Summary
La proliferazione è una parte fondamentale della funzione cellulare e una lettura comune utilizzata per valutare la potenziale tossicità di nuovi farmaci. Misurare la proliferazione è, quindi, un saggio frequentemente usato nella biologia cellulare. Qui presentiamo un metodo semplice e versatile di misurazione della proliferazione che può essere utilizzato in cellule aderenti e non aderenti.
Abstract
La capacità di una cellula di proliferare è parte integrante della normale funzione della maggior parte delle cellule, e la disregolazione della proliferazione è al centro di molti processi di malattia. Per questi motivi, la misurazione della proliferazione è uno strumento comune utilizzato per valutare la funzione cellulare. La proliferazione cellulare può essere misurata semplicemente contando; tuttavia, questo è un mezzo indiretto per misurare la proliferazione. Un mezzo comune per rilevare direttamente le cellule che si preparano a dividersi è l'incorporazione di analoghi nucleoside etichettati. Questi includono il nucleoside radioattivo analogico 3H-thymidine più analoghi nucleoside non radioattivi come la deossiuridina 5-bromo-2' (BrdU) e 5-ethynyl-2-deoxyuridina (EdU). L'incorporazione di EdU è rilevata dalla chimica del click, che ha diversi vantaggi rispetto a BrdU. In questa relazione, forniamo un protocollo per misurare la proliferazione con l'incorporazione di EdU. Questo protocollo include opzioni per varie letture, insieme ai vantaggi e agli svantaggi di ciascuna. Discutiamo anche dei luoghi in cui il protocollo può essere ottimizzato o modificato per soddisfare le esigenze specifiche dell'esperimento pianificato. Infine, tocchiamo i modi in cui questo protocollo di base può essere modificato per misurare altri metaboliti cellulari.
Introduction
La proliferazione è una parte fondamentale della funzione cellulare1,2. Il controllo della proliferazione influenza i normali processi come lo sviluppo e i processi patologici come il cancro e le malattie cardiovascolari. La crescita iperplastica delle cellule muscolari lisce vascolari, per esempio, è pensata per essere un precursore dell'aterosclerosi3. I cambiamenti nella proliferazione cellulare sono utilizzati anche per valutare la potenziale tossicità di nuovi farmaci. Dato il suo impatto diffuso, la misurazione della proliferazione è un pilastro di molti laboratori basati sulla biologia cellulare.
La proliferazione cellulare può essere misurata semplicemente contando le cellule se la popolazione cellulare di interesse si divide abbastanza rapidamente. Per le cellule a crescita più lenta, i conteggi delle cellule possono essere meno sensibili. La proliferazione è spesso misurata dall'incorporazione di analoghi nucleoside etichettati. Anche se il gold standard è di 3H-tiofina, molti laboratori si stanno allontanando da questo metodo data la disponibilità di alternative più recenti e non radioattive. Questi includono coloranti fluorescenti citoplasmici, rilevamento di proteine associate al ciclo cellulare e incorporazione di analoghi nucleoside non radioattivi come la deossiuridina 5-bromo-2' (BrdU) e 5-ethynyl-2-deoxyuridina (EdU)4.
I coloranti citoplasmici, come carboxyfluorescein diacetate succinimidil ester (CFSE), rilevano la proliferazione perché l'intensità del coloranti si dimezza ogni volta che la cellula si divide5. Questa tecnica è comunemente utilizzata nella citometria di flusso per le cellule non aderenti. Non è stato utilizzato molto per le cellule aderenti, ma con la nuova generazione di lettori di lastre di imaging questo può cambiare. La rilevazione delle proteine associate al ciclo cellulare attraverso tecniche basate su anticorpi (citometria di flusso, immunoistochimica, ecc.) è spesso utilizzata per tessuti o cellule non aderenti. Queste cellule/tessuti devono essere fissi e permeabilizzati prima della colorazione. Gli analoghi Nucleoside BrdU ed EdU sono simili nell'approccio a 3H-tiofina, ma senza l'inconveniente della radioattività. L'incorporazione di BrdU viene rilevata dagli anticorpi anti-BrdU, e quindi le cellule devono essere fisse e permeaabilizzate prima della colorazione. Inoltre, le cellule devono essere trattate con DNase per esporre l'epitopo BrdU.
