Summary
Распространение является важной частью клеточной функции, и общие считывая используется для оценки потенциальной токсичности новых препаратов. Измерение пролиферации, таким образом, часто используется в клеточной биологии. Здесь мы представляем простой, универсальный метод измерения пролиферации, который может быть использован в клетках,приверженных и непридерживаться.
Abstract
Способность клетки размножаться является неотъемлемой частью нормальной функции большинства клеток, и дисрегуляция пролиферации лежит в основе многих процессов заболевания. По этим причинам измерение пролиферации является общим инструментом, используемым для оценки функции клеток. Пролиферация клеток может быть измерена просто путем подсчета; однако это косвенное средство измерения распространения. Одним из распространенных средств непосредственного обнаружения клеток, готовящихся к разделению, является включение помеченных нуклеозидных аналогов. К ним относятся радиоактивный нуклеозидный аналог 3H-тимидин плюс нерадиоактивные нуклеозидные аналоги, такие как 5-бромо-2' deoxyuridine (BrdU) и 5-этинил-2 -deoxyuridine (EdU). Включение EdU обнаруживается по щелчку химии, которая имеет ряд преимуществ по сравнению с BrdU. В настоящем докладе мы предусматриваем протокол для измерения распространения путем включения Эду. Этот протокол включает в себя варианты различных считываний, а также преимущества и недостатки каждого из них. Мы также обсуждаем места, где протокол может быть оптимизирован или изменен для удовлетворения конкретных потребностей запланированного эксперимента. Наконец, мы касаемся способов, которыми этот базовый протокол может быть изменен для измерения других метаболитов клеток.
Introduction
Распространение является важнейшей частью клеточной функции1,2. Контроль распространения влияет на нормальные процессы, такие как развитие, и патологические процессы, такие как рак и сердечно-сосудистые заболевания. Гиперпластический рост сосудистых гладких мышечных клеток, например, считается предшественником атеросклероза3. Изменения в пролиферации клеток также используются для оценки потенциальной токсичности новых препаратов. Учитывая его широкое воздействие, измерение распространения является основой многих лабораторий, основанных на клеточной биологии.
Пролиферация клеток может быть измерена путем простого подсчета клеток, если популяция клеток, представляющих интерес, делится довольно быстро. Для более медленных растущих клеток количество клеток может быть менее чувствительным. Распространение часто измеряется путем включения помеченных нуклеозидных аналогов. Хотя золотой стандарт 3H-тимидин включения, многие лаборатории уходят от этого метода, учитывая наличие новых, нерадиоактивных альтернатив. К ним относятся цитоплазматические флуоресцентные красители, обнаружение связанных с клетками белков и включение нерадиоактивных нуклеозидных аналогов, таких как деоксюридин 5-бромо-2' (BrdU) и 5-этинил-2 --deoxyuridine (EdU)4.
Цитоплазматические красители, такие как carboxyfluorescein диацетат succinimidyl эфир (CFSE), обнаружить пролиферацию, потому что интенсивность красителя половинки каждый раз, когда клетка делит5. Этот метод обычно используется в цитометрии потока для неприсоединения клеток. Он не был использован много для приверженцев клеток, но с новым поколением изображений пластины читателей это может измениться. Обнаружение клеточного цикла связанных белков с помощью антител на основе методов (поток цитометрии, иммуногистохимии и т.д.) часто используется для тканей или неприсоединения клеток. Эти клетки / ткани должны быть исправлены и проницательны до окрашивания. Нуклеозидные аналоги BrdU и EdU похожи по подходу к 3H-тимидину, но без неудобства радиоактивности. Включение BrdU обнаруживается анти-BrdU антител, и поэтому клетки должны быть фиксированными и проницаемыми до окрашивания. Кроме того, клетки должны рассматриваться dNase подвергать эпитоп BrdU.
