Summary
증식은 세포 기능의 중요한 부분이며, 신약의 잠재적 독성을 평가하는 데 사용되는 일반적인 판독값입니다. 따라서 증식 측정은 세포 생물학에서 자주 사용되는 분석입니다. 여기에서 우리는 부착 및 비 부착 세포에서 사용될 수 있는 증식을 측정하는 간단하고 다양한 방법을 제시합니다.
Abstract
증식하는 세포의 능력은 대부분의 세포의 정상적인 기능에 필수적이며, 증식의 dysregulation은 많은 질병 과정의 핵심입니다. 이러한 이유로, 증식 측정은 세포 기능을 평가하는 데 사용되는 일반적인 도구입니다. 세포 증식은 계수만으로 측정할 수 있습니다. 그러나 이것은 확산을 측정하는 간접적인 수단입니다. 분할을 준비하는 세포를 직접 검출하는 한 가지 일반적인 방법은 표지된 뉴클레오시드 유사체의 통합입니다. 이들은 방사성 뉴클레오시드 아날로그 3H-티미딘 플러스 5-브로모-2' deoxyuridine (BrdU) 및 5-에티닐-2′-데옥시우리딘 (EdU)와 같은 비방사성 뉴클레오시드 유사체를 포함한다. EdU의 통합은 BrdU에 비해 몇 가지 장점이 클릭 화학에 의해 감지됩니다. 이 보고서에서는 EdU의 통합에 의한 확산을 측정하기 위한 프로토콜을 제공합니다. 이 프로토콜에는 각각의 장점과 단점과 함께 다양한 판독값에 대한 옵션이 포함되어 있습니다. 또한 계획된 실험의 특정 요구 사항을 충족하기 위해 프로토콜을 최적화하거나 변경할 수 있는 위치에 대해서도 설명합니다. 마지막으로, 우리는 이 기본적인 프로토콜이 그밖 세포 대사 산물을 측정하기 위해 수정될 수 있는 쪽에 접촉합니다.
Introduction
증식은 세포 기능1,2의중요한 부분입니다. 증식의 통제는 발달과 같은 일반적인 프로세스, 암과 심장 혈관 질병과 같은 병리학 적인 프로세스에 영향을 미칩니다. 혈관 평활근 세포의 과소 플라스틱 성장은 예를 들어, 죽상 동맥 경화증의 전구체로 생각된다3. 세포 증식의 변화는 또한 새로운 약물의 잠재적인 독성을 평가 하는 데 사용 됩니다. 그것의 광범위 한 영향을 감안할 때, 증식 측정은 많은 세포 생물학 기반 실험실의 주류.
관심있는 세포 인구가 상당히 급속하게 분할하는 경우에 세포 증식은 단순히 세포를 계수해서 측정될 수 있습니다. 느린 성장 세포의 경우 세포 수가 덜 민감할 수 있습니다. 증식은 종종 표지된 뉴클레오시드 유사체의 혼입에 의해 측정됩니다. 금 표준은 3H-티미딘 통합이지만, 많은 실험실은 새로운 비 방사성 대안의 가용성을 감안할 때이 방법에서 벗어나고 있다. 이들은 세포질 형광 염료, 세포 주기 관련 단백질의 검출, 및 5-브로모-2' deoxyuridine (BrdU) 및 5-에티닐-2′-데옥시우리딘 (EdU)와 같은 비 방사성 뉴클레오시드 유사체의 혼입을 포함한다4.