L'incorporazione di EdU viene rilevata dalla chimica del click, in cui i gruppi alkyne e azide "click" insieme in presenza di rame catalitico. Entrambi i gruppi possono servire come molecola biosinteticamente incorporata o molecola di rilevamento4. Gli analoghi nucleoside disponibili in commercio hanno il gruppo alchino attaccato. Per i test di proliferazione, quindi, l'analogo nucleoside funzionalizzato alkyne viene rilevato da un'azide coniugata a un colore fluorescente o a un altro marcatore. L'incorporazione di EdU ha diversi vantaggi rispetto a BrdU. In primo luogo, perché i gruppi di alchine e azide non si trovano nelle cellule dei mammiferi, questa interazione è altamente specifica con uno sfondo basso6. Poiché entrambi i gruppi sono piccoli, le cellule non hanno bisogno di sottoporsi alla denaturazione del DNA per esporre l'analogo nucleoside come richiesto per BrdU7. Infine, la chimica del clic è altamente versatile e può essere utilizzata per l'etichettatura metabolica di DNA, RNA, proteine, acidi grassi e carboidrati8,9,10,11. Se l'obiettivo metabolicamente etichettato di interesse è sulla superficie cellulare, le cellule vive possono essere etichettate12. Inoltre, le cellule possono essere ulteriormente elaborate per la colorazione immunofluorescente con anticorpi.
Il protocollo seguente descrive l'uso dell'incorporazione EdU e la chimica dei clic per misurare la proliferazione nelle cellule muscolari lussuriane vascolari umane (Figura 1). Mostriamo tre diversi modi in cui l'incorporazione di EdU può essere misurata, risultati rappresentativi da ciascuno, e i loro vantaggi e svantaggi. Misurare la proliferazione tramite la chimica dei clic è particolarmente utile per le cellule aderenti e a bassa crescita. Inoltre, la morfologia della cellula è ben mantenuta e può anche essere eseguita una colorazione basata su anticorpi.
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Protocol
1. Rilevamento di EdU utilizzando l'etichetta fluorescente
- Soluzioni stock
- Preparare una soluzione di stock EdU da 5 mM aggiungendo 12,5 mg di EdU a 10 mL di doppia distillazione H2O.
- Preparare i componenti della soluzione di etichettatura: 200 mM tris(3-hydroxyltriazolylmethyl)ammine(THPTA) (100 mg in 1,15 mL H2O), 100 mM CuSO4 (15,95 mg in 1 mL H2O; fare fresco), 10 mM Cy3 picolyl-azide (1 mg in 95 m.O.3 M. , conservato in 5 aliquote a -20 gradi centigradi) e 1 M di ascorbate di sodio (200 mg in 1 mL H2O; fare fresco).
- Preparare la soluzione di riserva retozurin ad una concentrazione di 0,15 mg/mL. Filtrare sterilizzare e conservare 1 mLs a 4 gradi centigradi.
NOTA: l'azide Picolyl è disponibile coniugata a diversi fluor, biotina e perossidasi di rafano (HRP).
- Etichettare le cellule muscolari lisce vascolari (VSMC) con EdU.
NOTA: I VSMC umani sono stati isolati dalle arterie iliac attraverso l'escrescenza da pezzi di tessuto espiantati. Quando coltivato in supporti senza siero con insulina, transferrin, selenio queste cellule esprimono marcatori VSMC smoothelin, muscolo liscio catena pesante della miosina (SM-MHC) e SMC13.- Piastra vascolare cellule muscolari lisce a 2 x 104/ mL nel mezzo di Aquila modificato di Dulbecco (DMEM) in una piastra di 96 pozze.
NOTA: Le cellule sono coltivate a 37 gradi centigradi in supporti di cellule muscolari lisce con il 2% del siero bovino fetale. - (Facoltativo) Lasciare diverse ore a notte per l'aderenza. Aggiungete a ogni pozzo 20 stock di resazurin l.. Incubare a 37 gradi centigradi per 3 h. Leggere il segnale di fluorescenza in un lettore di lamiere (560ex, 594em). Sostituire i supporti con DMEM fresco.
