Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Murine Appendektomi modell av kronisk kolitt assosiert tykktarmskreft ved presis lokalisering av Caecal patch

Published: August 24, 2019 doi: 10.3791/59921
Automatic Translation
1, 2,3, 1, 2,3, 1, 4, 1,5, 1,6, 1,2, 1
1Department of General Surgery, The First Affiliated Hospital, Xi'an Jiaotong University, 2Institute of Medical Research, Northwestern Polytechnical University, 3School of Life Sciences, Northwestern Polytechnical University, 4Department of Medicine, Xi'an Jiaotong University, 5Princess Margaret Cancer Center, University of Health Network, 6Department of Pathology, Nanjing Medical University

Summary

Den presenterte protokollen beskriver en facile kirurgisk fjerning av vedlegget (caecal patch) i en mus etterfulgt av induksjon av inflammatorisk tarmsykdom-assosiert tykktarmskreft. Denne murine appendektomi modellen muliggjør gransking av den biologiske rollen til tillegget i patogenesen av menneskelig gastrointestinal sykdom.

Abstract

Den menneskelige vedlegget har nylig blitt involvert for å spille viktige biologiske roller i patogenesen av ulike komplekse sykdommer, slik som tykktarmskreft, inflammatorisk tarmsykdom, og Parkinsons sykdom. For å studere funksjonen til tillegget, en gut sykdom-assosiert murine appendektomi modellen er etablert og trinn-for-trinn-protokollen er beskrevet her. Denne rapporten introduserer en facile protokoll for fjerning av caecal i mus etterfulgt av kjemisk induksjon av kronisk kolitt-assosiert tykktarmskreft ved hjelp av en kombinasjon av dextran sulfat natrium (DSS) og azoxymethane (AOM). IgA spesifikke celler og IgA konsentrasjon ble betydelig redusert ved fjerning av caecal patch i mannlige C57BL/6 mus i forhold til de i humbug gruppen. Samtidig administrere 2% DSS og AOM resulterte i nesten 80% mus overlevelse i både humbug og appendektomi grupper uten betydelig kroppsvekt tap. Histologiske resultater bekreftet colonic inflammasjon og ulike grader av adenokarsinom. Denne modellen kan brukes til studiet av den funksjonelle rollen til tillegget i å opprettholde gut bakterieflora homeostase og patogenesen av tarm kolitt og ondartet, så vel som for den potensielle utviklingen av narkotika målretting terapier.

Introduction

Klinisk appendektomi er en standard kirurgisk prosedyre som involverer fjerning av vedlegget hovedsakelig på grunn av betennelse (f. eks, blindtarmbetennelse)1,2,3. Imidlertid forblir biologisk funksjon av vermiform menneskelige vedlegg kontroversielle4,5,6. Tillegget er ansett som en vestigial rest som projiserer fra cecum i tykktarmen. Inntil nylig har evolusjonære, immunologiske, morfologiske og mikrobiologisk studier antydet at vedlegget kan ha forskjellige funksjoner. Disse rollene inkluderer produksjon av immunoglobins (f. eks, IgA og IgG), en rekke B-celler og T-celler kritisk for adaptive immunresponser i tarmen-assosiert lymfoide vev (GALTs), og påfyll av den store tarmen med Commensal microbiotas 6 andre priser , 7 andre er , 8 på alle , 9 andre priser , 10 andre , 11 flere , Det er 12.

Kliniske Epidemiologiske studier av pasienter med tidligere appendektomi eller akutte blindtarmbetennelse har også avdekket sine potensielle roller i patogenesen av menneskelige sykdommer, slik som inflammatorisk tarmsykdom (IBD), tykktarmskreft, og ikke-Gastrointestinal lidelser (f.eks. Parkinsons sykdom og kardiovaskulær sykdom)13,14,15,16,17,18. For eksempel viste en stor kohortstudie med asiatiske populasjoner med 75 979 appendektomi pasienter nylig en signifikant forbindelse mellom appendektomi og påfølgende utvikling av tykktarmskreft, en av de vanligste ondartede med høy forekomst og dødelighet14,19. Følgelig etablere en passende dyr appendektomi modell som ligner et menneske vil være nyttig å undersøke de biologiske funksjoner og molekylære mekanismer av vedlegget i sykdommen patogenesen.

Mange pattedyr har et vedlegg eller vedlegg-lignende organ, inkludert primater, lagomorphs (f. eks kaniner), noen gnagere, og marsupials20. For liten og vanligvis anvendt laboratorium dyrene, kaninen besitte det vermiform vedlegg morfologisk ligner mennesket21,22, bortsett fra galt inne kaninen er ytterst stor sammenlignet med det inne human, siden flertallet av lymfoide vev er også funnet i Peyer ' s patcher som ligger i både små og store tarmen21. Dessuten, kaninen viser en annerledes lymfoide follikulær struktur, T cellen distribusjon, og immunglobulin tettheten fra mennesket, hvilke lager det studere av deres vedlegg upassende21.

