Syftet med detta protokoll är att detektera olika typer av Clostridium perfringens toxinotypes i lokalt inköpta livsmedel, särskilt Epsilon-toxin som producerar stamtyper B och D, utan användning av anaeroba kammare.
Clostridium perfringens (C. perfringens) är en produktiv toxin producent och orsakar ett brett spektrum av sjukdomar i olika värdar. C. perfringens kategoriseras i fem olika toxinotypes, A till E, baserat på transporten av fyra stora toxin gener. Prevalensen och fördelningen av dessa olika toxinotyper är understuderas, särskilt deras genomträngande i amerikanska detaljhandeln livsmedel. Av särskilt intresse för oss är typ B och D stammar, som producerar Epsilon toxin, ett extremt dödligt toxin föreslog att vara miljö trigger av multipel skleros hos människor. För att utvärdera närvaron av olika C. perfringens toxinotypes i olika matprover, utvecklade vi en enkel metod för att selektivt odla dessa bakterier utan användning av en anaerob containersystem endast med tre odlings steg. Mat köps från lokala livsmedelsbutiker och transporteras till laboratoriet under omgivningsförhållanden. Proverna mals och inokuleras i modifierad snabb perfringens media (RPM) och inkuberas över natten vid 37 ° c i ett förseglat, lufttät koniskt rör. Över natten kulturer inokuleras på ett bottenskikt av solid Tryptose sulfite Cykloserin (TSC) agar, och sedan överlagras med ett toppskikt av smält TSC agar, skapa en “inklämt”, anaerob miljö. Agar plattorna inkuberas över natten vid 37 ° c och utvärderas sedan för utseendet av svarta, sulfit-reducerande kolonier. C. perfringens-misstänkta kolonier avlägsnas från TSC-agar med hjälp av sterila ögondroppers, och INOKULERAS i rpm och sub-odlade över natten vid 37 ° c i ett lufttät koniskt rör. DNA utvinns ur subkulturen rpm, och sedan analyseras för närvaron av C. perfringens toxin gener via polymeras kedjereaktion (PCR). Beroende på vilken typ av livsmedel som provtas, är typiskt 15 – 20% av proverna positiva för C. perfringens.
Clostridium perfringens (C. perfringens) är en grampositiv, anaerob, sporbildande, stavformad bakterie som påträffas överallt i omgivningen. Denna art av bakterier bär gener som kodar för över 17 gifter och, historiskt, har karakteriserats i fem toxinotypes (A-E) baserat på närvaron av fyra olika toxin gener: alfa, beta, Epsilon, och IOTA toxin (tabell 1)1. Nyligen har det föreslagits att detta typnings system måste utvidgas till att omfatta typer F och G, som hyser C. perfringens av (CPE) och NetB toxin, respektive2. Emellertid, mer forskning behövs innan detta intrigning systemet formellt accepteras. Medan alfa-toxin genen är strikt kromosomalt belägna, CPE genen kan hittas både på kromosom och plasmider. I jämförelse, de återstående toxiner gener finns på olika olikt stora plasmider. Vi är särskilt intresserade av prevalensen av C. perfringens typer B och D eftersom dessa stammar producerar Epsilon toxin, en extremt potent, Porbildande toxin, som har föreslagits att spela en roll i att utlösa multipel SKLEROS (MS) hos människor3 ,4,5,6,7. Hur människor blir smittade eller koloniseras av dessa stammar är okänd. En möjlig förklaring är genom konsumtion av förorenade livsmedelsprodukter. För att besvara denna fråga försökte vi fastställa prevalensen av olika C. perfringens toxinotypes i amerikanska livsmedelprover.
Närvaron av C. perfringens toxinotypes i amerikanska livsmedelprover är understuderat och kräver ofta användning av anaerob containersystem och många sub-odling steg8,9,10,11 . Även om många sub-odling steg behövs för att få renade isolat, denna metod kan leda till förlust av plasmider över tiden12,13,14, möjligen påverkar upptäckten av plasmid-burna toxin gener inklusive Epsilon toxin genen. Vi försökte utveckla en enkel metod, med färre sub-odling steg, att selektivt kultur C. perfringens utan användning av anaeroba kammare, burkar, eller påsar. Kortfattat, matprover inokuleras i snabb perfringens media (RPM) över natten (på), sedan “inklämt” i TSC-agar och inkuberas på. Kolonier som misstänks vara C. perfringens är sedan sub-odlade i rpm och inkuberas igen. DNA extraheras och PCR utförs för att bestämma genotyp (figur 1). Vi valde att använda RPM eftersom det har visats sig öka återhämtningen av C. perfringens stammar från matprover jämfört med andra mer standardmedier15. Dessutom användes RPM framgångsrikt för att isolera ett Epsilon-toxin som producerar typ B-stam från en MS-patient4. Vi använder en modifierad version av RPM i stället för den ursprungliga versionen för att möjliggöra enkel DNA-extraktion. Även om denna metod möjliggör enkel identifiering av toxingener inom prover, är det möjligt att ett enskilt prov kommer att innehålla mer än en C. perfringens toxinotyp. Eftersom vår metod inte isolerar renade stammar med hjälp av flera omgångar av rening, identifiering av flera toxinotypes från ett prov är inte möjligt. Men standard reningsteknik (vanligtvis strimmor på TSC plattor eller blod agar plattor) kan tillämpas i slutet av vårt protokoll för att uppnå renade kulturer.