NOTA: questo passaggio è facoltativo. Resazurin viene utilizzato per normalizzare i numeri di cella e spiegare la variabilità ben a pozzo nella placcatura14. - Aggiungere la salina tampone di fosfato (PBS) o il fattore di crescita derivato dalle piastrine (PDGF) 30 ng/mL a 3-6 pozzetti per trattamento all'inizio del periodo di coltura e incubare per 72 h.
- Diluire 5 mM di azioni EdU a 1 mM. Aggiungete 2 l ad ogni pozzo (concentrazione finale di 20 M) per le ultime 24 h del periodo culturale di 72 h. Non aggiungere EdU a un set di repliche. Questi pozzi saranno utilizzati per determinare la fluorescenza/luminescenza di fondo.
NOTA: la durata della coltura e dell'etichettatura con EdU è ottimizzata per le cellule muscolari lisce, ma potrebbe essere necessario modificarla per tipo di cella.
- Piastra vascolare cellule muscolari lisce a 2 x 104/ mL nel mezzo di Aquila modificato di Dulbecco (DMEM) in una piastra di 96 pozze.
- Fissare le cellule in paraformaldeide (PFA).
- Rimuovere i supporti e aggiungere 150 L del 4% PFA (in PBS) per 10 min a temperatura ambiente.
- Togliere la PFA e aggiungere 150 l una dell'1% di polietilene glicole tert-octilphenyl ether (TX-100) (in acqua) per pozzo per 30 min a temperatura ambiente.
- Rimuovere Il TX-100 lavando tre volte con PBS.
AVVISO: PFA è tossico, gestire con cura.
NOTA: il protocollo può essere messo in pausa qui. Le celle fisse possono essere conservate in PBS a 4 gradi centigradi.
- Rileva EdU incorporato.
- Fare la soluzione di etichettatura (10 mL per 96 pozze, utilizzando 60 pozzetti interni) poco prima dell'uso aggiungendo reagenti dalle soluzioni di riserva nel seguente ordine: THPTA 20 -L, CuSO4 20 L, Cy3 picolyl azide 5 - Naastabe 100 -L a PBS per un volume totale di 10 mL.
- Rimuovere pbS dai pozze e aggiungere 150 l di soluzione di etichettatura a ciascun pozzo. Incubare 30 min a 37 . Per rilevare tutti i nuclei, aggiungere 4,6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) ad ogni pozzo. Leggere su un lettore di piastra di fluorescenza (Cy3 550ex, 570em; DAPI 350ex, 470em) o immagine al microscopio.
NOTA: il protocollo può essere messo in pausa qui. Le celle fisse e colorate possono essere conservate in PBS a 4 gradi centigradi e imagetate in un secondo momento.
2. Rilevamento di EdU mediante luminescenza
- Completare le sezioni 1.1–1.3.
- Preparare la salina con buffer DiS con 0,1% di polisoro20 (TBST).
- Bloccare i pozzi.
- Aggiungete 150 l di buffer di blocco (Tabella dei materiali) ad ogni pozzo e incubate per 90 min a temperatura ambiente.
- Rimuovere il buffer di blocco e lavare tre volte con 200 l- di PBS.
- Rileva EdU incorporato.
- Fare la soluzione di etichettatura come indicato nel passaggio 1.4.1, sostituendo l'azide biotina picolile con l'azide di Cy3 picolyl.
- Lavare i pozzi cinque volte con 200 l of TBST, con agitazione, 3 minuti per lavaggio.
- Quench perossidi con 150 -L di 0,3% H2O2 per 20 min a temperatura ambiente.
- Togliere H2O2 e lavare cinque volte con 200 l- di TBST, con agitazione di 3 minuti per lavaggio.
- Diluire la perosside streptavidina-rafano (SA-HRP; 1:200) in TBST e aggiungere 50 gradi all'altro a ogni pozzo. Incubare 1 h a temperatura ambiente.
- Lavare cinque volte con 200 gradi di TBST, con agitazione, 3 min per lavaggio.
- Aggiungete ad ogni pozzo 50 -L di assegno immunosorbena legata all'enzima chemiluminescente (ELISA).
- Leggere immediatamente nel lettore di piastre in grado di rilevare la luminescenza.
