Summary
Proliferatie is een essentieel onderdeel van cellulaire functie, en een gemeenschappelijke uitlezen gebruikt om te beoordelen van de potentiële toxiciteit van nieuwe geneesmiddelen. Het meten van de proliferatie is daarom een vaak gebruikte assay in celbiologie. Hier presenteren we een eenvoudige, veelzijdige methode voor het meten van de proliferatie die kan worden gebruikt in aanhandige en niet-aanhantende cellen.
Abstract
Het vermogen van een cel om te vermenigvuldigen is een integraal onderdeel van de normale functie van de meeste cellen, en disregulatie van proliferatie is de kern van vele ziekteprocessen. Om deze redenen, het meten van de proliferatie is een gemeenschappelijk instrument gebruikt om te beoordelen van de functie van de cel. Celproliferatie kan eenvoudig worden gemeten door te tellen; Dit is echter een indirecte manier om de proliferatie te meten. Een veelgebruikte manier van het direct opsporen van cellen die zich voorbereiden op te splitsen is door toevoeging van gelabelde nucleoside analogen. Deze omvatten de radioactieve nucleoside analoge 3H-thymidine plus niet-radioactieve nucleoside analogen zoals 5-broom-2 ' deoxyuridine (Brdu) en 5-ethynyl-2′-deoxyuridine (EdU). De integratie van EdU wordt gedetecteerd doorklik chemie, die verschillende voordelen heeft in vergelijking met BrdU. In dit verslag bieden we een protocol voor het meten van de proliferatie door de integratie van EdU. Dit protocol bevat opties voor verschillende uitlezingen, samen met de voor-en nadelen van elk. We bespreken ook plaatsen waar het protocol kan worden geoptimaliseerd of gewijzigd om te voldoen aan de specifieke behoeften van het geplande experiment. Ten slotte raken we aan de manieren waarop dit basisprotocol kan worden aangepast voor het meten van andere celmetabolieten.
Introduction
Proliferatie is een essentieel onderdeel van cellulaire functie1,2. Beheersing van proliferatie beïnvloedt normale processen zoals ontwikkeling en pathologische processen zoals kanker en hart-en vaatziekten. Hyperkunststof groei van vasculaire gladde spiercellen, bijvoorbeeld, wordt beschouwd als een voorloper van atherosclerose3. Veranderingen in celproliferatie worden ook gebruikt om de potentiële toxiciteit van nieuwe geneesmiddelen te beoordelen. Gezien de wijdverbreide impact, is het meten van de proliferatie een pijlers van veel op cel biologie gebaseerde laboratoria.
Celproliferatie kan worden gemeten door eenvoudigweg cellen te tellen als de celpopulatie van belang vrij snel verdeelt. Voor langzamere groeicellen kunnen celtellingen minder gevoelig zijn. Proliferatie wordt vaak gemeten door opneming van gelabelde nucleoside analogen. Hoewel de gouden standaard 3H-thymidine-integratie is, komen veel laboratoria weg van deze methode gezien de beschikbaarheid van nieuwere, niet-radioactieve alternatieven. Deze omvatten cytoplasmische fluorescerende kleurstoffen, detectie van celcyclus geassocieerde eiwitten, en opname van niet-radioactieve nucleoside analogen zoals 5-broom-2 ' deoxyuridine (BrdU) en 5-ethynyl-2′-deoxyuridine (EdU)4.
Cytoplasmische kleurstoffen, zoals carboxyfluoresceïne DIACETAAT succinimidyl Ester (CFSE), detectie van proliferatie omdat de intensiteit van de kleurstof helften elke keer dat de cel verdeelt5. Deze techniek wordt vaak gebruikt in flow cytometrie voor niet-aanhandige cellen. Het is niet veel gebruikt voor aanhandige cellen, maar met de nieuwe generatie van beeldvormings plaat lezers kan dit veranderen. Detectie van celcyclus geassocieerde eiwitten door middel van op antilichamen gebaseerde technieken (Flowcytometrie, immunohistochemie, enz.) wordt vaak gebruikt voor weefsels of niet-aanhangend cellen. Deze cellen/weefsels moeten voorafgaand aan de kleuring worden vast en permeabiliseerd. Nucleoside analogen BrdU en EdU zijn vergelijkbaar in benadering van 3H-thymidine, maar zonder het ongemak van radioactiviteit. De opname van BrdU wordt gedetecteerd door anti-BrdU-antilichamen en daarom moeten de cellen voorafgaand aan de kleuring worden bevestigd en permeabiliseerd. Bovendien moeten de cellen met DNase worden behandeld om de BrdU epitope bloot te leggen.
