren agradecer a Kristen Schmidt de Akoya Biosciences por consejos de uso del software de análisis. La investigación reportada en esta publicación fue apoyada por los Institutos Nacionales de Salud del Cáncer bajo el Premio Número P30CA046592, K08CA201581(tlf), K08CA234222 (js), R01CA15158807 (mpm), RSG1417301CSM (mpm), R01CA19807403 (mpm), U01CA22414501 (mpm, hc), CA170568 (hc). El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente los puntos de vista oficiales de los Institutos Nacionales de Salud. El apoyo adicional fue proporcionado por Jeffery A. Colby Colon Cancer y Tom Liu Memorial Research Funds.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100% ethanol | Fisher | HC8001GAL | |
| 70% ethanol | Fisher | HC10001GL | |
| 95% ethanol | Fisher | HC11001GL | |
| Analysis software | Akoya Biosciences | CLS135783 | inForm version 2.3.0 |
| Antifade mountant | ThermoFisher | P36961 | ProLong Diamond |
| Blocking solution | Vector | SP-6000 | Bloxall |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Life Sciences | A9647-100G | |
| Cover Slips | Fisher | 12-548-5E | |
| Delicate task wipe | Kimberly-Clark | 34120 | |
| Fluorescent diluent | Akoya Biosciences | ARD1A01EA | Opal TSA diluent |
| Fluorophore 520 | Akoya Biosciences | FP1487001KT | 1:100 |
| Fluorophore 540 | Akoya Biosciences | FP1494001KT | 1:100 |
| Fluorophore 570 | Akoya Biosciences | FP1488001KT | 1:100 |
| Fluorophore 620 | Akoya Biosciences | FP1495001KT | 1:100 |
| Fluorophore 650 | Akoya Biosciences | FP1496001KT | 1:100 |
| Fluorophore 690 | Akoya Biosciences | FP1497001KT | 1:100 |
| Fluorophore DAPI | Akoya Biosciences | FP1490 | 3 drops in TBST or PBS |
| Heat resistant box | Tissue-Tek | 25608-904 | Plastic slide box-green |
| Humidified Chamber | Ibi Scientific | AT-12 | |
| Hybridization oven | FisherBiotech | ||
| Hydrophobic barrier pen | Vector | H-4000 | ImmEdge |
| Microscope | Perkin Elmer | CLS140089 | Mantra quantitative pathology workstation |
| Microwave | Panasonic | NN-A661S | with inverter technology |
| Neutral buffered formalin | Fisher Scientific | SF100-4 | 10% neutral buffered formalin |
| pH 6 antigen retrieval buffer | Akoya Biosciences | AR600 | AR6 |
| pH 9 antigen retrieval buffer | Akoya Biosciences | AR900 | AR9 |
| Phosphate buffered saline | Fisher | BP3994 | PBS |
| Plastic slide box | Tissue-Tek | 25608-906 | |
| Plastic wrap | Fisher | NC9070936 | |
| Polysorbate 20 | Fisher | BP337-800 | Tween 20 |
| Primary antibody CD163 | Lecia | NCL-LCD163 | 1:400 |
| Primary antibody CD3 | Dako | A0452 | 1:400 |
| Primary antibody CD8 | Spring Bio | M5390 | 1:400 |
| Primary antibody FOXP3 | Dako | M3515 | 1:400 |
| Primary antibody pancytokeratin | Cell Signaling | 12653 | 1:500 |
| Primary antibody PD-L1 | Cell Signaling | 13684 | 1:200 |
| Secondary antibody | Akoya Biosciences | ARH1001EA | Opal polymer |
| Slide stain set | Electron Microscopy Sciences | 6254001 | |
| Tris buffered saline | Corning | 46-012-CM | TBS |
| Vertical slide rack | Electron Microscopy Sciences | 50-294-72 | |
| Xylene | Fisher | X3P1GAL |
References
- Lazarus, J., et al. Spatial and phenotypic immune profiling of metastatic colon cancer. JCI Insight. 3 (22), (2018).
- Barua, S., et al. A Functional Spatial Analysis Platform for Discovery of Immunological Interactions Predictive of Low-Grade to High-Grade Transition of Pancreatic Intraductal Papillary Mucinous Neoplasms. Cancer Informatics. 17, 1176935118782880 (2018).
- Yang, L., Liu, Z., Tan, J., Dong, H., Zhang, X. Multispectral imaging reveals hyper active TGF-beta signaling in colorectal cancer. Cancer Biology & Therapy. 19 (2), 105-112 (2018).
- Carstens, J. L., et al. Spatial computation of intratumoral T cells correlates with survival of patients with pancreatic cancer. Nature Communications. 8, 15095 (2017).
- Steele, K. E., Brown, C. Multiplex Immunohistochemistry for Image Analysis of Tertiary Lymphoid Structures in Cancer. Methods In Molecular Biology. 1845, 87-98 (2018).
- Gorris, M. A. J., et al. Eight-Color Multiplex Immunohistochemistry for Simultaneous Detection of Multiple Immune Checkpoint Molecules within the Tumor Microenvironment. The Journal Of Immunology. 200 (1), 347-354 (2018).
- Parra, E. R., et al. Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues. Scientific Reports. 7, (2017).
- Katikireddy, K. R., O'Sullivan, F. Immunohistochemical and immunofluorescence procedures for protein analysis. Methods In Molecular Biology. 784, 155-167 (2011).
- Adan, A., Alizada, G., Kiraz, Y., Baran, Y., Nalbant, A. Flow cytometry: basic principles and applications. Critical Reviews In Biotechnology. 37 (2), 163-176 (2017).
- Zaritskaya, L., Shurin, M. R., Sayers, T. J., Malyguine, A. M. New flow cytometric assays for monitoring cell-mediated cytotoxicity. Expert Review of Vaccines. 9 (6), 601-616 (2010).
- Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70 (1), 46-58 (2014).
- Zhang, W., et al. Fully automated 5-plex fluorescent immunohistochemistry with tyramide signal amplification and same species antibodies. Laboratory Investigation. 97 (7), 873-885 (2017).
- Phenoptics Research Solutions. Perkin Elmer Manual. , 32 (2016).
- Opal Multiplex IHC Assay Development Guide. , Perkin Elmer Manual. (2014).
- Carey, C. D., et al. Topological analysis reveals a PD-L1-associated microenvironmental niche for Reed-Sternberg cells in Hodgkin lymphoma. Blood. 130 (22), 2420-2430 (2017).