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Representative Results
Nella Figura 2viene illustrato i risultati di tre diversi esperimenti che misurano la proliferazione di VSMC in risposta a PDGF. Dopo aver coltivato le cellule nei media formulati per le SMC, abbiamo condotto l'esperimento nel DMEM senza siero, per eliminare eventuali effetti potenziali del siero o dei fattori di crescita sulla proliferazione. Nella Figura 2A confrontiamo i risultati, dallo stesso esperimento, utilizzando una lettura fluorescente vs luminescente. Per leggere queste piastre, abbiamo usato un lettore di microplacche multimode in grado di leggere l'assorbimento, la fluorescenza e la luminescenza (vedi Tabella dei materiali).
Utilizzando il lettore di lastre in modalità pozzo di scansione, le letture fluorescenti vengono mediate su tutto il pozzo. Questa modalità allevia potenziali imprecisioni dovute alle differenze tra il centro e i bordi del pozzo. Tuttavia, se pochissimi nuclei sono positivi, la lettura dei risultati in questo modo probabilmente sottovaluta il "numero" delle cellule positive quando solo pochi sono positivi. Numero, con questa lettura, significa fluorescenza rispetto a quella di un altro pozzo, e non numeri di cella esatti. Inoltre, se c'è una fibra o un gruppo di cellule morte che raccoglie la fluorescenza, questo sarà incluso nella scansione della zona. Tuttavia, il vantaggio di utilizzare il lettore di lamiere è il tempo. Mentre la lettura in modalità di scansione richiede 15-20 secondi per pozzo, è automatizzato rispetto al metodo personale che richiede tempo per scattare foto e analizzarle utilizzando il software di imaging.
Per correggere le potenziali sottovalutazioni dal metodo di cui sopra, abbiamo convertito la scansione fluorescente in una lettura liquida omogenea in cui le cellule che assumono EdU vengono rilevate con una moiety azide-biotina, che a sua volta viene rilevata con perosside streptavidin-horseradish (vedere la figura 1). La quantità di perosside di rafano viene quindi quantificata utilizzando un substrato standard formattato per ELISA. Il vantaggio di questa tecnica è una lettura più omogenea, e Figura 2A,B mostra esempi di esperimenti in cui questo metodo è stato impiegato. Inoltre, la piastra può essere letta in pochi secondi. Ci sono tuttavia degli svantaggi di questo metodo. In primo luogo, lo sfondo con questo metodo è superiore rispetto alla fluorescenza. Per diminuire lo sfondo, abbiamo incorporato un passaggio di blocco e più lavatori. Come riflesso di questo sfondo, i controlli negativi (cellule non trattate) tendono ad essere più alti e l'aumento della piega nella proliferazione è inferiore. In secondo luogo, come con la lettura della fluorescenza, eventuali fibre o cellule morte che raccolgono i reagenti di rilevamento aggiungeranno alla luminescenza totale.
Nel tentativo di ridurre la variabilità negli esperimenti di cui sopra, abbiamo normalizzato i nostri risultati ai conteggi iniziali delle cellule. Per i saggi di proliferazione, la normalizzazione deve essere fatta su cellule vive all'inizio del saggio prima che le cellule si dividano. Inoltre, il saggio non può influenzare la funzione cellulare o l'incorporazione di EdU. Dati questi vincoli, abbiamo scelto di utilizzare il metabolismo come riflesso del numero di cellule tramite resazurin14. I risultati con e senza normalizzazione sono illustrati nella Figura 2B. Tuttavia, in una serie separata di esperimenti abbiamo scoperto che questo metodo non è abbastanza sensibile per rilevare piccole differenze nei numeri di cellule. Inoltre, qualsiasi errore in questa lettura introduce più errore nell'intero esperimento. Per questi motivi, abbiamo scelto di fare attenzione straordinaria alle cellule nel modo più uniforme possibile, e non eseguire una fase di normalizzazione.