Включение EdU обнаруживается щелчком химии, в которой алкин и азид групп "нажмите" вместе в присутствии каталитического меди. Любая группа может служить в качестве биосинтетически включены молекулы или обнаружения молекулы4. Коммерчески доступные нуклеозидные аналоги имеют алкин группы прилагается. Таким образом, для анализов пролиферации алкининовый нуклеозидный аналог обнаруживается ацидом азида, спряженный к флуоресцентному красищу или другому маркеру. Включение EdU имеет ряд преимуществ перед BrdU. Во-первых, потому что алкин и азид группы не встречаются в клетках млекопитающих, это взаимодействие является весьма конкретным с низким фоном6. Поскольку обе группы малы, клетки не должны проходить денатурацию ДНК, чтобы разоблачить аналог нуклеозидов, как это требуется для BrdU7. Наконец, нажмите химии является весьма универсальным, и может быть использован для метаболической маркировки ДНК, РНК, белка, жирных кислот и углеводов8,9,10,11. Если метаболически помеченная цель интереса находится на поверхности клетки, живые клетки могут быть помечены12. Кроме того, клетки могут быть дополнительно обработаны для иммунофлуоресцентного окрашивания антителами.
Следующий протокол описывает использование edU включения и нажмите химии для измерения пролиферации в человеческих сосудистых гладких мышечных клеток(рисунок 1). Мы показываем три различных способа включения EdU могут быть измерены, репрезентативные результаты от каждого, и их преимущества и недостатки. Измерение пролиферации с помощью щелчка химии особенно полезно для приверженцев, медленнее растущих клеток. Кроме того, морфология клетки в хорошем состоянии и антитела на основе окрашивания также может быть выполнена.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Обнаружение EdU с использованием флуоресцентной этикетки
- Фондовые решения
- Подготовьте 5 мМ EdU бульонный раствор, добавив 12,5 мг EdU до 10 мл двойной дистиллированной H2O.
- Подготовка компонентов раствора маркировки: 200 мМ три (3-гидроксипропилтриазолметилметил) амина (THPTA) (100 мг в 1,15 мл H2O), 100 мМ CuSO4 (15,95 мг в 1 мл H2O; сделать свежий), 10 мМ Cy3 picolyl-azide (1M L L l L 5 мг В 1 м5 L L L 2 O; сделать свежий), 10 мм Cy3 picolyl-azide (15,9м мг вH5 , хранится в 5 qL aliquots при -20 градусах По Цельсия) и 1 М аскорбате натрия (200 мг в 1 мл Н2О; сделать свежим).
- Приготовьте раствор ризазурина в концентрации 0,15 мг/мл. Фильтр стерилизовать и хранить 1 мл aliquots при 4 градусах По Цельсию.
ПРИМЕЧАНИЕ: Picolyl azide доступен спряженный с несколькими различными флюорами, биотином и пероксидазой хрена (HRP).
- Этикетка сосудистых гладких мышечных клеток (VSMC) с EdU.
ПРИМЕЧАНИЕ: Человек VSMCs были изолированы от подвздошных артерий через рост от explanted куски ткани. При выращивании в сыворотке крови свободных носителей с инсулином, трансферрин, селен эти клетки выражают VSMC маркеры smoothelin, гладкой мышечной миозина тяжелой цепи (SM-MHC) и SMC Зактин13.- Плита сосудистых гладких мышечных клеток на 2 х 104/мл в Dulbecco в модифицированной среде Eagle (DMEM) в 96 хорошо пластины.
ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки выращиваются при 37 градусах По Цельсия в гладких мышечных клеточных носителях с 2% сыворотки крупного рогатого скота плода. - (Необязательно) Разрешить несколько часов на ночь для присоединения. Добавьте 20 акций resazurin l к каждой скважине. Инкубировать при 37 градусах По цельсии на 3 ч. Прочитайте сигнал флуоресценции в считывателе пластин (560ex,594em). Замените носители свежими DMEM.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг является необязательным. Резазурин используется для нормализации числа клеток и учитывает хорошо хорошо изменчивость при покрытии14. - Добавьте фосфатбуферный солен (PBS) или тромбоциты, полученный коэффициент роста (PDGF) 30 нг/мл до 3-6 скважин на обработку в начале культурного периода и инкубировать в течение 72 ч.