카르복시플루아세진과 같은 세포질 염료는 설치니미딜 에스테르(CFSE)를 이아세테이트하며, 세포가 분열될 때마다 염료의 강도가 반으로 줄어들기 때문에 증식을감지한다5. 이 기술은 일반적으로 비 부착 세포에 대한 유세포 분석에서 사용된다. 그것은 부착 된 세포에 많이 사용되지 않았지만 새로운 세대의 이미징 플레이트 판독기와 함께 이 변경 될 수 있습니다. 항체 기반 기술(유세포 분석, 면역조직화학 등)을 통한 세포 주기 관련 단백질의 검출은 종종 조직 또는 비부착 세포에 사용된다. 이 세포/조직은 염색하기 전에 고쳐지고 투과되어야 합니다. 뉴클레오시드 유사체 BrdU 및 EdU는 3H-티미딘에 대한 접근법에서 유사하지만 방사능의 불편함없이. BrdU의 편입은 반대로 BrdU 항체에 의해 검출되고, 그러므로 세포는 염색의 앞에 고정되고 투과되어야 합니다. 또한, 세포는 BrdU 에피토프를 노출시키기 위해 DNase로 처리되어야 한다.
EdU의 통합은 클릭 화학에 의해 감지되며, 알키네와 아지드 그룹은 촉매 구리가있는 경우 함께 "클릭"합니다. 어느 그룹은 생합성 으로 통합된 분자 또는 검출 분자4로서작용할 수 있다. 시판되는 뉴클레오시드 유사체는 알키네 그룹이 부착되어 있다. 증식 검문, 따라서, 알키네 기능화된 뉴클레오시드 유사체는 형광 염료 또는 다른 마커에 공액화된 아지드에 의해 검출된다. EdU의 통합은 BrdU에 비해 몇 가지 장점이 있습니다. 첫째, 알키네 및 아지드 기는 포유류 세포에서 발견되지 않기 때문에, 이러한 상호작용은 낮은 배경6과매우 특이적이다. 두 그룹 모두 작기 때문에, 세포는 BrdU7에필요한 대로 뉴클레오시드 아날로그를 노출하기 위해 DNA 변성 수술을 받을 필요가 없다. 마지막으로, 클릭 화학은 매우 다재다능하며 DNA, RNA, 단백질, 지방산 및 탄수화물8,9,10,11의대사 라벨링에 사용할 수 있습니다. 관심 있는 대사 표지된 표적이 세포 표면에 있는 경우에, 살아있는 세포는12표지될수 있다. 또한, 세포는 항체로 면역형광 염색을 위해 추가로 처리될 수 있다.
다음 프로토콜은 인간 혈관 평활근 세포에서 증식을 측정하기 위해 EdU 혼입 및 클릭 화학의 사용을설명한다(도 1). 우리는 EdU의 통합을 측정 할 수있는 세 가지 방법, 각각의 대표 결과, 그리고 장점과 단점을 보여줍니다. 클릭 화학을 통한 증식 측정은 부착성, 느린 성장 세포에 특히 유용합니다. 또한, 세포의 형태는 잘 유지되고 항체 계 염색도 수행될 수 있다.
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Protocol
1. 형광 라벨을 사용하여 EdU의 검출
- 재고 솔루션
- 이중 증류H2O의 10 mL에 12.5 mg의 EdU를 추가하여 5 mM EdU 재고 솔루션을 준비합니다.
- 라벨 링 솔루션 구성 요소를 준비: 200 mM 트리스 (3-하이드록시 프로필리아졸라메틸) 아민 (THPTA) (1.15 mL H2O에서 100 mg), 100 mM CuSO4 (15.95 mg 1mL H2O; 신선한만들기), 10 mM Cy3 피콜릴-아지드 (10 mM Cy3 피콜릴-아지드 3m , -20 °C에서 5 μL aliquots에 저장하고, 1 M 나트륨 아스코르브산염 (1 mL H2O에서 200 mg; 신선하게 만들다).
- 0.15 mg/mL의 농도로 resazurin 스톡 솔루션을 준비합니다. 필터 살균 및 4 °C에서 1 mL 알리쿼트 저장.
참고: 피콜릴 아지드는 여러 가지 다른 형광, 비오틴 및 고추냉이 과산화공 (HRP)에 공액으로 제공됩니다.
- EdU로 혈관 평활근 세포(VSMC)에 라벨을 붙입니다.