Per essere sicuri che stavamo ottenendo i risultati più accurati possibili, siamo tornati alla colorazione fluorescente (sezione 1) e al conteggio delle cellule utilizzando un microscopio a fluorescenza invertito. Il vantaggio di questo metodo è che si può fisicamente vedere e contare le celle positive, garantendo la massima precisione (Figura 3). Eventuali detriti fluorescenti possono essere esclusi dal conteggio. I conteggi di sfondo senza EdU sono 0 in quanto non vi è alcuna fluorescenza visibile e quindi non c'è sfondo da sottrarre. Lo svantaggio principale di questo metodo è il tempo. Per contare i nuclei nelle cellule placcate in una piastra di 96 pozzetti, prendiamo 3 foto per pozzo sia delle cellule positive EdU che delle cellule totali (DAPI), che richiedono 6 immagini per pozzo. Prendiamo le immagini verticalmente dalla sezione centrale della parte superiore alla parte inferiore del pozzo, facendo attenzione a non sovrapporci e contare le celle due volte. Il conteggio delle cellule totali ci fornisce un secondo dato che conferma i nostri risultati di proliferazione. Tuttavia, alla luce del tempo di raddoppio relativamente lento di VSMC (36-48 h), l'aumento di piegatura delle cellule totali stimolato con PDGF vs controlli è molto inferiore all'aumento di piegatura delle cellule positive EdU, motivo per cui misuriamo l'incorporazione di EdU (Figura 2C).
Il modo più efficiente e preciso per contare le cellule positive e totali DiEd è utilizzando un lettore di lamiere di imaging. Questo metodo combina la precisione del conteggio con la velocità di automazione. L'inconveniente principale è che questo pezzo di attrezzatura non è disponibile in tutte le istituzioni. Nel confrontare i conteggi automatizzati rispetto a quelli manuali, il conteggio manuale positivo di EdU era essenzialmente identico al conteggio automatico (Figura 2C, a sinistra), così come i conteggi totali non stimolati (Figura 2C, a destra). Tuttavia, il conteggio manuale era inferiore al conteggio automatizzato nelle celle totali stimolate dal PDGF. Questa differenza probabilmente si riferisce ai modelli di crescita cellulare. Poiché le cellule tendono a crescere al centro del pozzo, con numeri più piccoli i conteggi automatici e manuali erano quasi identici. Tuttavia, con numeri più alti c'erano probabilmente più cellule ai bordi e i conteggi manuali, che non catturavano le cellule alla periferia del pozzo, erano meno accurati.
Figura 1: Panoramica del rilevamento EdU per fluorescenza o luminescenza.
VSMC o altre cellule aderenti sono trattate in condizioni di interesse. EdU viene aggiunto per le ultime 24 h del periodo di coltura e incorporato nel DNA delle cellule divisorie. L'EdU incorporato viene quindi rilevato utilizzando la fluorescenza (sezione 1 del protocollo) o la luminescenza (sezione protocollo 2). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Misurare la proliferazione con diverse letture utilizzando l'incorporazione di EdU e la chimica dei clic.
(A) Le VSMC sono state coltivate in presenza o assenza di PDGF. EdU è stato aggiunto il suo ultimo 24 h di coltura, e l'incorporazione è stata rilevata dalla fluorescenza (sezione 1) o dalla luminescenza (sezione protocollo 2). (B) Le VSMC sono state trattate come descritto nel pannello A e l'incorporazione dell'EdU è stata misurata mediante luminescenza. I risultati sono stati normalizzati ai conteggi cellulari iniziali utilizzando il saggio di resazurin viability. (C) Le VSMC sono state trattate come nel pannello A, e l'incorporazione dell'EdU è stata misurata dalla fluorescenza. Le cellule positive EdU sono state conteggiate automaticamente, utilizzando un lettore di lastre di imaging, o manualmente mediante imaging e quindi contando utilizzando software di imaging. I risultati mostrati sono la media - deviazione standard di 3-6 repliche per trattamento.
Figura 3: Visualizzazione delle cellule positive EdU in seguito al protocollo di fluorescenza dei clic.
VSMC è stato trattato come descritto nella Figura 2e l'EDU incorporato è stato rilevato utilizzando la fluorescenza (sezione 1 del protocollo). Ogni immagine è un singolo pozzo di un 96 pozzo piastra. I nuclei totali sono mostrati in blu (DAPI) e i nuclei positivi EdU sono verdi. Barra di scala : 50 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
L'incorporazione di EdU è un modo semplice e diretto per misurare la proliferazione cellulare; è particolarmente utile per le cellule aderenti13. Il nostro protocollo utilizza cellule muscolari lisce, ma è applicabile a qualsiasi cellula aderente (epiteliale, endoteliale, ecc.). Anche se il protocollo non è complicato, l'unico passo critico è fare la soluzione di etichettatura - gli ingredienti devono essere aggiunti nell'ordine elencato. Inoltre, come le macchie occidentali chemiluminescenti, se si utilizza la lettura della luminescenza la piastra deve essere letta immediatamente.