- Разбавить 5 мМ EdU запас до 1 мМ. Добавьте 2 qL к каждому колодцу (окончательная концентрация 20 мкм) за последние 24 ч периода культуры 72 ч. Не добавляйте EdU в один набор репликаток. Эти скважины будут использоваться для определения фоновой флуоресценции/ люминесценции.
ПРИМЕЧАНИЕ: Продолжительность культуры и маркировки с EdU оптимизирована для гладких мышечных клеток, но, возможно, должны быть изменены в зависимости от типа клеток.
- Плита сосудистых гладких мышечных клеток на 2 х 104/мл в Dulbecco в модифицированной среде Eagle (DMEM) в 96 хорошо пластины.
- Исправить клетки в параформальдегиде (PFA).
- Удалите носители и добавьте 150 л 4% PFA (в PBS) в колодец в течение 10 минут при комнатной температуре.
- Удалить PFA и добавить 150 л 1% полиэтиленгликоль терт-octylphenyl эфир (TX-100) (в воде) в колодец в течение 30 минут при комнатной температуре.
- Удалите TX-100, стиря три раза с помощью PBS.
ВНИМАНИЕ: PFA является токсичным, ручка с осторожностью.
ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол можно приложить здесь. Фиксированные ячейки могут храниться в PBS при 4 градусах Цельсия.
- Обнаружение включены EdU.
- Сделать решение маркировки (10 мл на 96 скважины, используя внутренние 60 скважин) непосредственно перед использованием путем добавления реагентов из стоковых растворов в следующем порядке: THPTA 20 зл, CuSO4 20 л, Cy3 picolyl azide 5 л, Na ascorbate 100 л к PBS для общего объема 10 мл.
- Удалить PBS из скважин и добавить 150 злифицирующих раствор для каждой скважины. Инкубировать 30 мин при 37 градусах По Цельсию. Чтобы обнаружить все ядра, добавьте 4",6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI) к каждой скважине. Читайте на флуоресценции пластины читателя (Cy3 550ex, 570EM; DAPI 350ex, 470em) или изображение на микроскопе.
ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол можно приложить здесь. Фиксированные и окрашенные клетки могут храниться в PBS при 4 градусах Цельсия и изображены на более позднем времени.
2. Обнаружение EdU с использованием люминесценции
- Полные разделы 1.1-1.3.
- Подготовка Tris-буферный солен с 0,1% полисорбат 20 (TBST).
- Блок колодцев.
- Добавьте 150 кл блокирующий буфер(Таблица материалов)к каждой скважине и инкубизируете в течение 90 минут при комнатной температуре.
- Удалите блокирующий буфер и промойте три раза с 200 Зл PbS.
- Обнаружение включены EdU.
- Сделать решение маркировки, как указано в шаге 1.4.1, заменив биотин picolyl азид для Cy3 picolyl азид.
- Вымойте скважины пять раз с 200 Л Л TBST, с встряхиванием, 3 мин на стирку.
- Утоление эндогенных пероксидаз с 150 л 0,3% H2O2 в течение 20 мин при комнатной температуре.
- Удалить H2O2 и вымыть пять раз с 200 Зл ТБСТ, с встряхиванием 3 мин на стирку.
- Разбавить стрептавидин-хандад пероксидаза (SA-HRP; 1:200) в TBST и добавить 50 л к каждой скважине. Инкубировать 1 ч при комнатной температуре.
- Вымойте пять раз с 200 Л TBST, с встряхиванием, 3 мин на стирку.
- Добавьте к каждому колодцу 50 кЛ хемилюминесцентного ферменто-связанного иммуносорбента (ELISA).