De oprichting van EdU wordt gedetecteerd doorklik chemie, waarin alkyn en natriumazide groepen "Klik" samen in de aanwezigheid van katalytisch koper. Beide groepen kunnen dienen als het biosynthetisch opgenomen molecuul of detectie molecuul4. In de handel verkrijgbare nucleoside-analogen hebben de alkyn-groep bijgevoegd. Voor proliferatie assays, daarom, de alkyn Gefunctionaliseerde Nucleoside analoog wordt gedetecteerd door een natriumazide geconjugeerd aan een fluorescerende kleurstof of andere marker. De oprichting van EdU heeft verschillende voordelen ten opzichte van BrdU. Ten eerste, omdat alkyn-en natriumazide-groepen niet in zoogdiercellen worden aangetroffen, is deze interactie zeer specifiek met een lage achtergrond6. Omdat beide groepen klein zijn, hoeven cellen geen DNA denaturatie te ondergaan om de Nucleoside analoog bloot te leggen zoals vereist voor BrdU7. Tot slot, klik chemie is zeer veelzijdig, en kan worden gebruikt voor de metabole labeling van DNA, RNA, eiwitten, vetzuren, en koolhydraten8,9,10,11. Als het metabosch gelabelde doel van belang is op het celoppervlak, kunnen levende cellen worden gelabeld12. Bovendien kunnen cellen verder worden verwerkt voor immunofluorescentie kleuring met antilichamen.
Het volgende protocol beschrijft het gebruik van EdU-integratie en klik op chemie om proliferatie in menselijke vasculaire gladde spiercellen te meten (Figuur 1). We tonen drie verschillende manieren waarop de integratie van EdU kan worden gemeten, representatieve resultaten van elk, en hun voor-en nadelen. Het meten van proliferatie via Klik chemie is vooral handig voor aanhangend, langzamer groeiende cellen. Daarnaast is de morfologie van de cel goed onderhouden en kan ook op antilichamen gebaseerde vlekken worden uitgevoerd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. detectie van EdU met fluorescerende label
- Stock oplossingen
- Bereid een 5 mM EdU-stamoplossing voor door 12,5 mg EdU toe te voegen aan 10 mL dubbel gedestilleerd H2O.
- Bereid de etiketteringsoplossing componenten: 200 mM tris (3-hydroxypropyltriazolylmethyl) amine (THPTA) (100 mg in 1,15 mL H2o), 100 mm CuSO4 (15,95 mg in 1 ml h2o; vers maken), 10 mm Cy3 picolyl-azide (1 mg in 95,3 ml h2o , opgeslagen in 5 μL aliquots bij-20 °C) en 1 M Natriumascorbaat (200 mg in 1 mL H2O; vers maken).
- Bereid de resazurin stockoplossing voor met een concentratie van 0,15 mg/mL. Filter steriliseren en bewaar 1 mL aliquots bij 4 °C.
Opmerking: Picolyl natriumazide is beschikbaar geconjugeerd aan verschillende Fluors, Biotine en mierikswortelperoxidase (HRP).
- Etiket vasculaire gladde spiercellen (VSMC) met EdU.
Opmerking: menselijke Vsmc's werden geïsoleerd van de iliacale slagaders via uitgroei van explanted stukjes weefsel. Wanneer geteeld in serum vrije media met insuline, transferrin, selenium deze cellen Express VSMC markers smoothelin, gladde spier myosin zware keten (SM-MHC) en SMC αactin13.- Plaat vasculaire gladde spiercellen op 2 x 104/ml in dulbecco's gemodificeerde eagle's medium (DMEM) in een 96 goed plaat.
Opmerking: cellen worden geteeld op 37 ° c in gladde spieren celmedia met 2% foetaal runderserum. - Optionele Laat enkele uren om te overnachten voor hechting. Voeg aan elke put 20 μL resazurin voorraad toe. Incuberen bij 37 °C gedurende 3 uur. Lees het fluorescentie signaal in een plaat lezer (560ex, 594em). Vervang media door Fresh DMEM.
Opmerking: deze stap is optioneel. Resazurin wordt gebruikt om celaantallen te normaliseren en rekening te brengen voor goed-tot-goed variabiliteit in plating14. - Voeg fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) of bloedplaatjes afgeleide groeifactor (PDGF) 30 ng/mL toe aan 3 − 6 putjes per behandeling aan het begin van de kweekperiode en inincuberen voor 72 h.
- Verdun 5 mM EdU-kolf tot 1 mM. Voeg 2 μL toe aan elk goed (eindconcentratie 20 μM) voor de laatste 24 uur van de cultuur periode van 72 uur. Voeg EdU niet toe aan één set replicaten. Deze putten zullen worden gebruikt om de achtergrond fluorescentie/luminescentie te bepalen.
Opmerking: de duur van de cultuur en labeling met EdU is geoptimaliseerd voor gladde spiercellen, maar moet mogelijk per celtype worden gewijzigd.
- Plaat vasculaire gladde spiercellen op 2 x 104/ml in dulbecco's gemodificeerde eagle's medium (DMEM) in een 96 goed plaat.
- Corrigeer cellen in Paraformaldehyde (PFA).
- Verwijder media en voeg 150 μL van 4% PFA (in PBS) per goed toe gedurende 10 min bij kamertemperatuur.
- Verwijder PFA en voeg 150 μL van 1% polyethyleenglycol tert-octylfenyl ether (TX-100) (in water) per put gedurende 30 min bij kamertemperatuur toe.
- Verwijder TX-100 door drie keer te wassen met PBS.
Let op: PFA is giftig, voorzichtig behandelen.
Opmerking: het protocol kan hier worden onderbroken. Vaste cellen kunnen worden opgeslagen in PBS bij 4 °C.
- Detecteer opgenomen EdU.
- Maak een etiketteringsoplossing (10 mL per 96 boorput, met behulp van Inner 60 Wells) vlak voor gebruik door het toevoegen van reagentia uit stamoplossingen in de volgende volgorde: THPTA 20 μL, CuSO4 20 μl, Cy3 picolyl natriumazide 5 μl, na ascorbaat 100 ΜL naar PBS voor een totaal volume van 10 ml.
- Verwijder PBS uit Wells en voeg 150 μL etiketteringsoplossing toe aan elk putje. Inincuberen 30 min bij 37 °C. Om alle kernen te detecteren, Voeg 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) toe aan elk goed. Lees op een fluorescentie plaat lezer (Cy3 550ex, 570em; DAPI 350ex, 470em) of afbeelding op een microscoop.
Opmerking: het protocol kan hier worden onderbroken. Vaste en gekleurde cellen kunnen worden opgeslagen in PBS bij 4 °C en op een later tijdstip worden afgebeeld.
2. detectie van EdU met luminescentie
- Voltooi de secties 1.1 – 1.3.
- Bereid tris-gebufferde zoutoplossing met 0,1% Polysorbaat 20 (TBST).
- Blok putten.
- Voeg 150 μL blokkerende buffer (tabel met materialen) toe aan elk goed en inbroed gedurende 90 minuten bij kamertemperatuur.
- Verwijder de blokkeerbuffer en was driemaal met 200 μL PBS.
- Detecteer opgenomen EdU.
- Maak etiketteringsoplossing zoals aangegeven in stap 1.4.1, vervangen Biotine picolyl natriumazide voor Cy3 picolyl natriumazide.
- Wasputten vijf maal met 200 μL TBST, met schudden, 3 min per wasbeurt.
- Quench endogene peroxiasen met 150 μL 0,3% H2O2 gedurende 20 min bij kamertemperatuur.
- Verwijder H2O2 en was vijf maal met 200 μL TBST, met 3 minuten schudden per wasbeurt.
- Verdun streptavidine-mierikswortelperoxidase (SA-HRP; 1:200) in TBST en voeg 50 μL toe aan elk goed. Incuberen 1 uur bij kamertemperatuur.
- Was vijf maal met 200 μL TBST, met schudden, 3 min per wasbeurt.
- Voeg aan elk goed 50 μL chemiluminescentie-enzym-gebonden immunosorbens assay (ELISA) substraat (tabel van materialen) toe.
- Lees onmiddellijk in de plaat lezer die de luminescentie kan detecteren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In Figuur 2tonen we de uitkomsten van drie verschillende experimenten die de proliferatie van VSMC in reactie op pdgf meten. Na het kweken van de cellen in Media geformuleerd voor Smc's, hebben we het experiment uitgevoerd in serum vrije DMEM, om mogelijke effecten van serum of groeifactoren op proliferatie te elimineren. In Figuur 2a vergelijken we resultaten, van hetzelfde experiment, met behulp van een fluorescerende VS luminescente uitlezen. Om deze platen te lezen, gebruikten we een multimode microplaat Reader die absorptie, fluorescentie en luminescentie kan lezen (Zie tabel van materialen).
Met behulp van de Plate Reader in de scan goed modus, fluorescerende lezingen worden gemiddeld over de hele put. Deze modus verlicht mogelijke onnauwkeurigheden als gevolg van verschillen tussen het centrum en de randen van de put. Als echter zeer weinig kernen positief zijn, onderschat de resultaten op deze manier waarschijnlijk het "aantal" positieve cellen wanneer slechts een paar positief zijn. Getal, met deze uitlezen, betekent fluorescentie ten opzichte van die van een ander goed, en niet exacte celaantallen. Bovendien, als er een vezel of een klomp dode cellen die fluorescentie pikt, dit zal worden opgenomen in het gebied scan. Echter, het voordeel van het gebruik van de plaat lezer is tijd. Terwijl lezen in de scanmodus duurt 15 − 20 seconden per put, het is geautomatiseerd in tegenstelling tot de persoonlijke tijd-intensieve methode van het maken van Foto's en analyseren met behulp van imaging software.
Om mogelijke onderschattingen van de bovenstaande methode te corrigeren, hebben we de fluorescerende scan omgezet naar een homogene, vloeibare uitlezen waarbij cellen die EdU gebruiken worden gedetecteerd met een azide-Biotine-groep, die op zijn beurt wordt gedetecteerd met streptavidin-mierikswortelperoxidase (Zie Figuur 1). De hoeveelheid mierikswortelperoxidase wordt vervolgens gekwantificeerd met behulp van een standaard substraat opgemaakt voor ELISA. Het voordeel van deze techniek is een meer homogene uitlezen, en Figuur 2a, B toont voorbeelden van experimenten waar deze methode werd gebruikt. Bovendien kan de plaat in enkele seconden worden afgelezen. Er zijn echter nadelen aan deze methode. Ten eerste is de achtergrond met deze methode hoger dan bij fluorescentie. Om de achtergrond te verkleinen, hebben we een blokkerende stap en meerdere spoelingen opgenomen. Als een reflectie van deze achtergrond, negatieve controles (onbehandelde cellen) hebben de neiging om hoger te zijn, en de vouw toename van de proliferatie is lager. Ten tweede, net als bij de fluorescentie-uitlezen, zullen alle vezels of dode cellen die de detectie reagentia oppakken, de totale luminescentie toevoegen.
In een poging om de variabiliteit in de bovenstaande experimenten te verminderen, hebben we onze resultaten genormaliseerd naar het eerste celaantal. Voor proliferatie assays, normalisatie moet worden gedaan op levende cellen aan het begin van de assay voordat de cellen verdelen. Bovendien kan de bepaling geen invloed hebben op de celfunctie of de opname van EdU. Gezien deze beperkingen, kozen we voor het gebruik van metabolisme als een afspiegeling van het aantal cellen via resazurin14. Resultaten met en zonder normalisering worden weergegeven in Figuur 2b. In een aparte reeks experimenten vonden we echter dat deze methode niet gevoelig genoeg is om kleine verschillen in celaantallen te detecteren. Bovendien introduceert elke fout in deze uitlezen meer fout in het hele experiment. Om deze redenen hebben we gekozen om buitengewone zorg te nemen om de cellen zo gelijkmatig mogelijk te maken, en geen normaliserings stap uit te voeren.
Om er zeker van te zijn dat we de meest nauwkeurige resultaten kregen, zijn we teruggekeerd naar fluorescerende kleuring (sectie 1) en cellen tellen met behulp van een omgekeerde fluorescentiemicroscoop. Het voordeel van deze methode is dat men de positieve cellen fysiek kan zien en tellen, wat de meest nauwkeurigheid waarborgt (Figuur 3). Elk fluorescerende puin kan worden uitgesloten van de telling. Achtergrond telt zonder EdU zijn 0 omdat er geen zichtbare fluorescentie is en daarom geen achtergrond om af te trekken. Het belangrijkste nadeel van deze methode is tijd. Om kernen te tellen in cellen die zijn verguld in een 96 goed bord, nemen we 3 Foto's per goed van zowel EdU-positieve cellen als totale cellen (DAPI), die 6-afbeeldingen per put vereisen. We nemen Foto's verticaal van het middengedeelte van de top tot de bodem van de put, en zorgen er niet voor dat ze twee keer overlappen en cellen tellen. Het tellen van totale cellen geeft ons een tweede stukje gegevens dat onze proliferatie resultaten bevestigt. Echter, in het licht van de relatief langzame verdubbelingstijd van VSMC (36 − 48 h) is de vouw toename in totale cellen gestimuleerd met PDGF VS-besturingselementen veel lager dan de vouw toename van EdU-positieve cellen, daarom meten we de opname van EdU (figuur 2c).
De meest efficiënte en nauwkeurige manier om EdU-positieve en totale cellen te tellen, is door een beeldvormings plaat lezer te gebruiken. Deze methode combineert de nauwkeurigheid van het tellen met de snelheid van automatisering. Het grootste nadeel is dat dit stuk apparatuur niet beschikbaar is bij elke instelling. Bij het vergelijken van geautomatiseerde versus handmatige tellingen was het aantal positieve handmatige EdU-telling in wezen identiek aan het geautomatiseerde aantal (figuur 2c, links), evenals het totale aantal ongestimuleerde tellingen (figuur 2c, rechts). De handmatige telling was echter lager dan de geautomatiseerde telling in de totale pdgf-gestimuleerde cellen. Dit verschil heeft waarschijnlijk betrekking op celgroei patronen. Omdat de cellen de neiging hebben om te groeien in het midden van de put, met kleinere aantallen de geautomatiseerde en handmatige tellingen waren bijna identiek. Echter, met hogere aantallen waren er waarschijnlijk meer cellen aan de randen en de handmatige tellingen, die cellen aan de periferie van de put niet veroverden, waren minder nauwkeurig.
Figuur 1: overzicht van EdU-detectie door fluorescentie of luminescentie.
VSMC of andere aanhangend cellen worden behandeld onder de voorwaarden van belang. EdU wordt toegevoegd voor de laatste 24 h van de cultuur periode en opgenomen in het DNA van het verdelen van cellen. De ingebouwde EdU wordt vervolgens gedetecteerd met behulp van fluorescentie (protocol sectie 1) of luminescentie (protocol sectie 2). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: proliferatie meten met verschillende uitlezingen met behulp van de integratie van EdU en klik chemie.
(A) vsmc's werden gekweekt in de aanwezigheid of afwezigheid van pdgf. EdU werd toegevoegd de laatste 24 h van cultuur, en de opname werd gedetecteerd door ofwel fluorescentie (protocol sectie 1) of luminescentie (protocol sectie 2). B) vsmc's werden behandeld zoals beschreven in panel A, en de opname van EdU werd gemeten met luminescentie. Resultaten werden genormaliseerd naar initiële celtellingen met behulp van resazurin levensvatbaarheid assay. C) vsmc's werden behandeld als in panel A, en de opname van EdU werd gemeten met fluorescentie. EdU-positieve cellen werden automatisch geteld met behulp van een Imaging Plate Reader, of handmatig door Imaging en vervolgens te tellen met behulp van imaging software. Getoonde resultaten zijn de gemiddelde ± standaarddeviatie van 3 – 6 replicaties per behandeling.
Afbeelding 3: visualisatie van EdU-positieve cellen na klik fluorescentie protocol.
VSMC werden behandeld zoals beschreven in Figuur 2, en opgenomen EdU werd gedetecteerd met behulp van fluorescentie (protocol sectie 1). Elk beeld is een enkele put van een 96 goed plaat. De totale kernen worden blauw (DAPI) en EdU-positieve kernen groen weergegeven. Schaalbalk = 50 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De integratie van EdU is een eenvoudige en ongecompliceerde manier om celproliferatie te meten; het is vooral handig voor het aanhechting van cellen13. Ons protocol maakt gebruik van gladde spiercellen, maar het is van toepassing op elke aanhandige cel (epitheliale, endotheel, enz.). Hoewel het protocol niet ingewikkeld is, is het een cruciale stap om de etiketteringsoplossing te maken-de ingrediënten moeten in de aangegeven volgorde worden toegevoegd. Bovendien, zoals chemiluminescentie Western blots, als het gebruik van de luminescentie uitlezen moet de plaat onmiddellijk worden gelezen.
Verschillende onderdelen van het protocol kunnen naar behoefte worden aangepast of geoptimaliseerd. Een deel is de duur van de incubatie met EdU. Omdat ons doel was om zo veel mogelijk prolifererende cellen te detecteren, hebben we EdU toegevoegd voor een volledige 24 uur voorafgaand aan de vaststelling en kleuring. Deze timing meet echter waarschijnlijk cellen in zowel S-als G2/M-fasen. Om alleen cellen in de S-fase te labelen, adviseert Cecchini et al. dat zelfs langzaam verdelen cellen worden geïnineerd met EdU voor niet langer dan 6 uur7. Een ander deel van het protocol dat kan worden geoptimaliseerd is de hoeveelheid chelator. Alkyne-azide-reacties vereisen een koperen katalysator (CuSO4). THPTA is een koperen chelator die koper in de noodzakelijke oxidatietoestand onderhoudt. De verhouding van chelator tot koper kan worden gevarieerd, om alkyne-azide binding te verhogen. We observeren felle kleuring met een chelator: koper verhouding van 2:1, in de context van ook met behulp van picolyl azide. De picolyl-groep voegt chelaat-activiteit toe die de concentratie van koper vermindert en de efficiëntie van de reactie15verhoogt. Chelator: koper ratio's kunnen worden verhoogd, meestal tot 5:1, om te optimaliseren per onderzoeker behoeften. Een betere chelator, 2-[4-({bis [(1-tert-butyl-1H-1, 2, 3-triazol-4-yl) methyl] amino} methyl)-1H-1, 2, 3-triazol-1-yl] azijnzuur (BTTAA), is nu commercieel beschikbaar16. Deze chelator was niet commercieel beschikbaar toen we dit protocol voor het eerst afgeleide. Tot slot, hoewel we gebruik maken van Paraformaldehyde als fixeermiddel in dit protocol, kunnen cellen worden opgelost met methanol, waardoor ook de permeabilization stap wordt voor de oplossing. Het oplossen met methanol kan nuttig zijn als men immunofluorescentie kleuring van specifieke cellulaire eiwitten wil combineren met de opname van EdU.
Een nadeel van deze methode is de potentiële cytotoxiciteit van EdU, in het bijzonder bij continu labelen met EdU voor dagen in tegenstelling tot een puls-label van uren. Afhankelijk van de gebruikte cellen, is EdU gevonden om celcyclus arrestatie of zelfs apoptosis17te veroorzaken. Deze toxiciteit wordt verondersteld te wijten aan defecte DNA-replicatie van de toevoeging van kunstmatige nucleosiden18. Studies hebben aangetoond dat deze toxiciteit cellijn afhankelijke en concentratieafhankelijke17. We hebben geen problemen met toxiciteit in onze studies observeren.
Samenvattend, het meten van de proliferatie via EdU en klik chemie heeft verschillende voordelen ten opzichte van andere veelgebruikte methoden zoals BrdU of 3H-thymidine incorporatie. Deze omvatten het vermijden van radioactiviteit, hoge specificiteit met een lage achtergrond, en geen behoefte aan harde denaturatiestappen. Eenmaal vastgesteld, klik chemie is zeer veelzijdig, en kan gemakkelijk worden aangepast voor de metabole labeling van RNA, eiwitten, vetzuren, en koolhydraten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij danken Katie Carroll voor technische assistentie. We danken ook Dr. David cool en het Proteomics Analyselaboratorium voor instructie over en het leveren van de Cytation Imaging Plate Reader. Dit werk werd gesteund door een subsidie van de Wright State Foundation (aan L.E.W.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine | Carbosynth | NE08701 | |
| biotin picolyl azide | Click Chemistry Tools | 1167-5 | |
| CuSO4 | Fisher Scientific | C1297-100G | |
| Cy3 picolyl azide | Click Chemistry Tools | 1178-1 | |
| Cytation Plate Reader | Biotek | ||
| EVOS Microscope | Thermo Fisher Scientific | ||
| Hydrogen peroxide solution | Sigma-Aldrich | 216763 | |
| Na ascorbate | Sigma-Aldrich | 11140-250G | |
| NucBlue Fixed Cell Stain Ready Probes | Invitrogen | R37606 | DAPI nuclear stain |
| Odyssey Blocking Buffer | Li-Cor | 927-40000 | blocking buffer |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Services | 15710 | |
| PBS | Fisher Scientific | SH3002802 | |
| Sodium Chloride | Sigma Life Science | S3014-5kg | |
| Streptavidin Horseradish Peroxidase Conjugate | Life Technologies | S911 | |
| Super Signal ELISA Femto | Thermo Scientific | PI137075 | ELISA substrate |
| Synergy Plate Reader | Biotek | ||
| THPTA | Click Chemistry Tools | 1010-100 | |
| Tris Hydroxymethyl Aminomethane Hydrochloride (Tris-HCl) | Fisher Scientific | BP153-500 | |
| Triton X 100 | Bio-Rad | 1610407 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-100 |
References
- Fuster, J. J., et al. Control of cell proliferation in atherosclerosis: Insights from animal models and human studies. Cardiovascular Research. 86 (2), 254-264 (2010).
- Zhu, J., Thompson, C. B. Metabolic regulation of cell growth and proliferation. Nature Reviews Molecular Cell Biology. , (2019).
- Cizek, S. M., et al. Risk factors for atherosclerosis and the development of preatherosclerotic intimal hyperplasia. Cardiovascular pathology the Official Journal of the Society for Cardiovascular Pathology. 16 (6), 344-350 (2007).
- Romar, G. A., Kupper, T. S., Divito, S. J. Research techniques made simple: Techniques to assess cell proliferation. Journal of Investigative Dermatology. 136, e1-e7 (2016).
- Quah, B. J. C., Parish, C. R. The Use of Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester (CFSE) to Monitor Lymphocyte Proliferation. Journal of Visualized Experiments. 44, 4-7 (2010).
- Sletten, E., Bertozzi, C. R. Bioorthogonal Chemistry: Fishing for Selectivity in a Sea of Functionality. Angewandte Chemie International Edition. 48 (38), 6974-6998 (2009).
- Cecchini, M. J., Amiri, M., Dick, F. A. Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells. Journal of Visualized Experiments. (59), 1-7 (2012).
- Clarke, S. T., Calderon, V., Bradford, J. A. Click Chemistry for Analysis of Cell Proliferation in Flow Cytometry. Current Protocols in Cytometry. 82 (1), (2017).
- Jiang, H., et al. Monitoring dynamic glycosylation in vivo using supersensitive click chemistry. Bioconjugate Chemistry. 25 (4), 698-706 (2014).
- Izquierdo, E., Delgado, A. Click chemistry in sphingolipid research. Chemistry and Physics of Lipids. 215, 71-83 (2018).
- Jao, C. Y., Salic, A. Exploring RNA transcription and turnover in vivo by using click chemistry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (41), 15779-15784 (2008).
- Hong, V., Steinmetz, N. F., Manchester, M., Finn, M. G. Labeling Live Cells by Copper-Catalyzed Alkyne-Azide Click Chemistry. Bioconjugate Chemistry. 21 (10), 1912-1916 (2011).
- Arumugam, P., Carroll, K. L., Berceli, S. A., Barnhill, S., Wrenshall, L. E. Expression of a Functional IL-2 Receptor in Vascular Smooth Muscle Cells. The Journal of Immunology. 202 (3), 694-703 (2019).
- Stoddart, M. J. Mammalian cell viability: methods and protocols. , Humana Press. New York, NY. (2011).
- Uttamapinant, C., Tangpeerachaikul, A., Grecian, S., Clarke, S., Singh, U. Fast, Cell-compatible Click Chemistry with Copper-chelating Azides for Biomolecular Labeling. Angewandte Chemie International Edition. 154 (11), 2262-2265 (2012).
- Bescancy-Webler, C., et al. Raising the Efficacy of Bioorthogonal Click Reactions for Bioconjugation: A Comparative Study. Angewandte. Chemie International Edition. 50 (35), 8051-8056 (2011).
- Diermeier-Daucher, S., et al. Cell type specific applicability of 5-ethynyl-2′-deoxyuridine (EDU) for dynamic proliferation assessment in flow cytometry. Cytometry Part A. 75 (6), 535-546 (2009).
- Cieślar-Pobuda, A., Los, M. J. Prospects and limitations of “Click-Chemistry”-based DNA labeling technique employing 5-ethynyl-2′deoxyuridine (EdU). Cytometry Part A. 83 (11), 977-978 (2013).