Diverse parti del protocollo possono essere modificate o ottimizzate in base alle esigenze. Una parte è la durata dell'incubazione con EdU. Poiché il nostro obiettivo era quello di rilevare il maggior numero possibile di cellule che proliferano, abbiamo aggiunto EdU per un pieno 24 h prima di fissare e colorare. Tuttavia, questo tempismo probabilmente misura le cellule in entrambe le fasi S e G2/M. Per etichettare solo le cellule in fase S, Cecchini et al. consigliano che anche lentamente dividendo le cellule essere incubato con EdU per non più di 6 ore7. Un'altra parte del protocollo che può essere ottimizzato è la quantità di chelatore. Le reazioni di alkyne-azide richiedono un catalizzatore di rame (CuSO4). THPTA è un chelatore di rame che mantiene il rame nello stato di ossidazione necessario. Il rapporto tra chelatore e rame può essere variato, per aumentare il legame alkyne-azide. Osserviamo una colorazione luminosa con un rapporto chelatore:rame di 2:1, nel contesto dell'utilizzo anche dell'azide picolyl. Il picolyl moiety aggiunge attività di chelating che diminuisce la concentrazione di rame necessario e aumenta l'efficienza della reazione15. I rapporti Chelator:copper possono essere aumentati, di solito fino a 5:1, per ottimizzare le esigenze degli investigatori. Un chelatore migliore, 2-[4-((1-tert-butyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)]amino-methyl)-1H-1,2,3-triazol-1-yl]acetic acid (BTTAA), è ora disponibile in commercio16. Questo chelatore non era disponibile in commercio quando abbiamo derivato questo protocollo. Infine, anche se usiamo la paraformaldeide come fissativo in questo protocollo, le cellule possono essere fissate con metanolo, che elimina anche la fase di permeabilizzazione. Il fissaggio con metanolo può essere utile se si vuole combinare la colorazione immunofluorescente di specifiche proteine cellulari con l'incorporazione di EdU.
Uno svantaggio di questo metodo è la potenziale citotossicità di EdU, in particolare quando l'etichettatura continua con EdU per giorni invece di un'etichetta di impulso di ore. A seconda delle cellule utilizzate, EdU è stato trovato per causare arresto del ciclo cellulare o anche apoptosi17. Si ritiene che questa tossicità sia dovuta alla replicazione del DNA difettosa dall'aggiunta di nucleolati artificiali18. Gli studi hanno dimostrato che questa tossicità è dipendente dalla linea cellulare e dipendente dalla concentrazione17. Non abbiamo osservato alcun problema di tossicità nei nostri studi.
In sintesi, misurare la proliferazione tramite EdU e fare clic chimica ha diversi vantaggi rispetto ad altri metodi comunemente utilizzati come BrdU o 3H-thymidine incorporazione. Questi includono evitare la radioattività, un'elevata specificità con sfondo basso e nessuna necessità di dure fasi di denaturazione. Una volta stabilito, la chimica dei clic è altamente versatile e può essere facilmente modificata per l'etichettatura metabolica di RNA, proteine, acidi grassi e carboidrati.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Ringraziamo Katie Carroll per l'assistenza tecnica. Ringraziamo anche il Dr. David Cool e il Laboratorio di Analisi Proteomics per l'istruzione e la fornitura del lettore di lastre di imaging Cytation. Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione della Wright State Foundation (a L.E.W.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine | Carbosynth | NE08701 | |
| biotin picolyl azide | Click Chemistry Tools | 1167-5 | |
| CuSO4 | Fisher Scientific | C1297-100G | |
| Cy3 picolyl azide | Click Chemistry Tools | 1178-1 | |
| Cytation Plate Reader | Biotek | ||
| EVOS Microscope | Thermo Fisher Scientific | ||
| Hydrogen peroxide solution | Sigma-Aldrich | 216763 | |
| Na ascorbate | Sigma-Aldrich | 11140-250G | |
| NucBlue Fixed Cell Stain Ready Probes | Invitrogen | R37606 | DAPI nuclear stain |
| Odyssey Blocking Buffer | Li-Cor | 927-40000 | blocking buffer |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Services | 15710 | |
| PBS | Fisher Scientific | SH3002802 | |
| Sodium Chloride | Sigma Life Science | S3014-5kg | |
| Streptavidin Horseradish Peroxidase Conjugate | Life Technologies | S911 | |
| Super Signal ELISA Femto | Thermo Scientific | PI137075 | ELISA substrate |
| Synergy Plate Reader | Biotek | ||
| THPTA | Click Chemistry Tools | 1010-100 | |
| Tris Hydroxymethyl Aminomethane Hydrochloride (Tris-HCl) | Fisher Scientific | BP153-500 | |
| Triton X 100 | Bio-Rad | 1610407 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-100 |
References
- Fuster, J. J., et al. Control of cell proliferation in atherosclerosis: Insights from animal models and human studies. Cardiovascular Research. 86 (2), 254-264 (2010).
