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Biology

Messung der Proliferation von vaskulären glatten Muskelzellen mit Hilfe der Klickchemie

Published: October 30, 2019 doi: 10.3791/59930
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Department of Neuroscience, Cell Biology, and Physiology, Wright State University, 2Department of Surgery, Boonshoft School of Medicine, Wright State University

Summary

Proliferation ist ein kritischer Teil der zellulären Funktion, und eine gemeinsame Auslesung verwendet, um potenzielle Toxizität von neuen Medikamenten zu bewerten. Die Messung der Proliferation ist daher ein häufig verwendeter Assay in der Zellbiologie. Hier präsentieren wir eine einfache, vielseitige Methode zur Messung der Proliferation, die in haftenden und nicht haftenden Zellen eingesetzt werden kann.

Abstract

Die Fähigkeit einer Zelle, sich zu vermehren, ist integraler Bestandteil der normalen Funktion der meisten Zellen, und dysregulation der Proliferation ist das Herzstück vieler Krankheitsprozesse. Aus diesen Gründen ist die Messung der Proliferation ein gängiges Werkzeug zur Bewertung der Zellfunktion. Die Zellproliferation kann einfach durch Zählen gemessen werden; dies ist jedoch ein indirektes Mittel zur Messung der Proliferation. Ein gängiges Mittel zur direkten Erkennung von Zellen, die sich auf die Teilung vorbereiten, ist die Einbindung von markierten Nukleosidanalogien. Dazu gehören das radioaktive Nukleosid-Analog3 H-Thymidin plus nicht-radioaktive Nukleosid-Analoga wie 5-Brom-2'-Deoxyuridin (BrdU) und 5-Ethynyl-2-Deoxyuridin (EdU). Die Einbindung von EdU wird durch Klickchemie erkannt, die im Vergleich zu BrdU mehrere Vorteile hat. In diesem Bericht stellen wir ein Protokoll zur Messung der Proliferation durch die Einbeziehung von EdU zur Verfügung. Dieses Protokoll enthält Optionen für verschiedene Auslesungen, zusammen mit den Vor- und Nachteilen der einzelnen. Wir diskutieren auch Orte, an denen das Protokoll optimiert oder geändert werden kann, um den spezifischen Anforderungen des geplanten Experiments gerecht zu werden. Schließlich berühren wir die Möglichkeiten, wie dieses Basisprotokoll zur Messung anderer Zellmetaboliten geändert werden kann.

Introduction

Proliferation ist ein kritischer Teil der Zellfunktion1,2. Die Kontrolle der Proliferation beeinflusst normale Prozesse wie Entwicklung und pathologische Prozesse wie Krebs und Herz-Kreislauf-Erkrankungen. Hyperplastisches Wachstum von vaskulären glatten Muskelzellen, zum Beispiel, wird angenommen, dass ein Vorläufer der Arteriosklerose3. Veränderungen in der Zellproliferation werden auch verwendet, um die potenzielle Toxizität neuer Medikamente zu bewerten. Angesichts ihrer weitverbreiteten Wirkung ist die Messung der Proliferation eine tragende Säule vieler Laboratorien auf Zellbiologiebasis.

Die Zellproliferation kann durch einfaches Zählen von Zellen gemessen werden, wenn sich die Zellpopulation von Interesse ziemlich schnell teilt. Bei langsamer wachsenden Zellen ist die Zellanzahl möglicherweise weniger empfindlich. Die Proliferation wird oft durch die Einbindung von markierten Nukleosid-Analogen gemessen. Obwohl der Goldstandard 3H-Thymidin-Einbau ist, kommen viele Laboratorien angesichts der Verfügbarkeit neuerer, nicht-radioaktiver Alternativen von dieser Methode weg. Dazu gehören zytoplasmatische Fluoreszenzfarbstoffe, der Nachweis von Zellzyklus-assoziierten Proteinen und die Einbeziehung nicht-radioaktiver Nukleosid-Analoge wie 5-Brom-2'-Deoxyuridin (BrdU) und 5-Ethynyl-2-Deoxyuridin (EdU)4.

Zytoplasmatische Farbstoffe, wie Carboxyfluorescein-Diacetat-Succinimidylester (CFSE), detektieren die Proliferation, da sich die Intensität des Farbstoffs jedes Mal halbiert, wenn sich die Zelle teilt5. Diese Technik wird häufig in der Durchflusszytometrie für nicht anhaftende Zellen verwendet. Es wurde nicht viel für anhängnisende Zellen verwendet, aber mit der neuen Generation von bildgebenden Plattenlesern kann sich dies ändern. Der Nachweis von Zellzyklus-assoziierten Proteinen durch Antikörper-basierte Techniken (Durchflusszytometrie, Immunhistochemie usw.) wird häufig für Gewebe oder nicht anhaftende Zellen verwendet. Diese Zellen/Gewebe müssen vor der Färbung fixiert und permeabilisiert werden. Nukleosid-Analoga BrdU und EdU ähneln sich in der Annäherung an 3H-Thymidin, jedoch ohne die Unannehmlichkeiten der Radioaktivität. Die Aufnahme von BrdU wird durch Anti-BrdU-Antikörper nachgewiesen, und daher müssen Zellen vor der Färbung fixiert und permeabilisiert werden. Darüber hinaus müssen Zellen mit DNase behandelt werden, um das BrdU-Epitop freizulegen.

Die Einbindung von EdU wird durch Klickchemie erkannt, bei der Alkyn- und Azidgruppen in Gegenwart von katalytischem Kupfer zusammen "klicken". Beide Gruppen können als biosynthetisch eingebautes Molekül oder Detektionsmolekül4dienen. Kommerziell erhältliche Nukleosid-Analoga haben die Alkyngruppe angeschlossen. Bei Proliferationstests wird daher das alkyne-funktionalisierte Nukleosid-Analog durch ein Azid nachgewiesen, das mit einem Fluoreszenzfarbstoff oder einem anderen Marker konjugiert ist. Die Eingemeindung von EdU hat mehrere Vorteile gegenüber BrdU. Erstens, da Alkyn- und Azidgruppen nicht in Säugetierzellen gefunden werden, ist diese Wechselwirkung sehr spezifisch mit einem niedrigen Hintergrund6. Da beide Gruppen klein sind, müssen sich Zellen keiner DNA-Denaturierung unterziehen, um das Nukleosid-Analog zu belichten, wie es für BrdU7erforderlich ist. Schließlich ist Click Chemistry sehr vielseitig und kann für die metabolische Kennzeichnung von DNA, RNA, Protein, Fettsäuren und Kohlenhydraten8,9,10,11verwendet werden. Befindet sich das metabolisch beschriftete Ziel auf der Zelloberfläche, können lebende Zellen als12bezeichnet werden. Darüber hinaus können Zellen für immunfluoreszierende Färbung mit Antikörpern weiterverarbeitet werden.

Das folgende Protokoll beschreibt die Verwendung von EdU-Inkorporation und Klickchemie, um die Proliferation in menschlichen vaskulären glatten Muskelzellen zu messen (Abbildung 1). Wir zeigen drei verschiedene Möglichkeiten auf, wie die Integration von EdU gemessen werden kann, repräsentative Ergebnisse aus jeder und ihre Vor- und Nachteile. Die Messung der Proliferation mittels Klickchemie ist besonders nützlich für anhantibe, langsamer wachsende Zellen. Darüber hinaus ist die Morphologie der Zelle gut gepflegt und auch antikörperbasierte Färbungen können durchgeführt werden.

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Protocol

1. Nachweis von EdU mit Fluoreszenzetikett

  1. Aktienlösungen
    1. Bereiten Sie eine 5 mM EdU-Lagerlösung vor, indem Sie 12,5 mg EdU auf 10 ml doppelt destilliertesH2 Ohinzufügen.
    2. Bereiten Sie die Etikettierlösungskomponenten vor: 200 mM tris(3-hydroxypropyltriazolylmethyl)amin (THPTA) (100 mg in 1,15 mL H2O), 100 mM CuSO4 (15,95 mg in 1 mLH2O; frisch machen), 10 mM Cy3 Picolyl-Azid (1 mg in 95,3 ml H2O , gelagert in 5 L Aliquots bei -20 °C) und 1 M Natriumascorbat (200 mg in 1 mlH2O; frisch machen).
    3. Resazurin-Stammlösung in einer Konzentration von 0,15 mg/ml vorbereiten. Filter sterilisieren und 1 ml Aliquots bei 4 °C lagern.
      HINWEIS: Picolyl-Azid ist konjugiert mit verschiedenen Fluoren, Biotin und Meerrettichperoxidase (HRP) erhältlich.
  2. Beschriften Sie vaskuläre glatte Muskelzellen (VSMC) mit EdU.
    HINWEIS: Menschliche VSMCs wurden von Iliasarterien durch Auswuchs aus explantierten Gewebestücken isoliert. Wenn in Serum freie Medien mit Insulin, Transferrin, Selen diese Zellen exprimieren VSMC Marker Smoothelin, glatte Muskel Myosin schwere Kette (SM-MHC) und SMC -actin13.
    1. Platte vaskuläre glatte Muskelzellen bei 2 x 104/ml in Dulbeccos modifiziertem Eagle es Medium (DMEM) in einer 96-Well-Platte.
      HINWEIS: Zellen werden bei 37 °C in glatten Muskelzellmedien mit 2% fetalem Rinderserum angebaut.
    2. (Optional) Lassen Sie mehrere Stunden für die Einhaltung über Nacht. Fügen Sie jedem Brunnen 20 L Resazurin-Bestände hinzu. Inkubieren bei 37 °C für 3 h. Lesen Sie das Fluoreszenzsignal in einem Plattenleser (560ex, 594em). Ersetzen Sie Medien durch frisches DMEM.
      HINWEIS: Dieser Schritt ist optional. Resazurin wird verwendet, um Zellzahlen zu normalisieren und für eine gute Variabilität in der Beschichtung14zu berücksichtigen.
    3. Phosphat gepufferte Kochungskochin (PBS) oder Thrombozyten-abgeleiteter Wachstumsfaktor (PDGF) 30 ng/ml zu 3-6 Brunnen pro Behandlung zu Beginn der Kulturperiode hinzufügen und 72 h inkubieren.
    4. 5 mM EdU-Lager auf 1 mM verdünnen. Fügen Sie jedem Brunnen (Endkonzentration 20 m) für die letzten 24 h der 72-H-Kulturperiode 2 L hinzu. Fügen Sie EdU nicht zu einem Satz von Replikationen hinzu. Diese Brunnen werden verwendet, um Die Fluoreszenz/Lumineszenz im Hintergrund zu bestimmen.
      HINWEIS: Die Dauer der Kultur und Beschriftung mit EdU ist für glatte Muskelzellen optimiert, muss jedoch möglicherweise pro Zelltyp geändert werden.
  3. Fixzellen in Paraformaldehyd (PFA).
    1. Entfernen Sie die Medien und fügen Sie 150 l 4% PFA (in PBS) pro Brunnen für 10 min bei Raumtemperatur hinzu.
    2. Entfernen Sie PFA und fügen Sie 150 l Polyethylenglykol tert-Octylphenylether (TX-100) (in Wasser) pro Brunnen für 30 min bei Raumtemperatur hinzu.
    3. Entfernen Sie TX-100, indem Sie dreimal mit PBS waschen.
      VORSICHT: PFA ist giftig, behandeln Sie mit Sorgfalt.
      HINWEIS: Das Protokoll kann hier angehalten werden. Feste Zellen können in PBS bei 4 °C gespeichert werden.
  4. Erkennen Sie integrierte EdU.
    1. Herstellung einer Etikettierlösung (10 ml pro 96 Wellplatte, mit inneren 60 Brunnen) kurz vor der Verwendung durch Zugabe von Reagenzien aus Lagerlösungen in der folgenden Reihenfolge: THPTA 20 l, CuSO4 20 l, Cy3 picolyl Azid 5 l, Na Ascorbat 100 l zu PBS für ein Gesamtvolumen von 10 ml.
    2. Entfernen Sie PBS aus Brunnen und fügen Sie jedem Bohrgut 150 L Etikettierlösung hinzu. 30 min bei 37 °C inkubieren. Um alle Kerne zu erkennen, fügen Sie jedem Brunnen 4,6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) hinzu. Lesen Sie auf einem Fluoreszenzplattenleser (Cy3 550ex, 570em; DAPI 350ex, 470em) oder Bild auf einem Mikroskop.
      HINWEIS: Das Protokoll kann hier angehalten werden. Feste und gebeizte Zellen können in PBS bei 4 °C gelagert und zu einem späteren Zeitpunkt abgebildet werden.

2. Nachweis von EdU mittels Lumineszenz

  1. Vollständige Abschnitte 1.1–1.3.
  2. Bereiten Sie Tris-gepufferte Salin mit 0,1% Polysorbat 20 (TBST) vor.
  3. Blockieren Sie Brunnen.
    1. Fügen Sie jedem Brunnen 150 l Blockierpuffer (Materialtabelle) hinzu und brüten 90 min bei Raumtemperatur.
    2. Entfernen Sie den Sperrpuffer und waschen Sie dreimal mit 200 L PBS.
  4. Erkennen Sie integrierte EdU.
    1. Machen Sie Etikettierlösung, wie in Schritt 1.4.1 angegeben, und ersetzen Sie Biotin picolyl Azid durch Cy3 Picolyl-Azid.
    2. Waschen Sie die Brunnen fünfmal mit 200 l TBST, mit Schütteln, 3 min pro Wäsche.
    3. Endogene Peroxidasen mit 150 l von 0,3%H2O2 für 20 min bei Raumtemperatur ablöschen.
    4. H2O2 entfernen und fünfmal mit 200 L TBST waschen, mit Schütteln 3 min pro Wäsche.
    5. Verdünnung der Streptavidin-Meerrettichperoxidase (SA-HRP; 1:200) in TBST und fügen Sie jedem Brunnen 50 l hinzu. 1 h bei Raumtemperatur inkubieren.
    6. Waschen Sie fünfmal mit 200 l TBST, mit Schütteln, 3 min pro Wäsche.
    7. Fügen Sie jedem Brunnen 50 L chemilumineszierendes enzymgebundenes Immunsorbent-Assay (ELISA)-Substrat(Tabelle der Materialien)hinzu.
    8. Lesen Sie sofort in Plattenleser in der Lage, Lumineszenz zu erkennen.

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Representative Results

In Abbildung 2zeigen wir die Ergebnisse von drei verschiedenen Experimenten zur Messung der Verbreitung von VSMC als Reaktion auf PDGF. Nach dem Anbau der Zellen in Medien, die für SMCs formuliert wurden, führten wir das Experiment in serumfreiem DMEM durch, um mögliche Auswirkungen von Serum oder Wachstumsfaktoren auf die Proliferation zu eliminieren. In Abbildung 2A vergleichen wir die Ergebnisse aus demselben Experiment mit einer fluoreszierenden vs. lumineszierenden Auslesung. Um diese Platten zu lesen, verwendeten wir einen Multimode-Mikroplattenleser, der Absorption, Fluoreszenz und Lumineszenz lesen kann (siehe Tabelle der Materialien).

Mit dem Plattenleser im Scanning-Gut-Modus werden fluoreszierende Messwerte über den gesamten Brunnen gemittelt. Dieser Modus lindert mögliche Ungenauigkeiten aufgrund von Unterschieden zwischen der Mitte und den Kanten des Brunnens. Wenn jedoch nur sehr wenige Kerne positiv sind, unterschätzt das Lesen auf diese Weise wahrscheinlich die "Anzahl" positiver Zellen, wenn nur wenige positiv sind. Zahl, mit dieser Auslesung, bedeutet Fluoreszenz relativ zu der eines anderen Brunnens, und nicht genaue Zellzahlen. Darüber hinaus, wenn es eine Faser oder einen Klumpen von abgestorbenen Zellen, die Fluoreszenz nimmt, wird dies in den Bereich Scan enthalten sein. Der Vorteil der Verwendung des Plattenlesers ist jedoch die Zeit. Während das Lesen im Scanmodus 15 bis 20 Sekunden pro Brunnen dauert, ist es automatisiert, im Gegensatz zu der persönlichen zeitintensiven Methode, Bilder zu machen und sie mit Bildverarbeitungssoftware zu analysieren.

Um mögliche Unterschätzungen aus der oben genannten Methode zu korrigieren, haben wir den Fluoreszenzscan in eine homogene, flüssige Auslesung umgewandelt, bei der Zellen, die EdU aufnehmen, mit einem Azid-Biotin-Moiety nachgewiesen werden, der wiederum mit Streptavidin-Meerrettichperoxidase nachgewiesen wird. (siehe Abbildung 1). Die Menge an Meerrettichperoxidase wird dann mit einem Standardsubstrat quantifiziert, das für ELISA formatiert ist. Der Vorteil dieser Technik ist eine homogenere Auslesung, und Abbildung 2A,B zeigt Beispiele für Experimente, bei denen diese Methode angewendet wurde. Darüber hinaus kann die Platte in Sekunden abgelesen werden. Diese Methode hat jedoch Nachteile. Erstens ist der Hintergrund mit dieser Methode höher als bei der Fluoreszenz. Um den Hintergrund zu verringern, haben wir einen Blockierschritt und mehrere Wäranler eingebaut. Als Spiegelbild dieses Hintergrunds sind negative Kontrollen (unbehandelte Zellen) tendenziell höher, und die Zunahme der Proliferation ist geringer. Zweitens, wie bei der Fluoreszenzanzeige, werden alle Fasern oder abgestorbenen Zellen, die die Nachweisreagenzien aufnehmen, zur Gesamtlumineszenz hinzufügen.

In dem Versuch, die Variabilität in den oben genannten Experimenten zu verringern, normalisierten wir unsere Ergebnisse auf die anfängliche Zellanzahl. Für Proliferationstests muss die Normalisierung an lebenden Zellen zu Beginn des Assays erfolgen, bevor sich die Zellen teilen. Darüber hinaus kann der Test die Zellfunktion oder die Einbindung von EdU nicht beeinflussen. Angesichts dieser Einschränkungen haben wir uns dafür entschieden, den Stoffwechsel als Reflektion der Zellzahl über Resazurin14zu verwenden. Die Ergebnisse mit und ohne Normalisierung sind in Abbildung 2Bdargestellt. In einem separaten Satz von Experimenten stellten wir jedoch fest, dass diese Methode nicht empfindlich genug ist, um kleine Unterschiede in den Zellzahlen zu erkennen. Darüber hinaus führt jeder Fehler in dieser Auslesung zu mehr Fehlern im gesamten Experiment. Aus diesen Gründen haben wir uns dafür entschieden, die Zellen so gleichmäßig wie möglich zu veranschlagen und keinen Normalisierungsschritt durchzuführen.

Um sicher zu sein, dass wir die genauesten Ergebnisse erzielten, kehrten wir zu fluoreszierender Färbung (Abschnitt 1) und zählenden Zellen mit einem invertierten Fluoreszenzmikroskop zurück. Der Vorteil dieser Methode ist, dass man die positiven Zellen physisch sehen und zählen kann, um die größte Genauigkeit zu gewährleisten (Abbildung 3). Fluoreszierende Trümmer können von der Zählung ausgeschlossen werden. Hintergrundzählungen ohne EdU sind 0, da es keine sichtbare Fluoreszenz und daher keinen Hintergrund zum Subtrahieren gibt. Der Hauptnachteil dieser Methode ist die Zeit. Um Kerne in Zellen zu zählen, die in einer 96-Well-Platte plattiert sind, machen wir 3 Bilder pro Brunnen sowohl von EdU-positiven Zellen als auch von Gesamtzellen (DAPI), die 6 Bilder pro Brunnen erfordern. Wir fotografieren vertikal vom Mittelteil des oberen bis zum unteren Rand des Brunnens und achten darauf, Zellen nicht zweimal zu überlappen und zu zählen. Das Zählen von Gesamtzellen gibt uns eine zweite Datenmenge, die unsere Proliferationsergebnisse bestätigt. Angesichts der relativ langsamen Verdoppelungszeit von VSMC (36-48 h) ist der Faltenanstieg der mit PDGF im Vergleich zu Kontrollen stimulierten Gesamtzellen jedoch viel geringer als die Falterhöhung der EdU-positiven Zellen, weshalb wir die Einbeziehung von EdU messen (Abbildung 2C).

Die effizienteste und genaueste Methode zur Zählung von EdU-positiven und Gesamtzellen ist die Verwendung eines bildgebenden Plattenlesers. Diese Methode kombiniert die Genauigkeit der Zählung mit der Geschwindigkeit der Automatisierung. Der Hauptnachteil ist, dass dieses Gerät nicht in jeder Institution verfügbar ist. Beim Vergleich von automatisierten und manuellen Anzahlen war die positive manuelle Anzahl der EdU im Wesentlichen identisch mit der automatisierten Anzahl(Abbildung 2C, links), ebenso wie die Gesamtzahl der nicht stimulierten Zählungen(Abbildung 2C, rechts). Die manuelle Anzahl war jedoch niedriger als die automatisierte Anzahl in insgesamt PDGF-stimulierten Zellen. Dieser Unterschied bezieht sich wahrscheinlich auf Zellwachstumsmuster. Da die Zellen in der Mitte des Brunnens zu wachsen neigen, mit kleineren Zahlen waren die automatisierten und manuellen Zählungen fast identisch. Bei höheren Zahlen gab es jedoch wahrscheinlich mehr Zellen an den Rändern und die manuellen Zählungen, die keine Zellen an der Peripherie des Brunnens erfassten, waren weniger genau.

Figure 1
Abbildung 1: Übersicht über den EdU-Nachweis durch Fluoreszenz oder Lumineszenz.
VSMC oder andere anhimante Zellen werden unter Bedingungen von Interesse behandelt. EdU wird für die letzten 24 h der Kulturperiode hinzugefügt und in die DNA der teilenden Zellen integriert. Incorporated EdU wird dann mit Fluoreszenz (Protokollabschnitt 1) oder Lumineszenz (Protokollabschnitt 2) nachgewiesen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Messung der Proliferation mit verschiedenen Auslesungen unter Verwendung von EdU und Klickchemie.
(A) VSMCs wurden in Gegenwart oder Abwesenheit von PDGF kultiviert. EdU wurde die letzten 24 h kultur hinzugefügt, und die Einarbeitung wurde entweder durch Fluoreszenz (Protokollabschnitt 1) oder Lumineszenz (Protokollabschnitt 2) nachgewiesen. (B) VSMCs wurden wie in Panel A beschrieben behandelt, und die Einbeziehung von EdU wurde durch Lumineszenz gemessen. Die Ergebnisse wurden auf die anfängliche Nzellenzahl mit Resazurin-Lebensfähigkeitstest normalisiert. (C) VSMCs wurden wie in Panel A behandelt, und die Einbeziehung von EdU wurde durch Fluoreszenz gemessen. EdU-positive Zellen wurden automatisch gezählt, mit einem bildgebenden Plattenleser oder manuell durch Bildgebung und dann zählen mit Bildgebungssoftware. Gezeigte Ergebnisse sind die durchschnittliche Standardabweichung von 3–6 Replikationen pro Behandlung.

Figure 3
Abbildung 3: Visualisierung von EdU-positiven Zellen nach Demperonfluoreszenzprotokoll.
VSMC wurden wie in Abbildung 2beschrieben behandelt, und die integrierte EdU wurde mit Fluoreszenz nachgewiesen (Protokollabschnitt 1). Jedes Bild ist ein einziger Brunnen einer 96-Well-Platte. Die Gesamtkerne werden blau (DAPI) und die EdU-positiven Kerne sind grün. Maßstabsleiste = 50 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Discussion

Die Einbeziehung von EdU ist eine einfache, einfache Möglichkeit, die Zellproliferation zu messen; es ist besonders nützlich für anhängliche Zellen13. Unser Protokoll verwendet glatte Muskelzellen, aber es ist anwendbar auf jede anhängliche Zelle (epitheliale, endotheliale, etc.). Obwohl das Protokoll nicht kompliziert ist, ist der einzige entscheidende Schritt die Herstellung der Etikettierungslösung – die Zutaten müssen in der angegebenen Reihenfolge hinzugefügt werden. Darüber hinaus, wie chemiluminescent Western Blots, wenn die Lumineszenz auslesen die Platte sofort gelesen werden.

Mehrere Teile des Protokolls können bei Bedarf geändert oder optimiert werden. Ein Teil ist die Dauer der Inkubation mit EdU. Da unser Ziel war, so viele sich vermehrende Zellen wie möglich zu erkennen, haben wir EdU für volle 24 h vor der Fixierung und Färbung hinzugefügt. Dieser Zeitpunkt misst jedoch wahrscheinlich Zellen sowohl in S- als auch in G2/M-Phasen. Um nur Zellen in der S-Phase zu kennzeichnen, raten Cecchini et al. darauf hin, dass selbst langsam teilende Zellen mit EdU nicht länger als 6 Stundeninkubiertwerden 7 . Ein weiterer Teil des Protokolls, der optimiert werden kann, ist die Menge an Chelat. Alkyn-Azid-Reaktionen erfordern einen Kupferkatalysator (CuSO4). THPTA ist ein Kupferchelator, der Kupfer im notwendigen Oxidationszustand hält. Das Verhältnis von Chelator zu Kupfer kann variiert werden, um die Alkyn-Azid-Bindung zu erhöhen. Wir beobachten helle Färbung mit einem Chelator:Kupfer-Verhältnis von 2:1, im Zusammenhang mit der Verwendung von picolyl Azid. Die picolyl Moiety fügt chelatisierende Aktivität, die die Konzentration von Kupfer benötigt verringert und erhöht die Effizienz der Reaktion15. Chelator:Kupfer-Verhältnisse können erhöht werden, in der Regel bis zu 5:1, um die Bedürfnisse des Prüfers zu optimieren. Ein besserer Chelator, 2-[4-(-bis[(1-tert-butyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]methyl)-1H-1,2,3-triazol-1-yl]essigsäure (BTTAA), ist jetzt im Handel erhältlich16. Dieser Chelator war nicht kommerziell verfügbar, als wir dieses Protokoll zum ersten Mal abgeleitet haben. Schließlich können, obwohl wir Paraformaldehyd als Fixierung in diesem Protokoll verwenden, Zellen mit Methanol fixiert werden, was auch den Permeabilisierungsschritt vermidert. Die Fixierung mit Methanol kann hilfreich sein, wenn man immunfluoreszierende Färbung enterblösenspezifischer zellulärer Proteine mit der Einbeziehung von EdU kombinieren möchte.

Ein Nachteil dieser Methode ist die potenzielle Zytotoxizität von EdU, insbesondere bei der kontinuierlichen Kennzeichnung mit EdU für Tage im Gegensatz zu einem Pulsetikett von Stunden. Je nach verwendeter Zelle, EdU wurde gefunden, um Zellzyklus Arrest oder sogar Apoptoseverursachen 17. Diese Toxizität wird angenommen, dass aufgrund einer fehlerhaften DNA-Replikation durch die Zugabe von künstlichen Nukleosiden18. Studien haben gezeigt, dass diese Toxizität zelllinienabhängig und konzentrationsabhängigist 17. Wir haben in unseren Studien keine Probleme mit der Toxizität beobachtet.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Messung der Proliferation über EdU und Klickchemie mehrere Vorteile gegenüber anderen gängigen Methoden wie BrdU oder 3H-Thymidin-Einarbeitung hat. Dazu gehören die Vermeidung von Radioaktivität, hohe Spezifität mit niedrigem Hintergrund und keine Notwendigkeit für harte Denaturierungsschritte. Einmal etabliert, Ist Die Klickchemie sehr vielseitig und kann leicht für die metabolische Kennzeichnung von RNA, Protein, Fettsäuren und Kohlenhydraten modifiziert werden.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Acknowledgments

Wir danken Katie Carroll für die technische Unterstützung. Wir danken auch Dr. David Cool und dem Proteomics Analysis Laboratory für die Anleitung und Bereitstellung des Cytation Imaging Plate Readers. Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium der Wright State Foundation (an L.E.W.) unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5-Ethynyl-2'-deoxyuridine Carbosynth NE08701
biotin picolyl azide Click Chemistry Tools 1167-5
CuSO4 Fisher Scientific C1297-100G
Cy3 picolyl azide Click Chemistry Tools 1178-1
Cytation Plate Reader Biotek
EVOS Microscope Thermo Fisher Scientific
Hydrogen peroxide solution Sigma-Aldrich 216763
Na ascorbate Sigma-Aldrich 11140-250G
NucBlue Fixed Cell Stain Ready Probes Invitrogen R37606 DAPI nuclear stain
Odyssey Blocking Buffer Li-Cor 927-40000 blocking buffer
Paraformaldehyde Electron Microscopy Services 15710
PBS Fisher Scientific SH3002802
Sodium Chloride Sigma Life Science S3014-5kg
Streptavidin Horseradish Peroxidase Conjugate Life Technologies S911
Super Signal ELISA Femto Thermo Scientific PI137075 ELISA substrate
Synergy Plate Reader Biotek
THPTA Click Chemistry Tools 1010-100
Tris Hydroxymethyl Aminomethane Hydrochloride (Tris-HCl) Fisher Scientific BP153-500
Triton X 100 Bio-Rad 1610407
Tween 20 Fisher Scientific BP337-100

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References

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Biologie Ausgabe 152 Klickchemie Proliferation vaskuläre glatte Muskelzellen anhängende Zellen Fluoreszenz EdU
Messung der Proliferation von vaskulären glatten Muskelzellen mit Hilfe der Klickchemie
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