참고: 인간 VSMC는 조직의 이식 된 조각에서 자라난을 통해 장골 동맥에서 분리되었습니다. 인슐린, 트랜스페린, 셀레늄을 함유한 무혈압에서 재배하면 이들 세포는 VSMC 마커스필린, 평활근 미오신 중혈(SM-MHC) 및 SMC αactin13을발현한다.- 플레이트 혈관 평활근 세포는 96웰 플레이트에서 덜베코의 변형된 독수리 배지(DMEM)에서 2 x 10 4/mL로 진행된다.
참고: 세포는 2% 태아 소 혈청을 가진 평활근 세포 매체에 있는 37°C에서 성장합니다. - (선택 사항) 준수를 위해 하룻밤까지 몇 시간 동안 두도록 두드리라. 각 우물에 20 μL resazurin 스톡을 추가합니다. 37°C에서 3시간 동안 배양. 플레이트 리더에서 형광 신호를 판독한다(560ex,594em). 미디어를 신선한 DMEM으로 바꿉습니다.
참고: 이 단계는 선택 사항입니다. Resazurin는 세포 수를 정규화하고 도금14에있는 잘 잘 가변성을 설명하기 위하여 이용됩니다. - 배양 기간의 시작 부분에서 치료당 3-6 웰에 인산완충식염수(PBS) 또는 혈소판 유래 성장 인자(PDGF) 30 ng/mL를 추가하고 72시간 동안 배양한다.
- 5 mM EdU 스톡을 1 mM으로 희석하십시오. 72시간 배양 기간의 마지막 24시간 동안 각 웰(최종 농도 20 μM)에 2 μL을 첨가한다. 한 복제 세트에 EdU를 추가하지 마십시오. 이러한 우물은 배경 형광 /발광을 결정하는 데 사용됩니다.
참고: EdU를 사용하여 배양 및 라벨링 기간은 평활근 세포에 최적화되어 있지만 세포 유형당 수정해야 할 수도 있습니다.
- 플레이트 혈관 평활근 세포는 96웰 플레이트에서 덜베코의 변형된 독수리 배지(DMEM)에서 2 x 10 4/mL로 진행된다.
- 파라포름알데히드(PFA)에서 세포를 수정합니다.
- 매체를 제거하고 실온에서 10 분 동안 잘 당 4 % PFA (PBS)의 150 μL을 추가하십시오.
- PFA를 제거하고 실온에서 30 분 동안 잘 당 1 % 폴리에틸렌 글리콜 테르-octylphenyl 에테르 (TX-100)의 150 μL을 추가합니다.
- PBS로 세 번 세척하여 TX-100을 제거합니다.
주의: PFA는 독성이 있으며 조심스럽게 취급하십시오.
참고: 프로토콜은 여기에서 일시 중지할 수 있습니다. 고정 셀은 4°C에서 PBS에 저장할 수 있습니다.
- 통합 된 EdU를 감지합니다.
- THPTA 20 μL, CuSO4 20 μL, Cy3 피콜릴 아지드 5 μL, Na ascorbate 100 μL에서 PBS에 100 μL의 총 부피를 추가하여 사용 직전에 라벨링 솔루션(96웰 플레이트당 10 mL, 내부 60웰을 사용함)을 확인합니다.
- 우물에서 PBS를 제거하고 각 우물에 150 μL의 라벨링 솔루션을 추가합니다. 37 °C에서 30 분 배양. 모든 핵을 검출하려면, 추가 4′,6-디아미디노-2-페니린돌 (DAPI) 각 우물에. 형광 플레이트 리더에 읽기 (Cy3 550전,570em; DAPI 350ex, 470em)또는 현미경상.
참고: 프로토콜은 여기에서 일시 중지할 수 있습니다. 고정 및 염색된 세포는 4°C에서 PBS에 저장되고 나중에 이미지화될 수 있다.
2. 발광을 이용한 EdU 검출
- 섹션 1.1-1.3을 완료합니다.
