Summary
La prolifération est une partie essentielle de la fonction cellulaire, et une lecture commune utilisée pour évaluer la toxicité potentielle de nouveaux médicaments. La mesure de la prolifération est donc un résultat fréquemment utilisé en biologie cellulaire. Nous présentons ici une méthode simple et polyvalente de mesure de la prolifération qui peut être utilisée dans les cellules adhérentes et non adhérentes.
Abstract
La capacité d'une cellule à proliférer fait partie intégrante de la fonction normale de la plupart des cellules, et la dysrégulation de la prolifération est au cœur de nombreux processus de la maladie. Pour ces raisons, la mesure de la prolifération est un outil courant utilisé pour évaluer la fonction cellulaire. La prolifération cellulaire peut être mesurée simplement par comptage; cependant, il s'agit d'un moyen indirect de mesurer la prolifération. Un moyen courant de détecter directement les cellules se préparant à se diviser est par l'incorporation d'analogues nucléosides étiquetés. Il s'agit notamment de la nucléoside radioactive analogique 3H-thymidine plus non-radioactifs analogues nucléoside tels que 5-bromo-2' deoxyuridine (BrdU) et 5-ethynyl-2-deoxyuridine (EdU). L'incorporation d'EdU est détectée par la chimie de clic, qui a plusieurs avantages par rapport à BrdU. Dans ce rapport, nous fournissons un protocole pour mesurer la prolifération par l'incorporation de l'UE. Ce protocole comprend des options pour diverses lectures, ainsi que les avantages et les inconvénients de chacun. Nous discutons également des endroits où le protocole peut être optimisé ou modifié pour répondre aux besoins spécifiques de l'expérience planifiée. Enfin, nous touchons à la façon dont ce protocole de base peut être modifié pour mesurer d'autres métabolites cellulaires.
Introduction
La prolifération est une partie essentielle de la fonction cellulaire1,2. Le contrôle de la prolifération influence les processus normaux tels que le développement, et les processus pathologiques tels que le cancer et les maladies cardiovasculaires. La croissance hyperplastique des cellules musculaires lisses vasculaires, par exemple, est pensé pour être un précurseur de l'athérosclérose3. Les changements dans la prolifération cellulaire sont également utilisés pour évaluer la toxicité potentielle de nouveaux médicaments. Compte tenu de son impact généralisé, la mesure de la prolifération est un pilier de nombreux laboratoires de biologie cellulaire.
La prolifération cellulaire peut être mesurée en comptant simplement les cellules si la population cellulaire d'intérêt se divise assez rapidement. Pour les cellules à croissance plus lente, le nombre de cellules peut être moins sensible. La prolifération est souvent mesurée par l'incorporation d'analogues nucléodés étiquetés. Bien que l'étalon-or soit l'incorporation de 3H-thymidine, de nombreux laboratoires s'éloignent de cette méthode étant donné la disponibilité de nouvelles alternatives non radioactives. Il s'agit notamment de colorants fluorescents cytoplasmiques, la détection des protéines associées au cycle cellulaire, et l'incorporation d'analogues nucléosides non radioactifs tels que la désoxyuridine 5-bromo-2' (BrdU) et 5-ethynyl-2-deoxyuridine (EdU)4.
Les colorants cytoplasmiques, tels que la carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE), détectent la prolifération parce que l'intensité du colorant diminue à chaque fois que la cellule divise5. Cette technique est couramment utilisée dans la cytométrie de flux pour les cellules non adhérentes. Il n'a pas été utilisé beaucoup pour les cellules adhérentes, mais avec la nouvelle génération de lecteurs de plaques d'imagerie cela peut changer. La détection des protéines associées au cycle cellulaire par des techniques à base d'anticorps (cytométrie de flux, immunohistochimie, etc.) est souvent utilisée pour les tissus ou les cellules non adhérentes. Ces cellules/tissus doivent être fixés et perméabilisés avant la coloration. Les analogues nucléoside brdU et EdU sont similaires en approche à 3H-thymidine, mais sans les inconvénients de la radioactivité. L'incorporation de BrdU est détectée par des anticorps anti-BrdU, et donc les cellules doivent être fixées et perméabilisées avant la coloration. En outre, les cellules doivent être traitées avec DNase pour exposer l'épitope BrdU.