- Zhu, J., Thompson, C. B. Metabolic regulation of cell growth and proliferation. Nature Reviews Molecular Cell Biology. , (2019).
- Cizek, S. M., et al. Risk factors for atherosclerosis and the development of preatherosclerotic intimal hyperplasia. Cardiovascular pathology the Official Journal of the Society for Cardiovascular Pathology. 16 (6), 344-350 (2007).
- Romar, G. A., Kupper, T. S., Divito, S. J. Research techniques made simple: Techniques to assess cell proliferation. Journal of Investigative Dermatology. 136, e1-e7 (2016).
- Quah, B. J. C., Parish, C. R. The Use of Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester (CFSE) to Monitor Lymphocyte Proliferation. Journal of Visualized Experiments. 44, 4-7 (2010).
- Sletten, E., Bertozzi, C. R. Bioorthogonal Chemistry: Fishing for Selectivity in a Sea of Functionality. Angewandte Chemie International Edition. 48 (38), 6974-6998 (2009).
- Cecchini, M. J., Amiri, M., Dick, F. A. Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells. Journal of Visualized Experiments. (59), 1-7 (2012).
- Clarke, S. T., Calderon, V., Bradford, J. A. Click Chemistry for Analysis of Cell Proliferation in Flow Cytometry. Current Protocols in Cytometry. 82 (1), (2017).
- Jiang, H., et al. Monitoring dynamic glycosylation in vivo using supersensitive click chemistry. Bioconjugate Chemistry. 25 (4), 698-706 (2014).
- Izquierdo, E., Delgado, A.
- Jao, C. Y., Salic, A. Exploring RNA transcription and turnover in vivo by using click chemistry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (41), 15779-15784 (2008).
- Hong, V., Steinmetz, N. F., Manchester, M., Finn, M. G. Labeling Live Cells by Copper-Catalyzed Alkyne-Azide Click Chemistry. Bioconjugate Chemistry. 21 (10), 1912-1916 (2011).
- Arumugam, P., Carroll, K. L., Berceli, S. A., Barnhill, S., Wrenshall, L. E. Expression of a Functional IL-2 Receptor in Vascular Smooth Muscle Cells. The Journal of Immunology. 202 (3), 694-703 (2019).
- Stoddart, M. J. Mammalian cell viability: methods and protocols. , Humana Press. New York, NY. (2011).
- Uttamapinant, C., Tangpeerachaikul, A., Grecian, S., Clarke, S., Singh, U. Fast, Cell-compatible Click Chemistry with Copper-chelating Azides for Biomolecular Labeling. Angewandte Chemie International Edition. 154 (11), 2262-2265 (2012).
- Bescancy-Webler, C., et al. Raising the Efficacy of Bioorthogonal Click Reactions for Bioconjugation: A Comparative Study. Angewandte. Chemie International Edition. 50 (35), 8051-8056 (2011).
- Diermeier-Daucher, S., et al. Cell type specific applicability of 5-ethynyl-2′-deoxyuridine (EDU) for dynamic proliferation assessment in flow cytometry. Cytometry Part A. 75 (6), 535-546 (2009).
- Cieślar-Pobuda, A., Los, M. J. Prospects and limitations of “Click-Chemistry”-based DNA labeling technique employing 5-ethynyl-2′deoxyuridine (EdU). Cytometry Part A. 83 (11), 977-978 (2013).