- 0.1% 폴리소르베이트 20(TBST)으로 트리스 버퍼링식염수를 준비합니다.
- 우물을 차단합니다.
- 각 우물에 150 μL의 블로킹버퍼(재료 표)를넣고 실온에서 90분 동안 배양합니다.
- 차단 버퍼를 제거하고 200 μL의 PBS로 세 번 씻으하십시오.
- 통합 된 EdU를 감지합니다.
- Cy3 피콜릴 아지드에 대한 비오틴 피콜릴 아지드를 1.4.1 단계에서 지시대로 라벨링 용액을 확인합니다.
- TBST 200 μL로 우물을 5번 씻고, 흔들어서, 세척당 3분.
- 실온에서 20 분 동안 0.3 % H2O2의 150 μL로 내인성 과산화를 담금질.
- H2O2를 제거하고 200 μL의 TBST로 5회 세척하고, 세척당 3분씩 흔들어 주세요.
- TBST에서 스트렙타비딘 고추냉이 과산화를 희석하고 각 우물에 50 μL을 추가합니다. 실온에서 1 h를 배양하십시오.
- TBST 200 μL로 5회 세척하고, 흔들어서, 1회 세척당 3분.
- 화학 발광 효소 연결 면역 흡착 분석 (ELISA) 기질(재료표)의50 μL을 각 우물에 추가합니다.
- 발광을 감지할 수 있는 플레이트 리더에서 즉시 판독하십시오.
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Representative Results
도 2에서,PDGF에 응하여 VSMC의 증식을 측정하는 3가지 다른 실험의 결과를 입증하였다. SMC를 위해 제형화된 매체에서 세포를 성장한 후, 혈청 무첨가 DMEM에서 실험을 수행하여 혈청 또는 증식에 대한 성장 인자의 잠재적 인 영향을 제거하였다. 그림 2A에서는 형광 대 발광 판독을 사용하여 동일한 실험에서 결과를 비교합니다. 이러한 플레이트를 읽기 위해 흡광도, 형광 및 발광을 읽을 수 있는 멀티 모드 마이크로플레이트 리더를 사용했습니다(재료 표참조).
플레이트 리더를 스캐닝 웰 모드에서 사용하면 형광 수치가 전체 웰에 걸쳐 평균화됩니다. 이 모드는 웰의 중심과 가장자리 간의 차이로 인해 잠재적인 부정확성을 완화합니다. 그러나, 아주 몇몇 핵이 양성인 경우에, 몇몇만 긍정적인 때 이 방법으로 결과를 읽는 것은 확률이 높습니다 양성 세포의 "수"를 과소평가합니다. 이 판독을 통해 숫자는 정확한 셀 번호가 아닌 다른 우물의 형광을 의미합니다. 또한 형광을 포착하는 섬유 또는 죽은 세포의 덩어리가있는 경우, 이것은 영역 스캔에 포함됩니다. 그러나, 플레이트 리더를 사용하는 장점은 시간이다. 스캔 모드에서 읽는 데는 우물당 15-20초가 걸리지만, 이미징 소프트웨어를 사용하여 사진을 찍고 분석하는 데 시간이 많이 걸리는 개인 시간과는 달리 자동화됩니다.
위의 방법에서 잠재적 인 과소 평가를 해결하기 위해, 우리는 EdU를 복용하는 세포가 차례로 스트렙타비딘 - 고추 냉이 peroxidase로 검출되는 아지드 - 비오틴 moiety로 검출되는 균일 한 액체 판독으로 형광 스캔을 변환 (그림 1참조). 고추냉이 과산화아제의 양은 ELISA용 으로 포맷된 표준 기판을 사용하여 정량화됩니다. 이 기술의 장점은 보다 균일한 판독이며, 그림 2A,B는 이 방법이 사용된 실험의 예를 보여줍니다. 또한, 플레이트는 몇 초 만에 읽을 수 있다. 그러나 이 방법에는 단점이 있습니다. 첫째,이 방법의 배경은 형광보다 높습니다. 배경을 줄이기 위해 차단 단계와 여러 번의 세안이 통합되었습니다. 이 배경의 반사로, 부정적인 대조군 (치료되지 않은 세포)는 더 높은 경향이 있고, 증식에 있는 배 증가는 더 낮습니다. 둘째, 형광 판독과 마찬가지로 검출 시약을 집어 드는 모든 섬유 또는 죽은 세포는 총 발광에 추가됩니다.
위의 실험에서 가변성을 줄이기 위해 결과를 초기 세포 수로 정규화했습니다. 증식 분석의 경우, 정상화는 세포가 분열하기 전에 분석의 시작 부분에 살아있는 세포에서 수행되어야한다. 또한, 이 분석은 EdU의 세포 기능 또는 혼입에 영향을 줄 수 없다. 이러한 제약을 감안할 때, 우리는 resazurin14를통해 세포 수의 반사로 신진 대사를 사용하기로 결정했습니다. 정규화유무에 관계없이 결과는 그림 2B에나와 있습니다. 그러나 별도의 실험 세트에서 이 방법은 셀 수의 작은 차이를 감지할 만큼 민감하지 않다는 것을 발견했습니다. 또한 이 판독값의 오류는 전체 실험에서 더 많은 오류를 발생시게 됩니다. 이러한 이유로, 우리는 가능한 한 균등하게 플레이트 세포에 특별한주의를 기울이고, 정상화 단계를 수행하지 않기로 했다.
우리가 가능한 가장 정확한 결과를 얻고 있었다는 것을 확인하기 위하여는, 우리는 반전된 형광 현미경을 사용하여 형광 염색 (섹션 1) 및 계수 세포로 되돌아갔습니다. 이 방법의 장점은 양전지를 물리적으로 보고 계산하여 가장 정확도를 보장할 수 있다는것입니다(그림 3). 모든 형광 파편은 카운트에서 제외될 수 있습니다. EdU가 없는 배경 수는 눈에 보이는 형광이 없으므로 빼기 배경이 없으므로 0입니다. 이 방법의 주요 단점은 시간입니다. 96 웰 플레이트에 도금 된 세포에서 핵을 계산하기 위해, 우리는 EdU 양성 세포와 총 세포 (DAPI)의 우물 당 3 장의 사진을 찍어 웰 당 6 개의 이미지를 필요로합니다. 우리는 두 번 세포를 겹치고 계산하지 않도록주의하면서, 우물의 상단의 중간부분에서 수직으로 사진을 찍습니다. 총 셀을 계산하면 증식 결과를 확인하는 두 번째 데이터가 생성됩니다. 그러나, VSMC(36−48h)의 비교적 느린 배배 시간에 비추어 볼 때, PDGF 대 대조군으로 자극된 총 세포의 배 증가는 EdU 양성 세포의 배 증가보다 훨씬 낮으며, 이것이 우리가 EdU의 혼입을 측정하는 이유이다(도2C).
EdU 양성 및 총 세포를 계산하는 가장 효율적이고 정확한 방법은 이미징 플레이트 리더를 사용하는 것입니다. 이 방법은 계수의 정확성과 자동화 속도를 결합합니다. 주요 단점은 장비의이 조각은 모든 기관에서 사용할 수 없다는 것입니다. 자동 수동 카운트와 수동 카운트를 비교할 때 EdU 포지티브 수동 카운트는 본질적으로 자동화 된 개수(그림2C,왼쪽)와 동일하며, 총 비자극 카운트(그림2C,오른쪽)와 동일합니다. 그러나, 수동 카운트는 총 PDGF 자극 세포에서 자동화된 카운트보다 낮았다. 이 다름은 세포 성장 패턴에 아마 관련됩니다. 세포가 우물의 중심에서 성장하는 경향이 있기 때문에, 작은 숫자와 함께 자동화 및 수동 카운트는 거의 동일했다. 그러나 숫자가 높을수록 가장자리에 더 많은 셀이 있었고 우물 주변에서 세포를 포착하지 않은 수동 카운트는 정확도가 낮았습니다.
그림 1: 형광 또는 발광에 의한 EdU 검출 개요.
VSMC 또는 다른 부착 세포는 관심 조건하에서 처리됩니다. EdU는 배양 기간의 마지막 24시간 동안 첨가되고 분할 세포의 DNA에 통합된다. 통합 된 EdU는 형광 (프로토콜 섹션 1) 또는 발광 (프로토콜 섹션 2)을 사용하여 검출됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: EdU 및 클릭 화학을 통합하여 다양한 판독으로 증식을 측정합니다.
(a)VSMC는 PDGF의 존재 또는 부재에서 배양되었다. EdU는 배양의 마지막 24h를 첨가하였고, 혼입은 형광(프로토콜 섹션 1) 또는 발광(프로토콜 섹션 2)에 의해 검출되었다. (B)VSMC는 패널 A에 기재된 바와 같이 처리되었고, EdU의 혼입은 발광에 의해 측정되었다. 결과는 resazurin 생존성 분석기를 사용하여 초기 세포 수로 정규화되었다. (C)VSMC는 패널 A에서와 같이 처리하였고, EdU의 혼입은 형광에 의해 측정되었다. EdU 양성 세포는 이미징 플레이트 리더를 사용하여 자동으로 계산되거나 이미징 소프트웨어를 사용하여 이미징 및 계수하여 수동으로 계산했습니다. 표시된 결과는 치료당 3-6개의 복제물의 평균 ± 표준 편차이다.
도 3: 클릭 형광 프로토콜에 따른 EdU 양성 세포의 시각화.
VSMC는 도 2에기재된 바와 같이 처리되었고, 통합된 EdU는 형광(프로토콜 섹션 1)을 사용하여 검출되었다. 각 이미지는 96 웰 플레이트의 단일 웰입니다. 총 핵은 청색(DAPI)으로 도시되고 EdU 양성 핵은 녹색이다. 배율 표시줄 = 50 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
EdU의 통합은 세포 증식을 측정하는 간단하고 간단한 방법입니다. 특히 부착세포(13)에유용하다. 우리의 프로토콜은 평활근 세포를 사용하지만 모든 부착 세포 (상피, 내피 등)에 적용 할 수 있습니다. 프로토콜이 복잡하지는 않지만, 한 가지 중요한 단계는 라벨링 솔루션을 만드는 것입니다 - 성분은 나열된 순서대로 추가되어야 합니다. 또한, 케미발광웨스턴 블롯과 마찬가지로, 발광 판독을 사용하는 경우 플레이트를 즉시 읽어야 한다.
필요에 따라 프로토콜의 여러 부분을 수정하거나 최적화할 수 있습니다. 한 부분은 EdU를 가진 배양 기간입니다. 우리의 목표는 가능한 한 많은 증식 세포를 검출하는 것이었기 때문에, 우리는 고정및 염색하기 전에 전체 24 시간 동안 EdU를 추가했습니다. 그러나, 이 타이밍은 S와 G2/M 단계 둘 다에 있는 세포를 측정할 가능성이 높습니다. S 상에서 만 세포에 라벨을 붙이기 위해 Cecchini 등은 천천히 분할하는 세포조차도 6 시간7이상 EdU로 배양될 것을 권고합니다. 최적화할 수 있는 프로토콜의 또 다른 부분은 킬레이터의 양입니다. 알키네-아지드 반응은 구리 촉매(CuSO4)를필요로 한다. THPTA는 필요한 산화 상태에서 구리를 유지하는 구리 킬레이트입니다. 구리에 킬레이트의 비율은 알케인 - 아지드 결합을 증가시키기 위해, 변화 될 수있다. 우리는 킬레이터로 밝은 염색을 관찰 : 2 :1의 구리 비율, 또한 피콜릴 아지드를 사용하는 맥락에서. 피콜릴 모에티는 필요한 구리의 농도를 감소시키고반응(15)의효율을 증가시키는 킬레이트화 활성을 추가한다. 킬레이터:구리 비율을 최대 5:1까지 증가하여 조사자 요구당 최적화할 수 있습니다. 더 나은 킬레이터, 2-[4-({bis[(1-tert-butyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)메틸]-1H-1,2,3-트리아졸-1-yl]아세트산(BTTAA)이 현재 시판되고있다. 이 킬레이터는 이 프로토콜을 처음 파생시켰을 때 상업적으로 사용할 수 없었습니다. 마지막으로, 우리는이 프로토콜에서 고정제로 파라 포름 알데히드를 사용하지만, 세포는 또한 투과 단계를 제거 메탄올로 고정 될 수있다. 메탄올로 고정하는 것은 특정 세포 단백질의 면역 형광 염색과 EdU의 통합을 결합하려는 경우에 도움이 될 수 있습니다.
이 방법의 한 가지 단점은 EdU의 잠재적인 세포 독성, 특히 시간의 펄스 라벨 반대로 일 동안 EdU와 지속적으로 라벨링 하는 경우에 특히. 사용되는 세포에 따라, EdU는 세포 주기 체포 또는 심지어 세포 사멸을 일으키는 것으로 밝혀졌다17. 이러한 독성은 인공뉴클레오시드(18)의첨가로부터의 DNA 복제 불량으로 인한 것으로 생각된다. 연구는 세포주 의존도 및 농도의존도17이독성을 나타내고 있다. 우리는 우리의 연구에서 독성에 어떤 문제를 관찰 하지 않았다.
요약하자면, EdU및 클릭 화학을 통한 증식 측정은 BrdU 또는 3H-티미딘 통합과 같은 다른 일반적으로 사용되는 방법에 비해 몇 가지 장점이 있습니다. 여기에는 방사능 방지, 배경이 낮은 높은 특이성, 가혹한 변성 단계가 필요하지 않습니다. 일단 확립되면, 클릭 화학은 매우 다재다능하며 RNA, 단백질, 지방산 및 탄수화물의 대사 라벨링을 위해 쉽게 변형 될 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
케이티 캐롤에게 기술 지원을 부탁드립니다. 우리는 또한 Cytation 화상 진찰 격판덮개 리더의 지시 그리고 제공을 위한 박사 데이비드 쿨 과 Proteomics 분석 실험실감사합니다. 이 작품은 라이트 주립 재단 보조금(L.E.W.)에 의해 지원되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine | Carbosynth | NE08701 | |
| biotin picolyl azide | Click Chemistry Tools | 1167-5 | |
| CuSO4 | Fisher Scientific | C1297-100G | |
| Cy3 picolyl azide | Click Chemistry Tools | 1178-1 | |
| Cytation Plate Reader | Biotek | ||
| EVOS Microscope | Thermo Fisher Scientific | ||
| Hydrogen peroxide solution | Sigma-Aldrich | 216763 | |
| Na ascorbate | Sigma-Aldrich | 11140-250G | |
| NucBlue Fixed Cell Stain Ready Probes | Invitrogen | R37606 | DAPI nuclear stain |
| Odyssey Blocking Buffer | Li-Cor | 927-40000 | blocking buffer |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Services | 15710 | |
| PBS | Fisher Scientific | SH3002802 | |
| Sodium Chloride | Sigma Life Science | S3014-5kg | |
| Streptavidin Horseradish Peroxidase Conjugate | Life Technologies | S911 | |
| Super Signal ELISA Femto | Thermo Scientific | PI137075 | ELISA substrate |
| Synergy Plate Reader | Biotek | ||
| THPTA | Click Chemistry Tools | 1010-100 | |
| Tris Hydroxymethyl Aminomethane Hydrochloride (Tris-HCl) | Fisher Scientific | BP153-500 | |
| Triton X 100 | Bio-Rad | 1610407 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-100 |
References
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