L'incorporation d'EdU est détectée par la chimie de clic, dans laquelle les groupes d'alkyne et d'azide « cliquent » ensemble en présence du cuivre catalytique. L'un ou l'autre groupe peut servir de molécule biosynthétiquement incorporée ou molécule de détection4. Les analogues nucléosidedisponibles disponibles dans le commerce ont le groupe d'alkyne attaché. Pour les essais de prolifération, par conséquent, l'analogue nucléoside fonctionnalisé d'alkyne est détecté par un azide conjugué à un colorant fluorescent ou à un autre marqueur. L'incorporation d'EdU présente plusieurs avantages par rapport à BrdU. Tout d'abord, parce que les groupes d'alkyne et d'azide ne se trouvent pas dans les cellules de mammifères, cette interaction est très spécifique avec un fond bas6. Parce que les deux groupes sont petits, les cellules n'ont pas besoin de subir la dénaturation de l'ADN pour exposer l'analogique nucléoside comme requis pour BrdU7. Enfin, la chimie de clic est très polyvalente, et peut être employée pour l'étiquetage métabolique de l'ADN, de l'ARN, des protéines, des acides gras, et des hydrates de carbone8,9,10,11. Si la cible d'intérêt étiquetée métaboliquement se trouve à la surface des cellules, les cellules vivantes peuvent être étiquetées12. En outre, les cellules peuvent être traitées plus en détail pour la coloration immunofluorescente avec des anticorps.
Le protocole suivant décrit l'utilisation de l'incorporation D'EdU et de la chimie des clics pour mesurer la prolifération dans les cellules musculaires lisses vasculaires humaines (Figure 1). Nous montrons trois façons différentes d'incorporation d'EdU peut être mesurée, les résultats représentatifs de chacun, et leurs avantages et inconvénients. La mesure de la prolifération par l'intermédiaire de la chimie de clic est particulièrement utile pour les cellules adhérentes et de plus en plus lentes. En outre, la morphologie de la cellule est bien entretenue et la coloration à base d'anticorps peut également être effectuée.
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Protocol
1. Détection de l'EdU à l'aide d'une étiquette fluorescente
- Solutions boursières
- Préparer une solution de 5 mM EdU en ajoutant 12,5 mg d'EdU à 10 ml de H2O double distillé.
- Préparer les composants de la solution d'étiquetage : 200 mM tris(3-hydroxypropyltriazolylmethyl)amine (THPTA) (100 mg en 1,15 mL H2O), 100 mM CuSO4 (15,95 mg en 1 mL H2O; faire frais), 10 mM Cy3 picolyl-azide (1 mg en 95,3 m L2L , stocké dans 5 aliquots ll à -20 oC) et 1 M d'ascorbate de sodium (200 mg dans 1 ml H2O; faire frais).
- Préparer la solution de stock de résine à une concentration de 0,15 mg/mL. Filtrer la stérilisation et entreposer 1 ml d'aliquots à 4 oC.
REMARQUE : L'azide de Picolyl est disponible conjugué à plusieurs flueurs différents, biotine, et peroxidase de raifort (HRP).
- Étiqueter les cellules musculaires vasculaires lisses (VSMC) avec EdU.
REMARQUE : Les VSMC humains ont été isolés des artères iliaques par la croissance des morceaux explantés de tissu. Lorsqu'elles sont cultivées dans des médias sans sérum avec de l'insuline, de la transferrine, du sélénium, ces cellules expriment des marqueurs VSMC smooth, une chaîne musculaire lisse de myosine (SM-MHC) et sMC'actin 13.- Plaquedes musculaires vasculaires lisses à 2 x 104/mL dans le milieu modifié de l'aigle de Dulbecco (DMEM) dans une plaque de puits de 96.
REMARQUE : Les cellules sont cultivées à 37 oC dans des cellules musculaires lisses avec 2 % de sérum bovin fœtal. - (Facultatif) Prévoyez plusieurs heures pour la nuit pour l'adhérence. Ajouter 20 l de resazurin à chaque puits. Incuber à 37 oC pendant 3 h. Lire le signal de fluorescence dans un lecteur de plaque (560ex, 594em). Remplacez les médias par du DMEM frais.
REMARQUE : Cette étape est facultative. La résazurine est utilisée pour normaliser le nombre de cellules et expliquer la variabilité du bien-à-puits dans le placage14. - Ajouter le phosphate tamponné salin (PBS) ou le facteur de croissance dérivé des plaquettes (PDGF) 30 ng/mL à 3-6 puits par traitement au début de la période de culture et incuber pendant 72 h.
- Diluer 5 mM EdU stock à 1 mm. Ajouter 2 ll à chaque puits (concentration finale de 20 m) pour les 24 dernières heures de la période de culture de 72 h. N'ajoutez pas D'EdU à un ensemble de répliques. Ces puits seront utilisés pour déterminer la fluorescence/luminescence de fond.
REMARQUE : La durée de la culture et de l'étiquetage avec EdU est optimisée pour les cellules musculaires lisses, mais peut-être besoin d'être modifiée par type de cellule.
- Plaquedes musculaires vasculaires lisses à 2 x 104/mL dans le milieu modifié de l'aigle de Dulbecco (DMEM) dans une plaque de puits de 96.
- Fixer les cellules dans le paraformaldéhyde (PFA).
- Retirer les supports et ajouter 150 'L de 4% DE PFA (en PBS) par puits pendant 10 min à température ambiante.
- Retirez l'éther pfA et ajoutez 150 l de 1 % de polyéthylène glycol tert-octylyl (TX-100) (dans l'eau) par puits pendant 30 min à température ambiante.
- Retirez le TX-100 en lavant trois fois avec du PBS.
CAUTION: PFA est toxique, manipuler avec soin.
REMARQUE: Le protocole peut être mis en pause ici. Les cellules fixes peuvent être stockées dans du PBS à 4 oC.
- Détecter EdU incorporé.
- Faire la solution d'étiquetage (10 ml par plaque de puits 96, à l'aide de 60 puits intérieurs) juste avant l'utilisation en ajoutant des réactifs à partir de solutions de stock dans l'ordre suivant : THPTA 20 L, CuSO4 20 'L, Cy3 picolyl azide 5 'L, Na ascorbate 100 'L à PBS pour un volume total de 10 mL.
- Retirez le PBS des puits et ajoutez 150 l de solution d'étiquetage à chaque puits. Incuber 30 min à 37 oC. Pour détecter tous les noyaux, ajoutez 4,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) à chaque puits. Lire sur un lecteur de plaque de fluorescence (Cy3 550ex, 570em; DAPI 350ex, 470em) ou image sur un microscope.
REMARQUE: Le protocole peut être mis en pause ici. Les cellules fixes et tachées peuvent être stockées dans du PBS à 4 oC et représentées ultérieurement.
2. Détection de l'EdU à l'aide de la luminescence
- Sections complètes 1.1-1.3.
- Préparer la saline tamponnée Tris avec 0,1 % de polysorbate 20 (TBST).
- Bloquer les puits.
- Ajouter 150 l de tampon de blocage (Table de Matériaux) à chaque puits et couver pendant 90 min à température ambiante.
- Supprimer le tampon de blocage et laver trois fois avec 200 L de PBS.
- Détecter EdU incorporé.
- Faire la solution d'étiquetage comme indiqué dans l'étape 1.4.1, en remplaçant la biotine picolyl azide pour Cy3 picolyl azide.
- Laver les puits cinq fois avec 200 L de TBST, en secouant, 3 min par lavage.
- Peroxidases endogènes avec 150 OL de 0,3 % H2O2 pendant 20 min à température ambiante.
- Retirer H2O2 et laver cinq fois avec 200 L de TBST, en secouant 3 min par lavage.
- Diluer la peroxidase streptavidin-raifort (SA-HRP; 1:200) en TBST et ajouter 50 L à chaque puits. Incuber 1 h à température ambiante.
- Laver cinq fois avec 200 L de TBST, en secouant, 3 min par lavage.
- Ajouter 50 lde de substrat immunosorbent lié à l'enzyme chemiluminescent (ELISA) substrat (Tableau des matériaux) à chaque puits.
- Lire immédiatement dans le lecteur de plaque capable de détecter la luminescence.
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Representative Results
Dans la figure 2, nous démontrons les résultats de trois expériences différentes mesurant la prolifération de VSMC en réponse au PDGF. Après avoir augmenté les cellules dans les médias formulés pour les SMC, nous avons effectué l'expérience dans le Srum dMEM libre, pour éliminer tous les effets potentiels du sérum ou des facteurs de croissance sur la prolifération. Dans la figure 2A, nous comparons les résultats, de la même expérience, à l'aide d'une lecture fluorescente vs luminescente. Pour lire ces plaques, nous avons utilisé un lecteur multimode microplate qui peut lire l'absorption, la fluorescence et la luminescence (voir Tableau des matériaux).
En utilisant le lecteur de plaque en mode puits de balayage, les lectures fluorescentes sont moyennes sur l'ensemble du puits. Ce mode atténue les inexactitudes potentielles dues aux différences entre le centre et les bords du puits. Cependant, si très peu de noyaux sont positifs, les résultats de lecture de cette façon sous-estiment probablement le «nombre» de cellules positives quand seulement quelques-uns sont positifs. Nombre, avec cette lecture, signifie fluorescence par rapport à celle d'un autre puits, et non pas les numéros de cellules exactes. En outre, s'il ya une fibre ou un amas de cellules mortes qui capte la fluorescence, ce sera inclus dans le balayage de la zone. Cependant, l'avantage d'utiliser le lecteur de plaque est le temps. Bien que la lecture en mode de numérisation prenne 15 à 20 secondes par puits, elle est automatisée par opposition à la méthode personnelle à forte intensité de temps de prendre des photos et de les analyser à l'aide d'un logiciel d'imagerie.
Pour corriger les sous-estimations potentielles de la méthode ci-dessus, nous avons converti le balayage fluorescent en une lecture homogène et liquide dans laquelle les cellules prenant EdU sont détectées avec un moiety azide-biotine, qui est à son tour détecté avec peroxidase streptavidin-horraie (voir Figure 1). La quantité de peroxidase de raifort est ensuite quantifiée à l'aide d'un substrat standard formaté pour ELISA. L'avantage de cette technique est une lecture plus homogène, et la figure 2A,B montre des exemples d'expériences où cette méthode a été utilisée. En outre, la plaque peut être lue en quelques secondes. Il ya des inconvénients à cette méthode, cependant. Tout d'abord, le fond avec cette méthode est plus élevé qu'avec la fluorescence. Pour diminuer l'arrière-plan, nous avons incorporé une étape de blocage et plusieurs lavages. Comme un reflet de ce fond, les contrôles négatifs (cellules non traitées) ont tendance à être plus élevés, et l'augmentation du pli de la prolifération est plus faible. Deuxièmement, comme avec la lecture de fluorescence, toutes les fibres ou les cellules mortes qui prennent les réactifs de détection ajoutera à la luminescence totale.
Dans une tentative de diminuer la variabilité dans les expériences ci-dessus, nous avons normalisé nos résultats aux comptes cellulaires initiaux. Pour les essais de prolifération, la normalisation doit être faite sur les cellules vivantes au début de l'analyse avant que les cellules se divisent. En outre, l'assay ne peut pas affecter la fonction cellulaire ou l'incorporation d'EdU. Compte tenu de ces contraintes, nous avons choisi d'utiliser le métabolisme comme reflet du nombre cellulaire via la résazurine14. Les résultats avec et sans normalisation sont affichés à la figure 2B. Cependant, dans un ensemble séparé d'expériences, nous avons constaté que cette méthode n'est pas assez sensible pour détecter de petites différences dans le nombre de cellules. En outre, toute erreur dans cette lecture introduit plus d'erreur dans l'ensemble de l'expérience. Pour ces raisons, nous avons choisi de prendre des soins extraordinaires pour plaquer les cellules aussi uniformément que possible, et de ne pas effectuer une étape de normalisation.
Pour être sûr que nous obnions les résultats les plus précis possibles, nous sommes revenus à la coloration fluorescente (section 1) et en comptant les cellules à l'aide d'un microscope à fluorescence inversée. L'avantage de cette méthode est que l'on peut physiquement voir et compter les cellules positives, assurant la plus grande précision (Figure 3). Tous les débris fluorescents peuvent être exclus du décompte. Les comptes de fond sans EdU sont 0 car il n'y a pas de fluorescence visible, et donc pas de fond pour soustraire. Le principal inconvénient de cette méthode est le temps. Pour compter les noyaux dans les cellules plaquées dans une plaque de puits de 96, nous prenons 3 photos par puits des deux cellules positives D'EdU et des cellules totales (DAPI), nécessitant 6 images par puits. Nous prenons des photos verticalement de la section médiane du haut vers le bas du puits, en prenant soin de ne pas se chevaucher et compter les cellules deux fois. Le comptage des cellules totales nous donne un deuxième élément de données qui confirme nos résultats de prolifération. Cependant, à la lumière du temps de doublement relativement lent de VSMC (36-48 h), l'augmentation du pli des cellules totales stimulées par les contrôles PDGF vs est beaucoup plus faible que l'augmentation du pli des cellules positives EdU, c'est pourquoi nous mesurons l'incorporation d'EdU (Figure 2C).
La façon la plus efficace et la plus précise de compter les cellules edU positives et totales est d'utiliser un lecteur de plaque d'imagerie. Cette méthode combine la précision du comptage avec la vitesse de l'automatisation. Le principal inconvénient est que cette pièce d'équipement n'est pas disponible dans toutes les institutions. En comparant les dénombrements automatisés par rapport aux comptes manuels, le nombre manuel positif d'EdU était essentiellement identique au nombre automatisé(figure 2C, à gauche), tout comme le nombre total de dénombrements non stimulés(figure 2C, droite). Cependant, le nombre manuel était inférieur au nombre automatisé dans les cellules pdg-stimulées totales. Cette différence est probablement liée aux modèles de croissance cellulaire. Parce que les cellules ont tendance à se développer dans le centre du puits, avec de plus petits nombres les comptes automatisés et manuels étaient presque identiques. Cependant, avec des nombres plus élevés il y avait probablement plus de cellules aux bords et les comptes manuels, qui n'ont pas capturé des cellules à la périphérie du puits, étaient moins précis.
Figure 1 : Aperçu de la détection de l'EdU par fluorescence ou luminescence.
VSMC ou d'autres cellules adhérentes sont traitées dans des conditions d'intérêt. EdU est ajouté pour les 24 dernières heures de la période de culture et incorporé dans l'ADN des cellules de division. L'EdU incorporé est ensuite détecté à l'aide de fluorescence (section protocole 1) ou de luminescence (section 2 du protocole). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Mesurer la prolifération à l'aide de différentes lectures à l'aide de l'incorporation d'EdU et de la chimie des clics.
(A) VSMCs ont été cultivés en présence ou en absence de PDGF. EdU a été ajouté les 24 derniers h de la culture, et l'incorporation a été détectée par fluorescence (section de protocole 1) ou luminescence (section de protocole 2). (B) Les VSMC ont été traités comme décrits dans le panneau A, et l'incorporation d'EdU a été mesurée par luminescence. Les résultats ont été normalisés aux comptes cellulaires initiaux utilisant l'analyse de viabilité de resazurin. (C) Les VSMC ont été traités comme dans le panneau A, et l'incorporation d'EdU a été mesurée par fluorescence. Les cellules positives EdU ont été comptées automatiquement, à l'aide d'un lecteur de plaque d'imagerie, ou manuellement par imagerie, puis en comptant à l'aide d'un logiciel d'imagerie. Les résultats présentés sont l'écart standard moyen de 3 à 6 répliques par traitement.
Figure 3 : Visualisation des cellules positives EdU suivant le protocole de fluorescence de clic.
LE VSMC a été traité tel que décrit à la figure 2, et l'EdU incorporé a été détecté à l'aide de la fluorescence (section 1 du protocole). Chaque image est un puits unique d'une plaque de puits 96. Les noyaux totaux sont représentés en bleu (DAPI) et les noyaux positifs EdU sont verts. Barre d'échelle de 50 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
L'incorporation d'EdU est un moyen simple et simple de mesurer la prolifération cellulaire; il est particulièrement utile pour les cellules adhérentes13. Notre protocole utilise des cellules musculaires lisses, mais il s'applique à toute cellule adhérente (épithéliale, endothéliale, etc.). Bien que le protocole ne soit pas compliqué, la seule étape critique consiste à faire la solution d'étiquetage — les ingrédients doivent être ajoutés dans l'ordre indiqué. En outre, comme les taches occidentales chemiluminescentes, si l'utilisation de la lecture de luminescence la plaque doit être lue immédiatement.
Plusieurs parties du protocole peuvent être modifiées ou optimisées au besoin. Une partie est la durée de l'incubation avec EdU. Parce que notre objectif était de détecter autant de cellules proliférantes que possible, nous avons ajouté EdU pour un plein 24 h avant la fixation et la coloration. Cependant, ce moment mesure probablement les cellules dans les phases S et G2/M. Pour étiqueter uniquement les cellules en phase S, Cecchini et coll. conseillent que même les cellules qui se divisent lentement soient incubées avec de l'EdU pendant au plus 6 heures7. Une autre partie du protocole qui peut être optimiséest est la quantité de chélateur. Les réactions à l'alkyne-azide nécessitent un catalyseur de cuivre (CuSO4). THPTA est un chélateur de cuivre qui maintient le cuivre dans l'état d'oxydation nécessaire. Le rapport chélateur au cuivre peut être varié, pour augmenter la liaison alkyne-azide. Nous observons la coloration lumineuse avec un rapport chélateur/cuivre de 2:1, dans le contexte d'utiliser également picolyl azide. Le picolyl moiety ajoute une activité de chélage qui diminue la concentration de cuivre nécessaire et augmente l'efficacité de la réaction15. Chelator : Les ratios de cuivre peuvent être augmentés, habituellement jusqu'à 5:1, pour optimiser les besoins de l'enquêteur. Un meilleur chélateur, 2-[4-(-bis[(1-tert-butyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amino-methyl)-1H-1,2,3-triazol-1-yl]acetic acid (BTTAA), est maintenant disponible dans le commerce16. Ce chélateur n'était pas disponible dans le commerce lorsque nous avons d'abord dérivé ce protocole. Enfin, bien que nous utilisions le paraformaldehyde comme fixatif dans ce protocole, les cellules peuvent être fixées avec du méthanol, qui évite également l'étape de perméabilisation. Fixation avec du méthanol peut être utile si l'on veut combiner la coloration immunofluorescente de protéines cellulaires spécifiques avec l'incorporation d'EdU.
Un inconvénient de cette méthode est la cytotoxicité potentielle de l'EdU, en particulier lors de l'étiquetage continu avec EdU pendant des jours par opposition à une étiquette de pouls d'heures. Selon les cellules utilisées, EdU a été trouvé pour provoquer l'arrêt du cycle cellulaire ou même l'apoptose17. Cette toxicité est vraisemblablement due à la réplication défectueuse de l'ADN de l'ajout de nucléosides artificiels18. Des études ont montré que cette toxicité dépendait de la lignée cellulaire et de la concentration17. Nous n'avons observé aucun problème de toxicité dans nos études.
En résumé, la mesure de la prolifération via EdU et la chimie des clics présente plusieurs avantages par rapport à d'autres méthodes couramment utilisées telles que BrdU ou 3H-thymidine incorporation. Il s'agit notamment d'éviter la radioactivité, une grande spécificité avec un faible fond, et pas besoin de mesures de dénaturation sévères. Une fois établie, la chimie de clic est fortement polyvalente, et peut être facilement modifiée pour l'étiquetage métabolique de l'ARN, des protéines, des acides gras, et des hydrates de carbone.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Nous remercions Katie Carroll pour son assistance technique. Nous remercions également le Dr David Cool et le Laboratoire d'analyse de la protéomique pour l'instruction et la fourniture du lecteur de plaques d'imagerie Cytation. Ce travail a été soutenu par une subvention de la Wright State Foundation (à L.E.W.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine | Carbosynth | NE08701 | |
| biotin picolyl azide | Click Chemistry Tools | 1167-5 | |
| CuSO4 | Fisher Scientific | C1297-100G | |
| Cy3 picolyl azide | Click Chemistry Tools | 1178-1 | |
| Cytation Plate Reader | Biotek | ||
| EVOS Microscope | Thermo Fisher Scientific | ||
| Hydrogen peroxide solution | Sigma-Aldrich | 216763 | |
| Na ascorbate | Sigma-Aldrich | 11140-250G | |
| NucBlue Fixed Cell Stain Ready Probes | Invitrogen | R37606 | DAPI nuclear stain |
| Odyssey Blocking Buffer | Li-Cor | 927-40000 | blocking buffer |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Services | 15710 | |
| PBS | Fisher Scientific | SH3002802 | |
| Sodium Chloride | Sigma Life Science | S3014-5kg | |
| Streptavidin Horseradish Peroxidase Conjugate | Life Technologies | S911 | |
| Super Signal ELISA Femto | Thermo Scientific | PI137075 | ELISA substrate |
| Synergy Plate Reader | Biotek | ||
| THPTA | Click Chemistry Tools | 1010-100 | |
| Tris Hydroxymethyl Aminomethane Hydrochloride (Tris-HCl) | Fisher Scientific | BP153-500 | |
| Triton X 100 | Bio-Rad | 1610407 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-100 |
References
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