Mus er den mest brukte dyr modellen for å studere menneskelig patofysiologi og teste de ulike eksisterende og romanen therapuetics23,24,25. Den enkle hvite store lymfoide klyngen på toppen av blindtarmen i mus, kjent som caecal patch, antas å utføre funksjoner som ligner på den menneskelige vedlegg26,27,28. Likevel er det praktisk talt vanskelig å skille caecal patch fra blindtarmen i mus. Så langt, den vanlige kirurgiske prosedyrer for inducing blindtarmbetennelse i en mus modell innebære et relativt stort snitt (f. eks 1-2 cm) gjennom bukveggen for å få tilgang til hele blindtarmen (supplerende tabell 1)29, 30,31,32,33,34,35,36.

Heri, for å generere en appendektomi modell forbundet med gastrointestinal sykdom, presenterer denne rapporten en facile kirurgisk protokoll for caecal patch fjerning i mus. Dette etterfølges av den kombinerte administrasjonen av gentoksisk agent AOM og Pro-inflammatorisk agent DSS for induksjon av kolitt-assosiert tykktarmskreft lik den som er sett hos mennesker. IBD har vist å være en risikofaktor for tarmkreft37,38. Kombinasjonen av aom/DSS-indusert kronisk kolitt-assosiert tykktarmskreft har vært godt etablert, og leserne kan henvise til Neufert et al., og Thaker et al. for detaljerte prosedyrer39,40. Dette reproduserbar og rask murine appendektomi modellen kan brukes til å studere vedlegg-modulert tarmbetennelse og kolon bakterieflora, spesielt i utvikling og progresjon av IBD og tykktarmskreft.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyr prosedyrer ble godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk komité XI ' an Jiaotong University (nr. XJTULAC2019-1023).

1. mus appendektomi

  1. House 8-10-ukers-gamle C57BL/6 mannlige mus i en sertifisert spesifikk-patogen gratis (SPF) miljø for 1 uke før kirurgi.
  2. Klargjør følgende sterile Kirurgiske instrumenter: ett par av mikro-saks, ett par mikro-tang, to størrelser (4-0 og 8-0) av sterilisert ikke-absorberbare sting, en elektrisk blødnings penn med nål holder, 75% medisinsk alkohol, jod-basert skrubb ( f.eks. entoiodine), og en pakke med sterile bomullspinner.
  3. Fyll en 10 mL sprøyte med pre-varmet 0,9% fysiologisk saltvann for abdominal flush og hydrering under operasjonen.
  4. Bedøve en ikke-fastende mus intraperitonealt (IP) med 1% natrium pentobarbital i en dose på 100 mg/kg. Sjekk for dybden av anestesi ved mangelen på respons på pedal reflekser.
    Merk: en enkelt bedøvelse dose administreres for å sikre en full beroligende effekt i musen. Under forholdet mellom korte prosedyrer, 50 mg/kg natrium pentobarbital IP kan være tilstrekkelig.
  5. Forsiktig barbering av mage håret med en barbermaskin.
  6. Legg musen på varmeputen for å hindre nedkjøling.
  7. Fest musen på en plattform i en liggende posisjon ved å plassere fire strimler av medisinsk selvklebende tape over lemmer for å hindre postural bevegelse under operasjonen.
  8. Forsiktig berøre hele magen for å finne følelsen av en Bump.
    Merk: i de fleste tilfeller indikerer følelsen av et brak alltid den nøyaktige posisjonen til blindtarmen. For å unngå mulig skade på resten av tarmen, dette pre-lokalisering av blindtarmen før abdominal snitt er viktig.
  9. Dekk med en steril gardin og desinfisere barberte området av magen ved å bruke vekslende kirurgiske Scrubs av jod-basert løsning og 75% alkohol. Gjenta prosessen 2x.
  10. Lag en langsgående snitt fra 0,5 – 1,0 cm ved midtlinjen av buken.
  11. I henhold til den forhåndsbestemte plasseringen av blindtarmen, nå blindtarmen og forsiktig eksteriorisere (~ 1 cm) for å identifisere caecal patch. Bruk en steril, prewarmed saltløsning av fysiologisk pH for å hydrere tarmen.
    Merk: den caecal oppdateringen av en mus er en del av blindtarmen og karakterisert ved tilstedeværelsen av hvite ovale sekker på overflaten.
  12. For å forebygge mulige komplikasjoner av postoperativ blødning og infeksjon, ombinde de chrezbryzheechno blodkarene i blindtarmen ved hjelp av 8-0 Sutur. Fukt blindtarmen med sterilt saltvann.
  13. Merk reseksjon regionen ved hjelp av 4-0-Sutur med en åpen sløyfe nær toppen av blindtarmen ved proksimale tykktarmen.
    Merk: merking av blindtarmen med en åpen sløyfe forhindrer også lekkasje av caecal innhold fra snittet.
  14. Klipp av caecal plasteret under merket reseksjon ved hjelp av mikro-saks og tørk ut rest caecal innhold med medisinsk bomullspinner. Deretter desinfisere stump av blindtarmen med jod-basert skrubb.
  15. Lukk stump med den løpende Sutur ved hjelp av 8-0 Sutur.
  16. Fjern forsiktig 4-0 tråden loop tidligere brukt for å markere reseksjon på stump av blindtarmen.
  17. Sterilisere sutured posisjon med jod-basert skrubb. Rehydrate operasjonsstedet med saltvann igjen.
  18. Lukk muskulaturen laget med den løpende Sutur med 8-0 Sutur tråd.
  19. Lukk hudlagene ved hjelp av avbrutte sting med 4-0 Sutur tråd.
  20. Desinfisere kirurgisk kutt 2x med jod-basert skrubb, deretter fjerne jod med 75% medisinsk alkohol.
  21. Vend forsiktig musen tilbake, subkutant (SC) injisere 0,1 mg/kg kroppsvekt buprenorfin og 0,4 mL fysiologisk saltvann og la musen hvile på varmeputen til tilbake til bevissthet.
  22. Putte musa rygg å det steril bur og undersøke saken grundig dataskjerm for underskriver av smerte for 3 dager stolpe-kirurgi å sikre det å bli frisk.
    Merk: etter operativ anvendelse av 0,05 mg/kg buprenorfin kan være nødvendig for smertelindring av den enkelte mus. Tillat mus å utvinne i 7 dager etter operasjonen for videre induksjon av kolitt-assosiert tykktarmskreft.