Här beskriver vi en metod för att identifiera prevalensen av C. perfringens i detaljhandelsingredienser med begränsad subodling och utan användning av ett anaerob kammar system. Denna metod använder en kombination av tekniker för att öka identifieringen av C. perfringens från matprover. Genom att använda en modifierad version av RPM-Media tillåter vi en selektiv tillväxt av C. perfringens. Genom att sandwiching inokulerade RPM mellan lager av TSC-agar, kan vi identifiera och isolera anaeroba, sulfit-reducerande bakterier karakteristiska för C. perfringens. För att bekräfta närvaron av C. perfringens, sulfite-reducerande kolonier är sub-odlade i färskt RPM. Den modifierade versionen eller RPM gör det möjligt för oss att enkelt extrahera DNA från kulturer, vilket möjliggör PCR-bekräftelse av specifika toxgener. Bekräftelse av C. perfringens kontaminerade livsmedelprover kan uppnås inom tre dagar.
I tidiga experiment inokulerades matproverna helt enkelt i RPM och DNA som extraherades från kulturer. Denna metod resulterade i detektion av C. perfringens i ett begränsat antal prover (data ej visad). Även om RPM är selektiv för c. perfringens tillväxt, är det inte exklusivt för c. perfringens tillväxt. Andra, grampositiva, D-cycolserine resistenta bakterier kan fortfarande växa i RPM. Vi hypotesen att kontaminering av andra bakteriearter kan ha minskat vår detektion av C. perfringens stammar genom att minska känsligheten hos vår PCR-analys i vår första on rpm-kultur. Ett kritiskt steg i att öka detekteringen av C. perfringens var införandet av TSC-agar “Sandwich”-tekniken. Detta tillät oss att differentiera och välja för anaeroba, sulfit-reducerande kolonier, karakteristiska för C. perfringens. Ett avgörande steg i denna process är att säkerställa att det översta lagret av smält TSC-agar är vid 40 ° c. Även om vissa C. perfringens stammar kan växa vid förhöjda temperaturer (46 – 48 ° c)15,16, tillsats av smält agar vid förhöjda temperaturer minskar kraftigt mängden av kulturer återvinns, mest sannolikt på grund av celldöd .
Det finns flera potentiella begränsningar för denna metod. Som tidigare nämnts, varken RPM eller TSC-agar väljer eller differentierar för C. perfringens uteslutande, vilket möjliggör tillväxt av andra bakteriearter som finns i livsmedelsprov. Detta kan minska känsligheten hos analysen för att välja endast C. perfringens . Detta är dock en gemensam begränsning i nästan alla odlingstekniker. Genotypning bekräftelse av renade isolat är den bästa metoden för att slutgiltigt identifiera C. perfringens och andra bakteriearter. En annan begränsning av denna studie är att vi inte testar de renade isolaterna. Vi gjorde avsiktligt detta för att begränsa mängden subkultur, som upprepad subkultur befaras att resultera i plasmid förlust. Eftersom vi inte isolerar till renhet, är det möjligt att flera C. perfringens toxinotypes kan förekomma i samma prov eller subkultur. Om forskare vill erhålla renade isolat, kan standard reningsmetoder användas på den senaste RPM-kulturen som beskrivs i denna metod. Detta kräver vanligtvis användning av anaeroba kammare. Även om den ursprungligen användes för att isolera c. perfringens från livsmedel, kan denna metod användas för att identifiera och isolera c. perfringens från en mängd olika källor. Specifikt, en sådan tillämpning av denna metod är att testa fekal prover från människor (eller djur) som misstänks vara smittade med C. perfringens och toxinotype bakterierna att bättre förstå källan till infektionen.
The authors have nothing to disclose.
Denna forskning har inte fått någon särskild finansiering från offentliga, kommersiella eller icke-vinstdrivande sektorer.
D-Cycloserine | Sigma-Aldrich | C6880 | |
Dextrose | Sigma Life Science | D9434-250G | |
Disposable Transfer Pipets | any brand | Select one with slim tip like Thermo Scientific Disposable Transfer Pipets 137116M/EMD | |
DNeasy Blood & Tissue Kits | Qiagen | 69504 | Note: numerous DNA and plasmid extractions kits were evaluated, this kit gave the most desirable results. |
Dry Incubator | any brand | ||
Fluid thioglycolate medium | Remel | R453452 | |
Gelatin from porcine skin | Sigma Life Science | G1890-500G | |
Individual Primers | Invitrogen | ||
Iron (II) sulfate heptahydrate | Sigma Life Science | F8633-250 G | |
Lysozyme from chicken egg white | Sigma-Aldrich | L6876 | Needed for DNA extraction, not provided in kit |
microcentrifuge tube | any brand | ||
parafilm or plastic wrap | any brand | ||
Peptone from casein and other animal proteins | Sigma-Aldrich | 70173-100G | |
Perfringens Agar Base (TSC + SFP) | Oxoid | CM0587 | Make TSC agar according to instructions |
Potassium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | P2222-100G | |
Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S-7653 | |
Sterile Cell Scraper | any brand | ||
Sterile cell Spreader | any brand | ||
Sterile petri dishes | any brand | ||
Supplies and equipment for gel electrophoresis | any brand | ||
table top centrifuge | any brand | ||
Taq PCR Master Mix Kit | Qiagen | 201443 | |
Thermocycler for PCR reaction | any brand | ||
water bath | any brand | ||
Yeast extract | Sigma-Aldrich | 70161-100G |