- Читайте сразу в плите читателя, способного обнаруживать люминесценцию.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
На рисунке 2мы демонстрируем результаты трех различных экспериментов, измеряя распространение VSMC в ответ на PDGF. После выращивания клеток в средствах массовой информации, разработанных для SMCs, мы провели эксперимент в сыворотке крови бесплатно DMEM, чтобы устранить любые потенциальные последствия сыворотки или факторов роста на пролиферацию. На рисунке 2A мы сравниваем результаты того же эксперимента, используя флуоресцентное против люминесцентного считывание. Для чтения этих пластин мы использовали многорежимный микроплитный считыватель, который может читать абсорбцию, флуоресценцию и люминесценцию (см. Таблицу Материалов).
Используя считыватель пластин в режиме сканирования скважины, флуоресцентные показания усредняются по всему колодцу. Этот режим снимает потенциальные неточности из-за различий между центром и краями скважины. Однако, если очень немногие ядра являются положительными, чтение результатов таким образом, вероятно, недооценивает "число" положительных клеток, когда лишь немногие из них являются положительными. Номер, с этим считыванием, означает флуоресценцию по отношению к другой хорошо, а не точные номера клеток. Кроме того, если есть волокно или скопление мертвых клеток, который поднимает флуоресценции, это будет включено в области сканирования. Тем не менее, преимущество использования считывателя пластин является время. В то время как чтение в режиме сканирования занимает 15–20 секунд на скважину, оно автоматизировано в отличие от личного трудоемкого метода съемки и анализа их с помощью программного обеспечения для визуализации.
Чтобы исправить потенциальные недооценки из вышеуказанного метода, мы преобразовали флуоресцентное сканирование в однородное, жидкое считывание, в котором клетки, занимавшие EdU, обнаруживаются с помощью азида-биотина moiety, который, в свою очередь, обнаруживается с помощью стрептавидино-хандадисского пероксидазы (см. рисунок 1). Количество пероксидазы хрена затем количественно с помощью стандартного субстрата, отформатированного для ELISA. Преимуществом этого метода является более однородное считывание, и на рисунке 2A,B показаны примеры экспериментов, где этот метод был использован. Кроме того, пластина может быть прочитана в считанные секунды. Однако у этого метода есть и недостатки. Во-первых, фон с этим методом выше, чем при флуоресценции. Чтобы уменьшить фон, мы включили блокирующий шаг и несколько сравлки. В качестве отражения этого фона, отрицательный контроль (необработанные клетки), как правило, выше, и увеличение раза в пролиферации ниже. Во-вторых, как и в случае с флуоресценцией, любые волокна или мертвые клетки, которые подбирают реагенты обнаружения, добавят к общей люминесценции.
В попытке уменьшить изменчивость в вышеуказанных экспериментах, мы нормализовали наши результаты до первоначальных количества клеток. Для пролиферации анализов, нормализация должна быть сделана на живых клетках в начале асссе, прежде чем клетки делятся. Кроме того, ассеможно повлиять на функцию клеток или включение EdU. Учитывая эти ограничения, мы решили использовать метаболизм в качестве отражения номера клеток через resazurin14. Результаты с нормализацией и без нее показаны на рисунке 2B. Однако в отдельном наборе экспериментов мы обнаружили, что этот метод недостаточно чувствителен для обнаружения небольших различий в количестве клеток. Кроме того, любая ошибка в этом считывании вводит больше ошибок во всем эксперименте. По этим причинам мы решили принять чрезвычайную осторожность в пластины клеток как можно более равномерно, а не выполнять шаг нормализации.
Чтобы убедиться, что мы получали наиболее точные результаты возможно, мы вернулись к флуоресцентным окрашивания (раздел 1) и подсчета клеток с помощью перевернутой флуоресценции микроскопа. Преимущество этого метода заключается в том, что можно физически видеть и считать положительные клетки, обеспечивая максимальную точность(рисунок 3). Любой флуоресцентный мусор может быть исключен из графа. Фоновые подсчеты без EdU 0, так как нет видимой флуоресценции, и, следовательно, нет фона для вычитания. Основным недостатком этого метода является время. Для подсчета ядер в клетках, покрытых пластиной 96 скважин, мы делаем 3 снимка на скважину как положительных клеток EdU, так и общих клеток (DAPI), требующих 6 изображений на скважину. Мы фотографируем вертикально от живота сверху до нижней части колодца, заботясь о том, чтобы не перекрывать и считать ячейки дважды. Подсчет общих ячеек дает нам вторую часть данных, которая подтверждает наши результаты распространения. Тем не менее, в свете относительно медленного времени удвоения VSMC (36-48 ч), увеличение раза в общей клетки стимулировали с PDGF против контроля гораздо ниже, чем увеличение раза EdU положительных клеток, поэтому мы измеряем включение EdU (Рисунок 2C).
Наиболее эффективным и точным способом подсчета положительных и общих клеток EdU является использование считывателя пластин изображений. Этот метод сочетает в себе точность подсчета с скоростью автоматизации. Основным недостатком является то, что эта часть оборудования не доступна в каждом учреждении. При сравнении автоматизированных и ручных подсчетов, EdU положительный ручной подсчет был по существу идентичны автоматизированного подсчета(рисунок 2C, слева), как и общее количество unstimulated(Рисунок 2C, справа). Тем не менее, ручной подсчет был ниже, чем автоматизированный подсчет в общей PDGF стимулировали клетки. Эта разница, вероятно, связана с структурой роста клеток. Потому что клетки клонат вырасти в центре наилучшим образом, с более малыми номерами автоматизированные и ручные отсчеты были близко идентичны. Однако, с более высокими номерами были вероятно больше клетки на краях и ручные отсчеты, которые не захватывали клетки на периферии наилучшим образом, были более менее точны.
Рисунок 1: Обзор обнаружения EdU путем флуоресценции или люминесценции.
VSMC или другие клетки адептов лечатся в условиях интереса. EdU добавляется за последние 24 ч периода культуры и включены в ДНК деления клеток. Включенный EdU затем обнаруживается с помощью флуоресценции (протокол раздел 1) или люминесценции (протокол раздел 2). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Измерение распространения с различными считываниями с использованием включения EdU и нажмите химии.
(A) VSMCs были культивированы в присутствии или отсутствии PDGF. EdU был добавлен последние 24 ч культуры, и включение было обнаружено либо флуоресценции (протокол раздел 1) или люминесценции (протокол раздел 2). (B) VSMCs были обработаны как описано в панели A, и включение EdU было измерено люминесценцией. Результаты были нормализованы до первоначальных подсчетов клеток с помощью resazurin жизнеспособности ассе. (C) VSMCs были обработаны как в панели A, и включение EdU было измерено флуоресценцией. Положительные клетки EdU были подсчитаны автоматически, с помощью считывателя пластин изображений, или вручную с помощью изображений, а затем подсчета с помощью программного обеспечения для визуализации. Показаны результаты – это среднее стандартное отклонение в 3–6 репликаций на лечение.
Рисунок 3: Визуализация положительных клеток EdU после нажатия протокола флуоресценции.
VSMC рассматривались как описано на рисунке 2, и включены EdU был обнаружен с помощью флуоресценции (протокол раздел 1). Каждое изображение представляет собой один колодец из 96 хорошо пластины. Общие ядра показаны синим цветом (DAPI) и положительные ядра EdU зеленые. Шкала бар 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Включение EdU является простым, простым способом измерения пролиферации клеток; это особенно полезно для адептов клеток13. Наш протокол использует гладкие мышечные клетки, но он применим к любой клетке адепта (эпителиальная, эндотелиальная и т.д.). Хотя протокол не является сложным, одним из важнейших шагов является создание решения по маркировке – ингредиенты должны быть добавлены в перечисленный порядок. Кроме того, как хемилюминесцентные западные помарки, при использовании люминесценции считывание пластины должны быть прочитаны немедленно.
Несколько частей протокола могут быть изменены или оптимизированы по мере необходимости. Одной из частей является продолжительность инкубации с EdU. Поскольку нашей целью было обнаружить как можно больше размножающихся клеток, мы добавили EdU для полного 24 ч до фиксации и окрашивания. Тем не менее, это время, вероятно, измеряет ячейки в обоих S и G2 / M фаз. Чтобы маркировать только клетки в фазе S, Cecchini et al. советуют даже медленно разделять клетки инкубироваться Эду не более 6 часов7. Другая часть протокола, которая может быть оптимизирована, это количество хелатора. Алкин-азид реакции требуют медного катализатора (CuSO4). THPTA является медным хелатором, который поддерживает медь в необходимом состоянии окисления. Соотношение хелятора к меди может быть разнообразным, чтобы увеличить связывание алкин-азида. Мы наблюдаем яркое окрашивание с хелатором:медное соотношение 2:1, в контексте также с использованием азида пиколила. Picolyl moiety добавляет хелатирующую активность, которая снижает концентрацию меди необходимо и повышает эффективность реакции15. Chelator:Медь отношения могут быть увеличены, как правило, до 5:1, для оптимизации на следователя потребностей. Лучше chelator, 2-4-(бис(1-терт-бутил-1H-1,2,3-триазол-4-yl)метиламино-метил)-1H-1,2,3-триазол-1-yl-acetic кислота (BTTAA), в настоящее время коммерчески доступны16. Этот chelator не был коммерчески доступен, когда мы впервые вывели этот протокол. Наконец, хотя мы используем параформальдегид в качестве фиксатора в этом протоколе, клетки могут быть исправлены с метанолом, который также устраняет шаг пермяки. Фиксация с метанолом может быть полезна, если кто-то хочет объединить иммунофлуоресцентное окрашивание специфических клеточных белков с включением EdU.
Одним из недостатков этого метода является потенциальная цитотоксичность EdU, особенно при непрерывной маркировке с EdU в течение нескольких дней, в отличие от импульсной этикетки часов. В зависимости от используемых клеток, EdU было установлено, что причиной ареста клеточного цикла или даже апоптоза17. Эта токсичность, как полагают, из-за дефектной репликации ДНК от добавления искусственных нуклеозидов18. Исследования показали, что эта токсичность зависит от клеточной линии и зависит концентрация17. Мы не наблюдали никаких проблем с токсичностью в наших исследованиях.
Таким образом, измерение распространения с помощью EdU и нажмите химии имеет ряд преимуществ по сравнению с другими широко используемыми методами, такими как BrdU или 3H-тимидин включения. К ним относятся избегание радиоактивности, высокая специфичность с низким фоном, и нет необходимости в суровых шагах денатурации. После создания, нажмите химии является весьма универсальным, и может быть легко изменен для метаболической маркировки РНК, белка, жирных кислот и углеводов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Мы благодарим Кэти Кэрролл за техническую помощь. Мы также благодарим д-ра Дэвида Cool и Лаборатории анализа протеомики за обучение и предоставление считывателя пластин цитирования изображений Cytation. Эта работа была поддержана грантом Государственного фонда Райта (L.E.W.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine | Carbosynth | NE08701 | |
| biotin picolyl azide | Click Chemistry Tools | 1167-5 | |
| CuSO4 | Fisher Scientific | C1297-100G | |
| Cy3 picolyl azide | Click Chemistry Tools | 1178-1 | |
| Cytation Plate Reader | Biotek | ||
| EVOS Microscope | Thermo Fisher Scientific | ||
| Hydrogen peroxide solution | Sigma-Aldrich | 216763 | |
| Na ascorbate | Sigma-Aldrich | 11140-250G | |
| NucBlue Fixed Cell Stain Ready Probes | Invitrogen | R37606 | DAPI nuclear stain |
| Odyssey Blocking Buffer | Li-Cor | 927-40000 | blocking buffer |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Services | 15710 | |
| PBS | Fisher Scientific | SH3002802 | |
| Sodium Chloride | Sigma Life Science | S3014-5kg | |
| Streptavidin Horseradish Peroxidase Conjugate | Life Technologies | S911 | |
| Super Signal ELISA Femto | Thermo Scientific | PI137075 | ELISA substrate |
| Synergy Plate Reader | Biotek | ||
| THPTA | Click Chemistry Tools | 1010-100 | |
| Tris Hydroxymethyl Aminomethane Hydrochloride (Tris-HCl) | Fisher Scientific | BP153-500 | |
| Triton X 100 | Bio-Rad | 1610407 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-100 |
References
- Fuster, J. J., et al. Control of cell proliferation in atherosclerosis: Insights from animal models and human studies. Cardiovascular Research. 86 (2), 254-264 (2010).
- Zhu, J., Thompson, C. B. Metabolic regulation of cell growth and proliferation. Nature Reviews Molecular Cell Biology. , (2019).
- Cizek, S. M., et al. Risk factors for atherosclerosis and the development of preatherosclerotic intimal hyperplasia. Cardiovascular pathology the Official Journal of the Society for Cardiovascular Pathology. 16 (6), 344-350 (2007).
- Romar, G. A., Kupper, T. S., Divito, S. J. Research techniques made simple: Techniques to assess cell proliferation. Journal of Investigative Dermatology. 136, e1-e7 (2016).
- Quah, B. J. C., Parish, C. R. The Use of Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester (CFSE) to Monitor Lymphocyte Proliferation. Journal of Visualized Experiments. 44, 4-7 (2010).
- Sletten, E., Bertozzi, C. R. Bioorthogonal Chemistry: Fishing for Selectivity in a Sea of Functionality. Angewandte Chemie International Edition. 48 (38), 6974-6998 (2009).
- Cecchini, M. J., Amiri, M., Dick, F. A. Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells. Journal of Visualized Experiments. (59), 1-7 (2012).
- Clarke, S. T., Calderon, V., Bradford, J. A. Click Chemistry for Analysis of Cell Proliferation in Flow Cytometry. Current Protocols in Cytometry. 82 (1), (2017).
- Jiang, H., et al. Monitoring dynamic glycosylation in vivo using supersensitive click chemistry. Bioconjugate Chemistry. 25 (4), 698-706 (2014).
- Izquierdo, E., Delgado, A.
- Jao, C. Y., Salic, A. Exploring RNA transcription and turnover in vivo by using click chemistry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (41), 15779-15784 (2008).
- Hong, V., Steinmetz, N. F., Manchester, M., Finn, M. G. Labeling Live Cells by Copper-Catalyzed Alkyne-Azide Click Chemistry. Bioconjugate Chemistry. 21 (10), 1912-1916 (2011).
- Arumugam, P., Carroll, K. L., Berceli, S. A., Barnhill, S., Wrenshall, L. E. Expression of a Functional IL-2 Receptor in Vascular Smooth Muscle Cells. The Journal of Immunology. 202 (3), 694-703 (2019).
- Stoddart, M. J. Mammalian cell viability: methods and protocols. , Humana Press. New York, NY. (2011).
- Uttamapinant, C., Tangpeerachaikul, A., Grecian, S., Clarke, S., Singh, U. Fast, Cell-compatible Click Chemistry with Copper-chelating Azides for Biomolecular Labeling. Angewandte Chemie International Edition. 154 (11), 2262-2265 (2012).
- Bescancy-Webler, C., et al. Raising the Efficacy of Bioorthogonal Click Reactions for Bioconjugation: A Comparative Study. Angewandte. Chemie International Edition. 50 (35), 8051-8056 (2011).
- Diermeier-Daucher, S., et al. Cell type specific applicability of 5-ethynyl-2′-deoxyuridine (EDU) for dynamic proliferation assessment in flow cytometry. Cytometry Part A. 75 (6), 535-546 (2009).
- Cieślar-Pobuda, A., Los, M. J. Prospects and limitations of “Click-Chemistry”-based DNA labeling technique employing 5-ethynyl-2′deoxyuridine (EdU). Cytometry Part A. 83 (11), 977-978 (2013).