2. induksjon av kronisk kolitt-assosiert tykktarmskreft med AOM og DSS

Merk: Utfør denne prosedyren 7 dager etter appendektomi.

  1. Forbered AOM-lagerløsning ved å oppløse 25 mg AOM i 2,5 mL 0,9% sterilt saltvann ved en konsentrasjon på 10 mg/mL.
    Merk: AOM er lysfølsom.
    1. Alikvot 2,5 mL forberedt AOM lagerløsning i 5 mL glass rør innpakket med aluminiumsfolie og oppbevares ved-20 ° c hver gang etter bruk.
    2. Tin en alikvot med AOM én gang og fortynne den til en konsentrasjon på 1 mg/mL med 0,9% sterilt saltvann (ratio 1:10).
      FORSIKTIG: AOM er ekstremt kreftfremkallende; dermed utføre hele Forberedelses prosedyren i en avtrekksvifte.
  2. Oppløsning 4 g DSS pulver i 200 mL autoklaveres vann for å forberede 2% (w/v) DSS løsning.
    Merk: konsentrasjonen av DSS kan variere avhengig av musen belastning, kjønn, og induksjon syklus; 3% DSS kan brukes til andre mus stammer.
  3. Administrer samtidig den nylagde AOM/DSS til musene. Hvis du vil gjøre dette, følger du fremgangsmåten nedenfor.
    1. Intraperitonealt injiserer 0,01 mL/g ferskt forberedt AOM arbeids løsning for hver mus og erstatte autoklaveres vann med 2% DSS løsning for 5 dager Ad lib.
      Merk: hvert bur inneholder fem mus; regelmessig sjekke DSS drikke flaske for å sikre at det ikke oppstår utfelling i løpet av behandlingsperioden.
    2. Vekt og nøye overvåke hver mus hver dag.
      Merk: under administrasjon, euthanize mus med opp til 20% vekttap sammenlignet med sin opprinnelige vekt eller tegn på klynge, Myse, nedkjøling, og dårlig aktivitet.
  4. Gi en fersk flaske autoklaveres vann på dagen 6 post-AOM/DSS administrasjon til dag 21 (figur 1B).
    Merk: Dette er en komplett syklus bestående av 21 dager.
  5. Gjenta trinn 2.3 – 2.4 for ytterligere to sykluser og ofre musene på dag 70.

3. vurdering av colonic inflammasjon og tumor (70 dager etter AOM-administrasjon)

  1. Ofre musene ved CO2 inhalasjon ved en fylle rate på 10% i døds aktiv kammeret etterfulgt av cervical forvridning.
  2. Høste hele kolon fra over ileoanal-kolikk krysset til anus.
  3. Utsett lumen side ved å åpne kolon lengderetningen. Skjær hele kolon i 10 cm lange biter og fikse kolon vevet i 10% formalin for 72 h for hematoksylin og eosin (H & E) farging.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Etablering av murine appendektomi modell

Denne murine appendektomi modellen av kronisk kolitt assosiert tykktarmskreft kan genereres ved å følge sekvensielle kirurgiske og induksjon trinn som illustrert i figur 1. De hyppigste posisjonene til blindtarmen er i venstre og høyre iliaca Fossa etterfulgt av midtlinjen i buken (figur 2). Den vellykkede rate av pre-lokalisering av blindtarmen før magen snitt ved hjelp av palpasjon metoden er nesten 70% (supplerende informasjon, tabell S2). Appendektomi prosedyrene består i hovedsak av seks viktige trinn (Figur 3). Under appendektomi kirurgi, en midtlinjen snitt så liten som 0,5-1,0 cm i lengde er avgjørende for å minimere kirurgiske traumer (Figur 3a). I tilfelle av intraperitoneal lekkasje, ligating Mesangial fartøy og lukking av stump av blindtarmen er nødvendig, ved hjelp av kjører sting i stedet for enkle ligation (Figur 3B, C, D, E).

Evaluering av IgA som en biomarkør i appendektomi mus

For å bekrefte appendektomi, var tykktarmen av mus og avføring innhold høstet post-kirurgi for å bestemme nivåene av IgA spesifikke plasma celler og sekretoriske IgA (sIgA) konsentrasjoner. Appendektomi musene viste en betydelig reduksjon i prosentandelen av B220-IgA + spesifikke plasma celler sammenlignet med humbug gruppen (Figur 4a, B). Videre, sammenlignet med sin egen opprinnelige tilstand før kirurgi, opprettholdt humbug mus den avføring sIgA konsentrasjon over 14 dager etter operasjonen, mens appendektomi gruppen viste en betydelig slgA reduksjon på dag 14 (Figur 4C).

Validering av kolitt-assosiert tykktarmskreft hos appendektomi mus

Sammenlignet med 3% DSS, der de fleste mus i appendektomi gruppen viste alvorlige komplikasjoner og signifikant kroppsvekt tap (figur 5A), ble 2% DSS i kombinasjon med aom gitt 80% av overlevelsesraten i både humbug og appendektomi grupper, med endringer i kroppsvekten (figur 5E). På slutten av tre sykluser av behandling, full-length store tarmen ble høstet for patologisk vurdering. Visuell inspeksjon og H & E farging viste colonic svulster med kolon betennelse og ulike grader av adenocarcinomas (vel, moderat-, og dårlig differensiert adenocarcinomas) hos mus behandlet med 2% AOM/DSS (figur 6).

Figure 1
Figur 1: skjematisk illustrasjon av å etablere murine appendektomi modell av kronisk kolitt-assosiert tykktarmskreft.
(A) et flytskjema av de viktigste kirurgiske trinnene (tre første er kritiske) av appendektomi prosedyre. (B) induksjon av tykktarmskreft. Syv dager etter appendektomi ble AOM og DSS administrert samtidig. Mus vekter ble registrert på ulike tidspunkter (rød trekant). I dag 70 etter operasjonen ble musene ofret, og tarm vevet ble høstet for ytterligere vurderinger. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: pre-fastsettelse av caecal patch plassering i mus før abdominal snitt.
(A) oppsummering av sannsynligheten for å finne blindtarmen posisjon. Anatomiske bilder av tre vanligste posisjonene til blindtarmen ved (B) lav høyre, (C) Middle, og (D) nedre venstre magen av musen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: kritiske skritt av murine appendektomi.
(A) lite snitt arrangert 0,5-1,0 cm; (B) å trekke ut den nøyaktige delen av caecal plasteret etter pre-position av blindtarmen. (C) ligation av chrezbryzheechno fartøy som følger med blindtarmen. (D) merking av skjæreområdet på blindtarmen med 4-0-Sutur. (E) lukke stump med å kjøre sting ved hjelp av 8-0 Sutur. (F) lukke muskuløse laget med avbrutte sting ved hjelp av 8-0 Sutur. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: kvantifisering av IgA spesifikke plasmaer celler og avføring sIgA konsentrasjon etter appendektomi.
(A) representative prikk tomter for celler beiset med anti-IgA og B220 i hele tykktarmen av humbug og appendektomi mus 1 dag og 14 dager etter operasjonen. Lymfocytter i lamina propria ble ferskt tilberedt og beiset med FITC anti-mus IgA, PE anti-mus CD45R/B220 for flyt flowcytometri. Tall innenfor tomter indikerer prosenter av celler i respektive områder; (B) kvantitativ bestemmelse av IgA spesifikke plasma celler i humbug og appendektomi grupper. Dataene representerer gjennomsnittlig ± SD; n = 5 – 8 mus; * p < 0,05, * * p < 0,01, og * * * p < 0,001. (C) avføring sIgA konsentrasjoner før og etter operasjonen. Avførings innholdet ble samlet på utpekte tidspunkter, og nivåer av sIgA ble testet av ELISA. Hver farge prikk representerer den samme musen over en periode på 14 dager. Statistisk analyse ble utført ved hjelp av en ikke-sammenkoblet t-test, med p < 0,05 betraktet som statistisk signifikant. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: dyre overlevelses status for kronisk kolitt-assosiert tykktarmskreft murine modell indusert av AOM/DSS kombinasjon etter appendektomi.
(A) overlevelse kurve innhentet ved hjelp av 3% DSS for kolitt induksjon i humbug og appendektomi grupper. Alvorlige komplikasjoner av anal prolaps (B) og veggmaleri abscess indikerte endepunktet av dyret (C). (D) overlevelse kurve innhentet ved hjelp av 2% DSS for kolitt induksjon i humbug og appendektomi grupper; (E) gjennomsnittlig kroppsvekt endring av mus over 70 dager. Dataene representerer gjennomsnittlig ± SD, n = 6 mus. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6: bilder av kronisk kolitt-assosierte tykk tarms svulster indusert ved Kombinasjonsbehandling av 2% DSS og 10 mg/kg AOM.
Fotografier av dissekert kolon med svulster under (A) visuell inspeksjon og (B) Animal drift mikroskop. H & E farging bilder av colonic vev viser (C) colonic betennelse, (D) godt differensiert adenokarsinom, (E) moderat differensiert adenokarsinom, og (F) svært differensiert adenokarsinom. Svart pil indikerer slimhinne sår, svart pilspissen indikerer adenokarsinom, hvit pil indikerer nøytrofile infiltrasjon mellom kjertler. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Supplerende tabell 1: litteratur oppsummering av kirurgiske metoder som brukes til blindtarmbetennelse induksjon i brukte mus stammer. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggs tabell 2: plassering av blindtarmen i mus etter laparotomy. Eksponert organ etter snitt indikerer orgelet funnet direkte på pre-plassert posisjon etter laparotomy. Plasseringen av blindtarmen viser blindtarmen plassering i forhold til abdominal region/blindtarmen posisjon i forhold til tarmen. Eksponert indikerer at blindtarmen var under muskel lag av magen og over andre deler av tarmen. Embedded indikerer at blindtarmen var dekket av tarmen. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

En murine appendektomi modell av kolitt-assosiert tykktarmskreft ble innhentet ved hjelp av kirurgiske trinn med en høy overlevelsesrate i mus. I de fleste tilfeller, siden blindtarmen ble plassert under bukveggen (supplerende tabell 1, supplerende tabell 2, og figur 2), var det vanskelig å prejudge sin beliggenhet uten laparotomy. I denne kirurgiske protokollen, et enkelt trinn for å berøre Bump ble innført, og kvantitativ evaluering av cecum plasseringen ble også gitt som veiledning for å øke presisjonen for pre-lokalisering av cecum (figur 2). Utnyttelse av anatomiske funksjoner for å fjerne caecal patch minimert forstyrrelse av utilsiktede deler av tarmen, og dermed redusere frekvensen av potensielle komplikasjoner av appendektomi og infeksjon i bukhulen.

Tre viktige trinn er involvert i denne modellen. For det første kan visuell undersøkelse og palpasjon før laparotomy være nyttig for å fastslå den generelle plasseringen av blindtarmen. Til tross for det faktum at blindtarmen er mest sannsynlig til stede på venstre iliaca regionen i buken, er caecal patch stikker ut fra toppen av blindtarmen ofte dissosiativ (dvs. flytte rundt eller innebygd) og er mer sannsynlig å finne under midten peritoneum ( Figur 2). For det andre, et lite snitt på midten linjen av magen og nøyaktig eksponering av caecal patch foretrekkes. Dette er fordi det er en tynn flekk på midten linjen av magen, der kutte i denne posisjonen kan redusere potensiell skade av abdominal muskulaturen laget. I tillegg, for å unngå Tarmslyng på appendektomi, som er skadelig for mus, nøyaktig eksponering av caecal patch minimerer utilsiktet forstyrrelse av tarmen, noe som reduserer risikoen for Tarmslyng forekomst. Videre kan minimal eksponering av bukhulen sikre at tarmen forblir uforurenset, varm og fuktig; ellers kan overdreven eksponering forårsake betydelig varmetap og tørking av vev41.

Tredje, desinfeksjon og lukking av caecal stump med kjører sting i stedet for enkle ligation er nødvendig for å hindre potensiell blødning og desinfeksjon av caecal innholdet i stump. Nivået av IgA-spesifikke plasma celler og avføring sIgA i stor tarm av mus er betydelig redusert med en appendektomi, noe som tyder på at caecal oppdateringen er det viktigste stedet for produksjon av IgA minst i den første perioden33. I den store tarmen, sIgA fungere som en slimhinne helse forsvarer ved å stabilisere den normale kolonisering av Commensal flora og motvirke patogene mikrober42. Fjerning av vedlegget reduserer produksjonen av IgA og kan forstyrre slimhinnene homeostase.

Den høye dødelighet og kliniske tegn på overdreven kolitt induksjon (dvs. alvorlig blodig avføring, Anal prolaps, og abdominal abscess43,44) ble observert hos mus behandlet med 3% DSS (figur 5). Men 2% DSS induksjon etter tre sykluser forårsaket ingen av disse komplikasjoner, og overlevelse ble opprettholdt over 80%. Dette indikerer at kombinert bruk av DSS og AOM skal valideres, ettersom mangelen på integriteten til GALTs kan, til en viss grad, redusere toleransen for mus til AOM og DSS-kombinasjonen. Observasjonsstudier fra klinisk baserte bevis tyder på at tillegget er sterkt assosiert med utviklingen av IBD og tykktarmskreft14,45,46. Imidlertid er de biologiske funksjonene og underliggende mekanismene i tillegget i patogenesen av kroniske tarm sykdommer fortsatt uklart. Det ser ut til at tillegget fungerer som en viktig del av GALTs og som et reservoar for gut Commensal flora å regulere helse eller syke stater17,18,31. Etablering av denne repeterbar og kostnadseffektiv murine appendektomi modellen kan brukes til å studere rollene til vedlegget i IBD og tykktarmskreft i sammenheng med bakterieflora homeostase, kreft forebygging, og immunterapi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet er delvis støttet av grunnleggende Research Funds for Central University (G2018KY0302), University grunnleggende Research Development Fund (KT00062), National Natural Science Foundation i Kina (81870380), og klinisk forskning Award av Første tilknyttede Hospital i XI ' an Jiaotong University i Kina (NO. XJTU1AF-CRF-2015-029). Forfatterne takker Dr. Chengxin Shi for hans tekniske forslag i den tidlige letefasen av murine appendektomi modellen, samt patologen Dr. XI Liu for evaluering av H & E flekker resultater av kolitt og tykk tarms svulster. Y.L. utførte kirurgi demonstrasjonen, gjorde dataanalyse, og skrev utkastet av manuskriptet; JL, G.L., Z.P. og Y.M. tok del i kirurgisk forberedelse, vevs samlinger og video produksjon; M.Z. utførte Flow flowcytometri og ELISA; Q.W. og H.X. sørget for teknisk støtte for å generere en klinisk relevant murine modell; R.X.Z. designet studien, veiledet forskningen og skrev og bevis manuskriptet; JS gjennomgått manuskriptet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Azoxymethane(AOM) Sigma-Aldrich,Inc. A5486
Dextran Sulfate Sodium Salt(DSS) MP Biomedicals,Inc. 160110
Entoiodine Shanghai likon high technology disinfection co. LTD 310102
digital caliper Ningbo yuanneng trading co. LTD 4859263
4-0 Silk Sutures Yuanlikang co. LTD 20172650032
8-0 Prolene Sutures Yuanlikang co. LTD 20172650032
Electric coagulation pen Chuang mei medical equipment co. LTD 28221777292
disposable syringe 1ml Shengguang medical products co. LTD 3262-2014
disposable syringe 10ml Shengguang medical products co. LTD 3262-2014
75% Medicinal alcohol Shandong anjie high-tech disinfection technology co. LTD 371402AAJ008
Pentobarbital sodium salt Sigma-Aldrich,Inc. 57-33-0
Physiological Saline Shandong qidu pharmaceutical co. LTD H37020766
Absorbent Cotton Swab Henan ruike medical co., LTD RK051
Surgical Instruments-Ophthalmic Jinzhong Shanghai co.LTD WA3050

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Leung, T. T., et al. Bowel obstruction following appendectomy: what is the true incidence. of Surgery. 250 (1), 51-53 (2009).
  2. Salminen, P., et al. Antibiotic Therapy vs. Appendectomy for Treatment of Uncomplicated Acute Appendicitis: The APPAC Randomized Clinical Trial. The Journal of the American Medical Association. 313 (23), 2340-2348 (2015).
  3. Mayo Clinic. Appendicitis. , at https://www.mayoclinic.org/diseases-conditions/appendicitis/diagnosis-treatment/drc-20369549 (2019).
  4. On the Appendix Vermiformis and the Evolution Hypothesis. Nature. 8, 509 (1873).
  5. Zahid, A. The vermiform appendix: not a useless organ. Journal of College of Physicians and Surgeons Pakistan. 14 (4), 256-258 (2004).
  6. Kooij, I. A., Sahami, S., Meijer, S. L., Buskens, C. J., Te Velde,, A, A. The immunology of the vermiform appendix: a review of the literature. Clinical and Experimental Immunology. 186 (1), 1-9 (2016).
  7. Sarkar, A., Saha, A., Roy, S., Pathak, S., Mandal, S. A glimpse towards the vestigiality and fate of human vermiform appendix-a histomorphometric study. Journal of Clinical and Diagnostic Research. 9 (2), 11 (2015).
  8. Fujihashi, K., et al. Human Appendix B-Cells Naturally Express Receptors for and Respond to. Interleukin-6 with Selective Iga1 and Iga2 Synthesis. Journal of Clinical Investigations. 88 (1), 248-252 (1991).
  9. Im, G. Y., et al. The appendix may protect against Clostridium difficile recurrence. Clinical Gastroenterology and Hepatology. 9 (12), 1072-1077 (2011).
  10. Gebbers, J. O., Laissue, J. A. Bacterial translocation in the normal human appendix parallels the development of the local immune system. Annal of the New York Academy of Sciences. , 337-343 (2004).
  11. Randal Bollinger,, Barbas, R., S, A., Bush, E. L., Lin, S. S., Parker, W. Biofilms in the large bowel suggest an apparent function of the human vermiform appendix. Journal of Theoretical Biology. 249 (4), 826-831 (2007).
  12. Smith, H., Parker, W., Kotzé, H., Laurin, S., M, Morphological evolution of the mammalian cecum and cecal appendix: Évolution morphologique de l'appendice du caecum des mammifères. Comptes Rendus Palevol. 16, (2017).
  13. Girard-Madoux, M. J. H., et al. The immunological functions of the Appendix: An example of redundancy. in Immunology. 36, 31-44 (2018).
  14. Wu, S. C., et al. Association between appendectomy and subsequent colorectal cancer development: an Asian population study. PLoS ONE. 10 (2), e0118411 (2015).
  15. Florin, T. H., Pandeya, N., Radford-Smith, G. L. Epidemiology of appendicectomy in primary sclerosing cholangitis and ulcerative colitis: its influence on the clinical behaviour of these diseases. Gut. 53 (7), 973-979 (2004).
  16. Arnbjornsson, E. Acute appendicitis as a sign of a colorectal carcinoma. Journal of Surgical Oncology. 20 (1), 17-20 (1982).
  17. Killinger, B. A., et al. The vermiform appendix impacts the risk of developing Parkinson's disease. Science Translatioanl Medicine. 10 (465), (2018).
  18. Chen, C. H., et al. Appendectomy increased the risk of ischemic heart disease. Journal of Surgical Research. 199 (2), 435-440 (2015).
  19. Bray, F., et al. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (6), 394-424 (2018).
  20. Smith, H. F., Parker, W., Kotze, S. H., Laurin, M. Multiple independent appearances of the cecal appendix in mammalian evolution and an investigation of related ecological and anatomical factors. Comptes Rendus Palevol. 12 (6), 339-354 (2013).
  21. Dasso, J. F., Obiakor, H., Bach, H., Anderson, A. O., Mage, R. G. A morphological and immunohistological study of the human and rabbit appendix for comparison with the avian bursa. Developmental and Comparative Immunology. 24 (8), 797-814 (2000).
  22. Smith, H. F., et al. Comparative anatomy and phylogenetic distribution of the mammalian cecal appendix. Journal of Evolutionary Biology. 22 (10), 1984-1999 (2009).
  23. Vandamme, T. F. Rodent models for human diseases. European Journal of Pharmacology. 759, 84-89 (2015).
  24. Prabhakar, S. Translational research challenges: finding the right animal models. Journal of Investigative Medicine. 60 (8), 1141-1146 (2012).
  25. Hosur, V., Low, B. E., Avery, C., Shultz, L. D., Wiles, M. V. Development of Humanized Mice in the Age of Genome Editing. Journal of Cellular Biochemistry. 118 (10), 3043-3048 (2017).
  26. Mizoguchi, A., Mizoguchi, E., Chiba, C., Bhan, A. K. Role of appendix in the development of inflammatory bowel disease in TCR-alpha mutant mice. Journal of Experimental Medicine. 184 (2), 707-715 (1996).
  27. Farkas, S. A., et al. Preferential migration of CD62L cells into the appendix in mice with experimental chronic colitis. European Surgical Research. 37 (2), 115-122 (2005).
  28. Morrison, P. J., et al. Differential Requirements for IL-17A and IL-22 in Cecal versus Colonic Inflammation Induced by Helicobacter hepaticus. American Journal of Pathology. 185 (12), 3290-3303 (2015).
  29. Tomiyasu, N., et al. Appendectomy suppresses intestinal inflammation in a murine model of DSS-induced colitis through modulation of mucosal immune systems. Gastroenterology. 118 (4), A863-A863 (2000).
  30. Krieglstein, C. F., et al. Role of appendix and spleen in experimental colitis. Journal of Surgical Research. 101 (2), 166-175 (2001).
  31. Cheluvappa, R., Luo, A. S., Palmer, C., Grimm, M. C. Protective pathways against colitis mediated by appendicitis and appendectomy. Clinical and Experimental Immunology. 165 (3), 393-400 (2011).
  32. Cheluvappa, R., Luo, A. S., Grimm, M. C. T helper type 17 pathway suppression by appendicitis and appendectomy protects against colitis. Clinical and Experimental Immunology. 175 (2), 316-322 (2014).
  33. Masahata, K., et al. Generation of colonic IgA-secreting cells in the caecal patch. Nature Communications. 5, (2014).
  34. Cheluvappa, R. A novel model of appendicitis and appendectomy to investigate inflammatory bowel disease pathogenesis and remediation. Biological Procedures Online. 16, (2014).
  35. Cheluvappa, R., Eri, R., Luo, A. S., Grimm, M. C. Modulation of interferon activity-associated soluble molecules by appendicitis and appendectomy limits colitis-identification of novel anti-colitic targets. Journal of Interferon and Cytokine Research. 35 (2), 108-115 (2015).
  36. Harnoy, Y., et al. Effect of appendicectomy on colonic inflammation and neoplasia in experimental ulcerative colitis. British Journal of Surgery. 103 (11), 1530-1538 (2016).
  37. Aaron, E., Walfish, R. A. C. C. Ulcerative Colitis. , at https://www.merckmanuals.com/professional/gastrointestinal-disorders/inflammatory-bowel-disease-ibd/ulcerative-colitis (2017).
  38. Laukoetter, M. G., et al. Intestinal cancer risk in Crohn's disease: a meta-analysis. Journal of Gastrointestestinal Surgery. 15 (4), 576-583 (2011).
  39. Neufert, C., Becker, C., Neurath, M. F. An inducible mouse model of colon carcinogenesis for the analysis of sporadic and inflammation-driven tumor progression. Nature Protocols. 2 (8), 1998-2004 (2007).
  40. Thaker, A. I., Shaker, A., Rao, M. S., Ciorba, M. A. Modeling colitis-associated cancer with azoxymethane (AOM) and dextran sulfate sodium (DSS). Journal of Visualized Experiments. 10 (67), (2012).
  41. Perides, G., van Acker, G. J. D., Laukkarinen, J. M., Steer, M. L. Experimental acute biliary pancreatitis induced by retrograde infusion of bile acids into the mouse pancreatic duct. Nature Protocols. 5 (2), 335-341 (2010).
  42. Schofield, W. B., Palm, N. W. Gut Microbiota: IgA Protects the Pioneers. Current Biology. 28 (18), R1117-R1119 (2018).
  43. Karthikeyan, V. S., et al. Carcinoma Cecum Presenting as Right Gluteal Abscess Through Inferior Lumbar Triangle Pathway-Report of a Rare Case. International Surgery. 99 (4), 371-373 (2014).
  44. Ruscelli, P., et al. Clinical signs of retroperitoneal abscess from colonic perforation Two case reports and literature review. Medicine (Baltimore). 97 (45), (2018).
  45. Friedman, G. D., Fireman, B. H. Appendectomy, appendicitis, and large bowel cancer). Cancer Research. 50 (23), 7549-7551 (1990).
  46. Stellingwerf, M. E., et al. The risk of colectomy and colorectal cancer after appendectomy in patients with ulcerative colitis: a systematic review and meta-analysis. Journal of Crohn's and Colitis. 13 (3), 309-318 (2018).

Tags

Medisin murine modell vedlegg caecal patch Gastrointestinal anatomi stor tarm tumor IgA azoxymethane dextran sulfat natrium IBD
Murine Appendektomi modell av kronisk kolitt assosiert tykktarmskreft ved presis lokalisering av Caecal patch
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Li, Y., Liu, J., Liu, G., Pan, Z.,… More

Li, Y., Liu, J., Liu, G., Pan, Z., Zhang, M., Ma, Y., Wei, Q., Xia, H., Zhang, R. X., She, J. Murine Appendectomy Model of Chronic Colitis Associated Colorectal Cancer by Precise Localization of Caecal Patch. J. Vis. Exp. (150), e59921, doi:10.3791/59921 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter