Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

מדידת התפשטות של תאים שרירים וסקולריים חלקה באמצעות לחץ כימיה

Published: October 30, 2019 doi: 10.3791/59930
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Department of Neuroscience, Cell Biology, and Physiology, Wright State University, 2Department of Surgery, Boonshoft School of Medicine, Wright State University

Summary

התפשטות היא חלק מכריע בתפקוד הסלולר, ובדיקה משותפת המשמשת להערכת רעילות פוטנציאלית של תרופות חדשות. מדידת התפשטות היא, לכן, שימוש תכוף בביולוגיה התא. כאן אנו מציגים שיטה פשוטה, רב-תכליתית של מדידת התפשטות כי ניתן להשתמש בתאים חסיד ושאינם חסיד.

Abstract

היכולת של תא להתרבות היא בלתי נפרד לתפקוד הרגיל של רוב התאים, והדיסרגולציה של התפשטות היא בלב תהליכי מחלות רבים. מסיבות אלה, מדידת ההפצה היא כלי נפוץ המשמש להערכת הפונקציה cell. ניתן למדוד את תפוצת התא רק על ידי ספירה; עם זאת, זהו אמצעי עקיף למדידת התפשטות. אחד האמצעים השכיחים של במישרין זיהוי תאים הכנת לחלק הוא על ידי התאגדות של התווית האנלוגית נוקלאוסייד. אלה כוללים את הרדיו האנלוגי נוקלאוטיל 3H-thymidine פלוס non-רדיואקטיבי נוקלאוסייד אנלוגיות כגון 5-bromo-2 ' Deoxyuridine (bromo) ו-5-ethynyl-2′-Deoxyuridine (EdU). התאגדות של EdU מזוהה על ידי לחיצה על כימיה, אשר יש מספר יתרונות כאשר בהשוואה BrdU. בדוח זה, אנו מספקים פרוטוקול למדידת התפשטות באמצעות התאגדות של EdU. פרוטוקול זה כולל אפשרויות לקריאות שונות, יחד עם היתרונות והחסרונות של כל אחד מהם. אנו גם דנים במקומות שבהם הפרוטוקול יכול להיות ממוטב או שונה כדי לענות על הצרכים הספציפיים של הניסוי המתוכנן. לבסוף, אנו נוגעים בדרכים כי פרוטוקול בסיסי זה ניתן לשנות עבור מדידת מטבוליטים תא אחרים.

Introduction

התפשטות היא חלק מכריע בתפקוד הסלולר1,2. שליטה על התפשטות ההשפעות על תהליכים נורמליים כגון פיתוח, תהליכים פתולוגיים כגון סרטן ומחלות לב וכלי דם. צמיחה היפרפלסטית של תאים שריר וסקולריים חלקה, למשל, הוא חשב להיות הקודמן טרשת עורקים3. שינויים בתפוצת התאים משמשים גם להערכת רעילות פוטנציאלית של תרופות חדשות. בהתחשב בהשפעה הנרחבת שלה, מדידת ההפצה היא התווך של מעבדות רבות בביולוגיה המבוססת על תאים.

ניתן למדוד את תפוצת התא על-ידי ספירת תאים בלבד אם אוכלוסיית הריבית מתפצלת במהירות רבה. עבור תאים הגדלים לאט יותר, ספירת תאים עשויה להיות פחות רגישה. התפשטות נמדדת לעתים קרובות על ידי התאגדות של התווית האנלוגית נוקלאוסייד. למרות התקן הזהב הוא 3H-thymidine התאגדות, מעבדות רבות מקבל הרחק משיטה זו בהתחשב בזמינות של חדש, לא רדיואקטיבי חלופות. אלה כוללים צבעי פלורסנט cytoplasmic, זיהוי של מחזור תאים חלבונים משויכים, והתאגדות של שאינם רדיואקטיביים נוקלאוסייד אנלוגיות כגון 5-bromo-2 ' deoxyuridine (Bromo) ו-5-ethynyl-2′-deoxyuridine (EdU)4.

צבעי cytoplasmic, כגון carboxyfluoraatstcdedit (CFSE), לזהות התפשטות משום שעוצמת החצאים של הצבע בכל פעם תא מחלק5. טכניקה זו משמשת בדרך כלל בזרימה cy, לנסות תאים שאינם חסיד. זה לא נעשה הרבה עבור תאים חסיד, אבל עם הדור החדש של הקוראים צלחת ההדמיה זה עשוי להשתנות. זיהוי של מחזור התא חלבונים הקשורים באמצעות נוגדנים מבוססי טכניקות (הזרימה cy, כימיה אימונוהיסטוכימיה, וכו ') משמש לעתים קרובות עבור רקמות או תאים שאינם חסיד. תאים/רקמות אלה חייב להיות קבוע מחלחל לפני כתמים. הפונקציה מזהה את הקוד האנלוגי מדומה BrdU ו-EdU דומים בגישה ל- 3שעות-thymidine. התאגדות של BrdU מזוהה על ידי נוגדנים אנטי BrdU, ולכן התאים חייב להיות קבוע וחדיר לפני כתמים. בנוסף, התאים חייבים להיות מטופלים עם DNase כדי לחשוף את האפיפי של BrdU.

התאגדות של EdU מזוהה על ידי לחיצה על כימיה, שבה הקבוצה האלקין והעזידה "לחץ" יחד בנוכחות של נחושת קטליטי. כל קבוצה יכולה לשמש כמולקולה הביואופטית המשולבת או מולקולה גילוי4. הקבוצה האלמני הזמינה מסחרית. לצורך התפשטות ההפצה, לפיכך, פונקציונליות האלנובית של נוקלאוסייד אנלוגי מזוהה על ידי עזידה מצומת לצבע פלורסנט או סמן אחר. לשילוב של EdU יש מספר יתרונות על BrdU. ראשית, מכיוון שקבוצות האלאלקין והעזידה אינן מצויים בתאי היונקים, האינטראקציה הזאת היא מאוד ספציפית עם רקע נמוך6. בגלל שתי הקבוצות הן קטנות, תאים לא צריך לעבור דנטורציה DNA כדי לחשוף את נוקלאוטיד אנלוגי כנדרש brdu7. לבסוף, לחץ על כימיה הוא תכליתי מאוד, והוא יכול לשמש תיוג מטבולית של DNA, RNA, חלבון, חומצות שומן, ופחמימות8,9,10,11. אם יעד הריבית הmetabolically נמצא על משטח התא, ניתן לתייג תאים חיים12. בנוסף, תאים יכולים להיות מעובדים עוד יותר עבור הוספת כתמים אימונולוורםעם נוגדנים.

הפרוטוקול הבא מתאר את השימוש ב-EdU התאגדות ולחץ כימיה כדי למדוד התפשטות בתאי השריר החלק כלי הדם האנושיים (איור 1). אנו מראים שלוש דרכים שונות של התאגדות של EdU ניתן למדוד, מייצגים תוצאות מכל אחד, ואת היתרונות והחסרונות שלהם. מדידת התפשטות באמצעות כימיה לחץ היא שימושית במיוחד עבור חסיד, תאים הגדלים לאט יותר. בנוסף, את המבנה של התא הוא מתוחזק היטב, מבוססי נוגדן מכתים ניתן גם לבצע.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. זיהוי של EdU באמצעות תווית פלורסנט

  1. פתרונות מניות
    1. הכינו פתרון מניות של 5 ממ מ על ידי הוספת 12.5 מ"ג של EdU ל 10 מ ל של כפול מזוקקים H2O.
    2. להכין את רכיבי הפתרון תיוג: 200 mM טריס (3-הידרוקסימתיל) אמין (THPTA) (100 mg ב 1.15 mL H2o), 100 MM cuso4 (15.95 Mg ב 1 ml h2o; להפוך טריים), 10 מ"מ Cy3 picolyl-azide (1 מ"ג בתוך 95.3 mL-h2o) , מאוחסן ב-5 μL מעלות at-20 ° c), ו 1 ascorbate נתרן (200 mg ב 1 mL H2O; להפוך טריים).
    3. הכנת resazurin מניות פתרון בריכוז של 0.15 mg/mL. מסנן לעקר ולאחסן 1 mL הבליטים ב 4 ° c.
      הערה: picolyl אזיד זמין מצומת לכמה fluors שונים, biotin, ו חזרת peroxidase (hrp).
  2. סמן תאים שריר וסקולריים חלקה (VSMC) עם EdU.
    הערה: vsmcs האנושי מבודדים מעורקים כסל באמצעות התרחבות מפיסות הרקמה ההסבר. כאשר גדל בתוך מדיה חינם סרום עם אינסולין, העברת, סלניום תאים אלה לבטא סמנים VSMC smoothelin, שריר חלק רירן שרשרת כבדה (SM-MHC) ו-SMC αactin13.
    1. לוחית כלי דם חלקה שרירים בתוך 2 x 104/mL ב בינונית של הנשר שונה של העיט (dmem) ב 96 צלחת היטב.
      הערה: התאים גדלים ב 37 ° צ' בתקשורת תא שרירים חלקה עם 2% סרום עוברי העובר.
    2. אופציונלי אפשר מספר שעות למשך הלילה לצורך הדבקות. הוסף 20 מניות Μrea במלאי לכל באר. מחלת הקרינה ב 37 ° c עבור 3 ה. לקרוא את האות הפלואורסצנטית בקורא צלחת (560ex, 594em). החלף מדיה באמצעות DMEM טרי.
      הערה: שלב זה הוא אופציונלי. Resazurin משמש לנרמל מספרי תאים וחשבון עבור השתנות היטב בציפוי14.
    3. הוספת מלוחים באגירה פוספט (PBS) או גורם הגדילה הנגזר של טסיות (PDGF) 30 ng/mL ל 3-6 בארות לכל טיפול בתחילת תקופת התרבות ו הדגירה עבור 72 h.
    4. לדלל 5 מ"מ מלאי של המניה 1 מ"מ. הוסף 2 μL לכל הבאר (ריכוז סופי 20 μM) עבור 24 שעות האחרונות של תקופת התרבות 72 h. אל תוסיף EdU לקבוצה אחת של שכפול. בארות אלה ישמשו לקביעת מעבר לאור ברקע.
      הערה: משך התרבות והתיוג עם EdU מותאם במיוחד לתאי שריר חלקים, אך ייתכן שיהיה צורך לשנותם לכל סוג תא.
  3. תקן תאים פאראפורמלדהיד.
    1. הסרת מדיה והוספת 150 μL של 4% בכיוון הערוץ (PBS) למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
    2. להסיר את התחתית ולהוסיף 150 μl של 1% פוליאתילן גליקול טרט-octylphenyl אתר (TX-100) (במים) בבאר עבור 30 דקות בטמפרטורת החדר.
    3. הסר TX-100 על ידי שטיפת שלוש פעמים עם PBS.
      התראה: המטה רעיל, לטפל בזהירות.
      הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן. ניתן לאחסן תאים קבועים ב-PBS ב-4 ° c.
  4. זיהוי משולב של EdU.
    1. לבצע תיוג פתרון (10 מ"ל לכל 96 צלחת הבאר, באמצעות הפנימי 60 בארות) רק לפני השימוש על ידי הוספת ריאגנטים מתוך פתרונות המניה בסדר הבא: thpta 20 μl, cuso4 20 μl, Cy3 picolyl אזיד 5 μl, Na ascorbate 100 μl ל-PBS עבור נפח כולל של 10 mL.
    2. להסיר PBS מבארות ולהוסיף 150 μL של הפתרון תיוג לכל טוב. דגירה 30 דקות ב 37 ° c. כדי לזהות את כל גרעיני, להוסיף 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) לכל טוב. קרא על הקורא צלחת הזריחה (Cy3 550ex, 570em; DAPI 350לשעבר, 470em) או תמונה על מיקרוסקופ.
      הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן. ניתן לאחסן תאים קבועים ומוכתמים ב-PBS ב-4 ° צ' ובתמונה במועד מאוחר יותר.

2. זיהוי של EdU באמצעות הומינסנציה

  1. סעיפים שלמים 1.1 – 1.3.
  2. הכינו טריס-מלוחים באגירה עם 0.1% polysorbate 20 (TBST).
  3. . בלוק בארות
    1. הוסף 150 μL של חסימת מאגר (טבלה של חומרים) על כל באר ו מארג עבור 90 דקות בטמפרטורת החדר.
    2. הסר מאגר חוסם ושטוף שלוש פעמים עם 200 μL של PBS.
  4. זיהוי משולב של EdU.
    1. הפוך את פתרון התיוג כמכוון בשלב 1.4.1, והחליף ביוטין picolyl עבור Cy3 picolyl אזיד.
    2. רוחצים את הבארות חמש פעמים עם 200 μL של TBST, עם טלטול, 3 דקות לכביסה.
    3. Peroxidases אנדודוגני כיבוי עם 150 μL של 0.3% H2O2 עבור 20 דקות בטמפרטורת החדר.
    4. הסרת H2O2 ולשטוף חמש פעמים עם 200 ΜL של tbst, עם טלטול 3 דקות לשטוף.
    5. לדלל streptavidin-חזרת peroxidase (SA-HRP; 1:200) ב TBST ולהוסיף 50 μL לכל טוב. . משטח 1 בטמפרטורת החדר
    6. שטוף חמש פעמים עם 200 μL של TBST, עם טלטול, 3 דקות לכביסה.
    7. הוסף 50 μL של שיטת האנזים החיסוני המקושרת באמצעות אנזימים (שולחן חומרים) לכל באר.
    8. קרא מיד בקורא לוחית המסוגל לזהות הומינסנציה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

באיור 2, אנו להדגים את התוצאות של שלושה ניסויים שונים מדידת התפשטות VSMC בתגובה pdgf. לאחר שגדל את התאים במדיה שגובשה עבור SMCs, אנו ביצעו את הניסוי ב-DMEM בחינם סרום, כדי לחסל את כל ההשפעות הפוטנציאליות של סרום או גורמי גדילה על התפשטות. באיור 2A אנו משווים תוצאות, מאותו ניסוי, באמצעות פלורסנט לעומת הבדיקה זורח. כדי לקרוא את הלוחיות הללו, השתמשנו בקורא מיקרופלייט רב-שכבתי שיכול לקרוא ספיגה, זריחה והזדקנות (ראה טבלת חומרים).

באמצעות הקורא לוחית בסריקת מצב טוב, קריאות פלורסנט ממוצעים על הבאר כולה. מצב זה מקל על אי-דיוקים פוטנציאליים עקב הבדלים בין המרכז לבין הקצוות של הבאר. עם זאת, אם מעט מאוד גרעיני הם חיוביים, קריאת תוצאות בדרך זו עשויה להיות מעריכה את "מספר" תאים חיוביים כאשר רק מעטים הם חיוביים. מספר, באמצעות הבדיקה הזאת, פירושו של קרינה ביחס לזה של היטב אחר, ולא מספרי תאים מדויקים. בנוסף, אם יש סיבים או גוש של תאים מתים שקולט פלואורסצנטית, זה ייכלל בסריקת האזור. עם זאת, היתרון של שימוש בקורא הצלחות הוא הזמן. בזמן שקריאה במצב סריקה אורכת 15 שניות לכל היותר, היא אוטומטית בניגוד לשיטה האישית האינטנסיבית בזמן של צילום תמונות וניתוחם באמצעות תוכנת דימות.

כדי לתקן את האומדנים הפוטנציאליים מתוך השיטה הנ ל, המירו את סריקת הפלורסנט לתוך בדיקה הומוגנית, נוזלי שבו התאים הנוטלים את EdU מזוהים עם moiety azide-biotin, אשר בתורו זוהה עם streptavidin-חזרת peroxidase (ראה איור 1). כמות החזרת peroxidase לאחר מכן מכמת באמצעות מצע סטנדרטי המעוצב עבור אליסה. היתרון של טכניקה זו הוא בדיקה הומוגנית יותר, ואיור 2א, B מציג דוגמאות של ניסויים שבהם שיטה זו היתה מועסק. בנוסף, ניתן לקרוא את הצלחת בתוך שניות. עם זאת, ישנם חסרונות לשיטה זו. ראשית, הרקע עם שיטה זו גבוה יותר מאשר עם הזריחה. כדי להקטין את הרקע, אנו שילב שלב חסימה ושטיפת מספר. כשיקוף של רקע זה, פקדים שליליים (תאים לא מטופלות) נוטים להיות גבוהים יותר, ועליית הקיפול בהפצה נמוכה יותר. שנית, כמו עם הבדיקה הפלואורסצנטית, כל סיבים או תאים מתים הקולטים ריאגנטים לזיהוי יוסיף לאור המוחלט.

בניסיון להקטין את השונות בניסויים הנ ל, הצלחנו לנרמל את התוצאות לספירות תאים ראשוניות. לצורך התפשטות ההפצה, יש לבצע נורמליזציה על תאים חיים בתחילת השיטת העבודה לפני הפרדת התאים. בנוסף, האפשרות לא יכולה להשפיע על תפקוד התא או על התאגדות של EdU. בהינתן אילוצים אלה, בחרנו להשתמש בחילוף החומרים כשיקוף של מספר התא באמצעות resazurin14. תוצאות עם ובלי נורמליזציה מוצגות באיור 2B. עם זאת, בקבוצה נפרדת של ניסויים גילינו ששיטה זו אינה רגישה מספיק כדי לזהות הבדלים קטנים במספרי תאים. בנוסף, כל שגיאה בבדיקה זו מציגה שגיאה רבה יותר בניסוי כולו. מסיבות אלו, אנו בחרו לנקוט בטיפול יוצא דופן בתאים באופן שווה ככל האפשר, ולא לבצע שלב נורמליזציה.

כדי להיות בטוח שאנו מקבלים את התוצאות המדויקות ביותר האפשרי, החזרנו לצביעת פלורסנט (סעיף 1) וספירת תאים באמצעות מיקרוסקופ ניאון הפוך. היתרון של שיטה זו הוא שניתן לראות פיזית ולספור את התאים החיוביים, ולהבטיח את הדיוק ביותר (איור 3). כל פסולת פלורסנט יכולה להיות מחוץ לספירה. ספירות רקע ללא EdU הן 0 מכיוון שאין אפשרות לראות את הזריחה הגלויה, ולכן אין רקע לחיסור. החיסרון העיקרי של שיטה זו הוא הזמן. כדי לספור גרעינים בתאים מצופה בצלחת 96 היטב, אנו לוקחים 3 תמונות לכל טוב של שני התאים החיוביים של EdU והתאים הכולל (DAPI), המחייב 6 תמונות לכל טוב. אנו לוקחים תמונות במאונך מן המותניים של החלק התחתון של הבאר, מטפלת לא חפיפה ולספור תאים פעמיים. ספירת התאים הכוללת מעניקה לנו פיסת מידע נוספת המאשרת את תוצאות ההתפשטות שלנו. עם זאת, לאור זמן ההכפלה איטי יחסית של VSMC (36 לערך 48 h), עלייה מקפלים בתאים הכולל מגורה עם PDGF לעומת פקדים הוא נמוך הרבה יותר מאשר להגדיל את הקיפול של אדו תאים חיוביים, ולכן אנו למדוד התאגדות של EdU (איור 2C).

הדרך היעילה והמדויקת ביותר לספירת התאים החיוביים והכוללת של EdU היא באמצעות קורא לוחית דימות. שיטה זו משלבת את הדיוק של ספירה עם מהירות האוטומציה. החיסרון העיקרי הוא כי פיסת ציוד זה אינו זמין בכל מוסד. בהשוואת ספירות ידניות לעומת זאת, הספירה הידנית החיובית של EdU הייתה זהה במהותה לספירה האוטומטית (איור 2C, שמאל), כפי שהיו הספירות הכוללות שאינן מוסטימולציה (איור 2c, מימין). עם זאת , הספירה הידנית הייתה נמוכה יותר מהספירה האוטומטית בתאים ממריצים בסכום של pdgf. הבדל זה כנראה מתייחס לדפוסי צמיחת תאים. בגלל התאים נוטים לצמוח במרכז הבאר, עם מספרים קטנים ספירות אוטומטי וידני היו זהים כמעט. עם זאת, עם מספרים גבוהים יותר היו סביר יותר תאים בקצוות ואת ספירות ידני, אשר לא ללכוד תאים בפריפריה של הבאר, היו פחות מדויקים.

Figure 1
איור 1: מבט כולל על זיהוי של EdU על-ידי קרינה פלואורסצנטית או לומינסנציה.
VSMC או תאים חסיד אחרים מטופלים תחת תנאים של עניין. EdU נוסף ל -24 התקופות האחרונות של תקופת התרבות ומשולבים ב-DNA של הפרדה בין תאים. משולב EdU מזוהה אז באמצעות האור הפלואורסצנטית (סעיף 1) או לומינציה (פרוטוקול סעיף 2). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: מדידת התפשטות באמצעות קריאות שונות באמצעות התאגדות של EdU ולחיצה על כימיה.
(א) vsmcs היו מתורבתים בנוכחות או היעדרות של pdgf. EdU נוספה ב -24 ה התרבות האחרונה, והתאגדות זוהתה על-ידי הקרינה הפלואורסצנטית (סעיף 1) או לומינציה (פרוטוקול סעיף 2). (ב) התייחסו אל vsmcs כמתואר בלוח א, והתאגדות של EdU נמדדה על ידי האור. התוצאות הנורמו לספירות תאים ראשוניות באמצעות resazurin שיטת הכדאיות. (ג) vsmcs טופלו כמו בלוח A, ו התאגדות של EdU נמדדה על ידי קרינה פלואורסצנטית. EdU תאים חיוביים נספרו באופן אוטומטי, באמצעות קורא לוחית דימות או באופן ידני על-ידי הדמיה ולאחר מכן ספירת שימוש בתוכנת דימות. התוצאות המוצגות הן סטיית התקן הממוצעת ± standard של 3 – 6 משכפל לכל טיפול.

Figure 3
איור 3: ויזואליזציה של EdU תאים חיוביים בעקבות לחץ על פרוטוקול הזריחה.
התייחסו ל-VSMC כמתואר באיור 2, והשילוב של EdU זוהה באמצעות קרינה פלואורסצנטית (סעיף 1). כל תמונה היא באר יחידה של 96 צלחת טובה. סך כל הגרעינים מוצגים בכחול (DAPI) ו-EdU הגרעינים החיוביים הם ירוקים. סרגל בקנה מידה = 50 μm. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

התאגדות של EdU היא דרך פשוטה ופשוטה למדוד הפצת תאים; הוא שימושי במיוחד עבור תאים חסיד13. הפרוטוקול שלנו משתמש בתאי שריר חלקה, אבל זה חל על כל תא חסיד (אפיתל, אנדותל, וכו '). למרות שהפרוטוקול אינו מורכב, הצעד הקריטי היחיד מבצע את פתרון התיוג-יש להוסיף את החומרים בסדר המפורט. בנוסף, כמו הבלוטים המערביים, אם משתמשים בלוח האור באופן מיידי, יש לקרוא את הלוחית מיד.

ניתן לשנות או למטב כמה חלקים של הפרוטוקול בהתאם לצורך. חלק אחד הוא משך הדגירה עם EdU. מכיוון שהמטרה שלנו היתה לזהות כמו תאים מתרבים רבים ככל האפשר, הוספנו EdU עבור 24 שעות מלא לפני תיקון וכתמים. עם זאת, תזמון זה כנראה מודד תאים בשלבים S ו-G2/M. כדי לתייג רק תאים בשלב S, Cecchini et al. לייעץ כי אפילו החלוקה באיטיות של תאים להיות מודדות עם EdU עבור לא יותר מ 6 שעות7. חלק נוסף בפרוטוקול שניתן למטב הוא כמות הכלור. אלאלקין-עזידה התגובות דורשים זרז נחושת (CuSO4). השומר נחושת. במצב חמצון הכרחי היחס של הכלור לנחושת יכול להיות מגוון, כדי להגדיל את האיגוד האלאני-עזידה. אנו צופים כתמים בהירים עם כלאטור: יחס נחושת של 2:1, בהקשר של גם באמצעות picolyl azide. Picolyl moiety מוסיף פעילות הכלפת המקטינה את ריכוז הנחושת הדרושה ומגבירה את היעילות של התגובה15. הכלור: יחסי נחושת ניתן להגדיל, בדרך כלל עד 5:1, כדי לייעל את צורכי החוקר. כלקטור טוב יותר, 2-[4-({bis (1-tert-בוטיל-1H-1, 2, 3-triazol-4-לאיל) מתיל] אמינו} מתיל)-1H-1, 2, 3-triazol-1-yl) חומצה אצטית (BTTAA), עכשיוהוא זמין מ הכלור הזה לא היה זמין מבחינה מסחרית. כאשר התחלנו לראשונה את הפרוטוקול הזה לבסוף, למרות שאנו משתמשים פאראפורמלדהיד כקיבעון בפרוטוקול זה, תאים יכולים להיות קבוע עם מתנול, אשר גם ברור את שלב החדירות. התיקון עם מתנול יכול להיות שימושי אם מישהו רוצה לשלב מכתים החיסונית של חלבונים סלולריים ספציפיים עם שילוב של EdU.

חיסרון אחד של שיטה זו הוא הרעילות הפוטנציאלית של EdU, במיוחד כאשר ברציפות תיוג עם EdU במשך ימים בניגוד לתווית הדופק של שעות. בהתאם לתאים המשמשים, EdU נמצא לגרום מעצר מחזור התא או אפילו אפופטוזיס17. רעילות זו נחשבת כתוצאה משכפול DNA פגום מתוספת של נוקלאוטידים מלאכותיים18. מחקרים הוכיחו רעילות זו כדי להיות תלויים קו התאים התלות ריכוז17. לא שמנו לב לבעיות רעילות בלימודיי.

לסיכום, מדידת התפשטות באמצעות EdU וכימיה לחץ יש מספר יתרונות על שיטות אחרות בשימוש נפוץ כגון BrdU או 3H-thymidine התאגדות. אלה כוללים הימנעות רדיואקטיביות, ספציפיות גבוהה עם רקע נמוך, ואין צורך בצעדי דנטורציה קשים. הוקמה לאחר, לחץ על כימיה הוא תכליתי מאוד, והוא יכול להיות שונה בקלות עבור תיוג מטבולית של RNA, חלבון, חומצות שומן, ופחמימות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgments

אנו מודים לקייטי קארול. על סיוע טכני אנו מודים גם ד ר דוד Cool ואת המעבדה לניתוח פרוטאומניקס להוראה על והאספקה של הקורא לוחית הדמיה של העיבוד. עבודה זו נתמכת על ידי המענק של קרן רייט סטייט (כדי L.E.W.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5-Ethynyl-2'-deoxyuridine Carbosynth NE08701
biotin picolyl azide Click Chemistry Tools 1167-5
CuSO4 Fisher Scientific C1297-100G
Cy3 picolyl azide Click Chemistry Tools 1178-1
Cytation Plate Reader Biotek
EVOS Microscope Thermo Fisher Scientific
Hydrogen peroxide solution Sigma-Aldrich 216763
Na ascorbate Sigma-Aldrich 11140-250G
NucBlue Fixed Cell Stain Ready Probes Invitrogen R37606 DAPI nuclear stain
Odyssey Blocking Buffer Li-Cor 927-40000 blocking buffer
Paraformaldehyde Electron Microscopy Services 15710
PBS Fisher Scientific SH3002802
Sodium Chloride Sigma Life Science S3014-5kg
Streptavidin Horseradish Peroxidase Conjugate Life Technologies S911
Super Signal ELISA Femto Thermo Scientific PI137075 ELISA substrate
Synergy Plate Reader Biotek
THPTA Click Chemistry Tools 1010-100
Tris Hydroxymethyl Aminomethane Hydrochloride (Tris-HCl) Fisher Scientific BP153-500
Triton X 100 Bio-Rad 1610407
Tween 20 Fisher Scientific BP337-100

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fuster, J. J., et al. Control of cell proliferation in atherosclerosis: Insights from animal models and human studies. Cardiovascular Research. 86 (2), 254-264 (2010).
  2. Zhu, J., Thompson, C. B. Metabolic regulation of cell growth and proliferation. Nature Reviews Molecular Cell Biology. , (2019).
  3. Cizek, S. M., et al. Risk factors for atherosclerosis and the development of preatherosclerotic intimal hyperplasia. Cardiovascular pathology the Official Journal of the Society for Cardiovascular Pathology. 16 (6), 344-350 (2007).
  4. Romar, G. A., Kupper, T. S., Divito, S. J. Research techniques made simple: Techniques to assess cell proliferation. Journal of Investigative Dermatology. 136, e1-e7 (2016).
  5. Quah, B. J. C., Parish, C. R. The Use of Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester (CFSE) to Monitor Lymphocyte Proliferation. Journal of Visualized Experiments. 44, 4-7 (2010).
  6. Sletten, E., Bertozzi, C. R. Bioorthogonal Chemistry: Fishing for Selectivity in a Sea of Functionality. Angewandte Chemie International Edition. 48 (38), 6974-6998 (2009).
  7. Cecchini, M. J., Amiri, M., Dick, F. A. Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells. Journal of Visualized Experiments. (59), 1-7 (2012).
  8. Clarke, S. T., Calderon, V., Bradford, J. A. Click Chemistry for Analysis of Cell Proliferation in Flow Cytometry. Current Protocols in Cytometry. 82 (1), (2017).
  9. Jiang, H., et al. Monitoring dynamic glycosylation in vivo using supersensitive click chemistry. Bioconjugate Chemistry. 25 (4), 698-706 (2014).
  10. Izquierdo, E., Delgado, A. Click chemistry in sphingolipid research. Chemistry and Physics of Lipids. 215, 71-83 (2018).
  11. Jao, C. Y., Salic, A. Exploring RNA transcription and turnover in vivo by using click chemistry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (41), 15779-15784 (2008).
  12. Hong, V., Steinmetz, N. F., Manchester, M., Finn, M. G. Labeling Live Cells by Copper-Catalyzed Alkyne-Azide Click Chemistry. Bioconjugate Chemistry. 21 (10), 1912-1916 (2011).
  13. Arumugam, P., Carroll, K. L., Berceli, S. A., Barnhill, S., Wrenshall, L. E. Expression of a Functional IL-2 Receptor in Vascular Smooth Muscle Cells. The Journal of Immunology. 202 (3), 694-703 (2019).
  14. Stoddart, M. J. Mammalian cell viability: methods and protocols. , Humana Press. New York, NY. (2011).
  15. Uttamapinant, C., Tangpeerachaikul, A., Grecian, S., Clarke, S., Singh, U. Fast, Cell-compatible Click Chemistry with Copper-chelating Azides for Biomolecular Labeling. Angewandte Chemie International Edition. 154 (11), 2262-2265 (2012).
  16. Bescancy-Webler, C., et al. Raising the Efficacy of Bioorthogonal Click Reactions for Bioconjugation: A Comparative Study. Angewandte. Chemie International Edition. 50 (35), 8051-8056 (2011).
  17. Diermeier-Daucher, S., et al. Cell type specific applicability of 5-ethynyl-2′-deoxyuridine (EDU) for dynamic proliferation assessment in flow cytometry. Cytometry Part A. 75 (6), 535-546 (2009).
  18. Cieślar-Pobuda, A., Los, M. J. Prospects and limitations of “Click-Chemistry”-based DNA labeling technique employing 5-ethynyl-2′deoxyuridine (EdU). Cytometry Part A. 83 (11), 977-978 (2013).

Tags

ביולוגיה סוגיה 152 לחץ על כימיה התפשטות כלי דם חלקה שריר תאים חסיד זריחה EdU
מדידת התפשטות של תאים שרירים וסקולריים חלקה באמצעות לחץ כימיה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wong, V., Arumugam, P., Wrenshall,… More

Wong, V., Arumugam, P., Wrenshall, L. E. Measuring Proliferation of Vascular Smooth Muscle Cells Using Click Chemistry. J. Vis. Exp. (152), e59930, doi:10.3791/59930 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter