Summary
이 프로토콜의 목적은 혐기성 챔버를 사용하지 않고 국부적으로 구매한 식품, 특히 엡실론 독소생성 균주 B 및 D에서 다른 클로스트리디움 퍼프린스 독시노타입을 검출하는 것입니다.
Abstract
클로스트리디움 퍼프린젠스 (C. perfringens)는다작 독소 생산자이며 다양한 숙주에서 광범위한 질병을 일으킨다. C. perfringens는 4개의 중요한 독소 유전자의 수송에 근거를 둔 5개의 다른 독소형, A통해 E로 분류됩니다. 이 각종 독소형의 보급 그리고 분포는 미국 소매 음식에 있는 그들의 보급, 특히 연구됩니다. 특히 우리에게 관심이 있는 것은 인간에서 다발성 경화증의 환경적 트리거로 제안된 매우 치명적인 독소인 엡실론 독소를 생산하는 B형 및 D 균주입니다. 다양한 식품 샘플에서 상이한 C. perfringens 독소의 존재를 평가하기 위해, 우리는 단지 3개의 배양 단계를 포함하는 혐기성 콘테이너 시스템을 사용하지 않고 이 박테리아를 선택적으로 배양하는 쉬운 방법을 개발했습니다. 식품은 현지 식료품점에서 구입하여 주변 조건하에서 실험실로 이송됩니다. 샘플을 다진 및 개질된 신속한 퍼프린젠스 매질(RPM)으로 접종하고 밀봉되고 밀폐된 원추형 튜브에서 37°C에서 밤새 배양합니다. 하룻밤 배양체 트립토세 아민테 Cycloserine (TSC) 한천의 하단 층에 접종한 다음 용융 TSC 한천의 상단 층으로 오버레이, "샌드위치", 혐기성 환경을 만드는. 한천 플레이트는 37°C에서 하룻밤 동안 배양한 다음 검은 색, 아황산염 감소 콜로니의 출현을 평가하였다. C. perfringens-의심되는콜로니는 멸균 안구 점액을 사용하여 TSC 한천에서 제거되고, RPM으로 접종하고 밀폐된 원추형 튜브에서 37°C에서 하룻밤 동안 서브 배양하였다. DNA는 RPM 계배양으로부터 추출된 후, 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 통해 C. 퍼프린젠스 독소 유전자의 존재를 분석하였다. 샘플링된 식품의 종류에 따라, 일반적으로 시료의 15-20%는 C. perfringens에대해 양성 반응을 보입니다.
Introduction
클로스트리디움 퍼프린젠(C. perfringens)은그람 양성, 혐기성, 포자 형성, 로드 모양의 박테리아로서 환경에서 유비쿼터스로 발견된다. 이 종의 박테리아는 17개 이상의 독소에 대해 인코딩하는 유전자를 운반하며, 역사적으로, 알파, 베타, 엡실론 및 이오타 독소의 존재에 기초하여 5개의 독소형(A-E)으로 특징지어졌다(표1)1. 최근에는 C. 퍼프린스 장토톡신(CPE)과 넷B 독소(NetB toxin)를 각각 수용하는 F형과 G형을 포함하도록 이러한 타이핑 방식이 확장되어야 한다는 주장이 제기되고있다. 그러나 이 스키밍 시스템이 공식적으로 승인되기 전에 더 많은 연구가 필요합니다. 알파 독소 유전자는 엄격하게 염색체로 위치하는 동안, CPE 유전자는 염색체와 플라스미드 둘 다에서 찾아내질 수 있습니다. 비교에서, 나머지 독소의 유전자는 다양한 다른 크기의 플라스미드에서 발견된다. 우리는 이러한 균주가 인간에서 다발성 경화증 (MS)을 유발하는 역할을 하기 위하여 건의된 매우 강력한, 공극 형성 독소인 엡실론 독소를 생성하기 때문에 C. perfringens 모형 B및 D의 보급에 특히 관심이 있습니다3 ,4,5,6,7. 사람들이 이 긴장에 의해 감염되거나 식민지화되는 방법 불명합니다. 한 가지 가능한 설명은 오염된 식품의 소비를 통해서입니다. 이 질문에 대답하는 것을 돕기 위하여는, 우리는 미국 음식 견본에 있는 다른 C. perfringens 독시형의 보급을 결정하기 위하여 노력했습니다.
미국 식품 샘플에서 C. perfringens 독소의 존재는 과소 연구되고 종종 혐기성 용기 시스템 및 수많은 하위 배양 단계8,9,10,11의 사용을 필요로 . 정제된 분리물을 얻기 위하여 수많은 서브 배양 단계가 필요하더라도, 이 방법은12,13,14,아마도 플라스미드 품어진 독소 유전자의 검출에 영향을 미치는 시간 동안 플라스미드의 손실로 이끌어 낼 수 있습니다 엡실론 독소 유전자를 포함한다. 우리는 혐기성 챔버, 항아리 또는 가방을 사용하지 않고 C. perfringens를 선택적으로 배양하기 위해 서브 배양 단계가 적은 쉬운 방법을 개발하고자 했습니다. 간략하게, 음식 샘플은 래피드 퍼프린스 미디어 (RPM) 하룻밤 (ON)에 접종 한 다음 TSC 한천에 "샌드위치"하고 ON을 배양합니다. C. perfringens로 의심되는 식민지는 RPM으로 하위 배양되고 다시 ON에 배양됩니다. DNA를 추출하고 유전자형을 확인하기 위해 PCR을 수행하였다(도1). 우리는 다른 표준 매체(15)에비해 식품 샘플에서 C. perfringens 균주의 회복을 증가시키는 것으로 입증된 바와 같이 RPM을 사용하기로 결정했다. 또한, RPM은 MS 환자4로부터엡실론 독소 생성 B형 균주를 성공적으로 분리하는 데 사용되었다. 우리는 쉬운 DNA 추출을 허용하기 위해 원래 버전 대신 RPM의 수정 된 버전을 사용합니다. 이 방법은 견본 내의 독소 유전자의 쉽게 식별을 허용하는 동안, 개별 견본이 하나 이상의 C. perfringens 독소형을 포함할 수 있습니다. 우리의 방법은 정제의 여러 라운드를 사용하여 정제 균주를 분리하지 않기 때문에, 하나의 샘플에서 여러 독소의 식별이 불가능합니다. 그러나, 표준 정제 기술 (일반적으로 TSC 플레이트 또는 혈액 한천 판에 줄무늬)는 정제 된 문화를 달성하기 위해 우리의 프로토콜의 끝에 적용 할 수 있습니다.
Protocol
참고: C. perfringens는 생물 안전 위험 수준 2 (BSL2) 유기체로 간주됩니다. 모든 식품 샘플에 C. perfringens가포함되어 있는 것은 아니지만 모든 배양 된 샘플은 이와 같이 취급되어야합니다. 모든 적절한 예방 조치와 인력 보호 장비(PPE)는 항상 착용해야 합니다. 폐기 전에 모든 물질을 오염 제거하십시오.
1. 수정된 RPM4,15 준비
- 30 g/L 유체 티오글리콜레이트 배지, 60 g/L 젤라틴, 5 g/L 펩톤, 5 g/L 포도당, 5 g/L 인산염 디베이직, 3 g/L 효모 추출물, 1.5 g/L 염화 나트륨, 0.5 g/L 황산나트륨을 균등하게 분산될 때까지 섞습니다. 일반적으로 1L 일괄 처리를 만듭니다.
- 121 °C에서 15 분 동안 오토 클레이브.
- 약 40°C까지 식힙니다.
- RPM이 차가워지면 D-사이클로딘을 최종 농도440 mg/L에 추가하십시오.
참고: 50 mg/mL에서 멸균수에 용해된 D-cycloserine의 재고 농도는 향후 사용을 위해 -20°C에 보관될 수 있습니다. - 10 mL의 RPM을 15 mL 원엽 튜브로 무균 적으로 전송합니다. RPM은 일괄으로 제조하고 최대 1개월 동안 4°C에서 보관할 수 있다.
- 사용 전에 RPM을 37°C로 따뜻하게 합니다.
2. 샘플 수집 및 RPM 배양
- 식품은 1시간 이내의 주변 온도하에서 실험실로 운반할 수 있으며, 식품은 원래 포장 또는 멸균 용기로 운반될 수 있습니다. 즉시 테스트하지 않을 경우, 식품은 사용 될 때까지 -20 °C에서 보관될 수 있습니다. 포장 라벨에 따라 식품의 종류와 원산지(가능한 경우)와 기타 관련 정보를 기록해 둡을 기록하십시오.
- 약 1.0-2.0 g의 식품을 제거하고 멸균 페트리 접시 또는 이에 상응하는 상태로 옮긴다. 멸균 면도날이나 메스로 잘게 다듬습니다.
- 15 mL 원추형 튜브에서 인산완충 식염수(PBS)의 10 mL로 접종하였다. 잘 섞으세요.
- 식물성 세포를 선택하려면, 10 mL의 RPM을 포함하는 15 mL 원엽 관으로 PBS 식품 혼합물의 5 mL를 전송합니다. 뚜껑을 단단히 닫습니다.
- 포자를 선택하려면, PBS-식품 혼합물의 나머지 5 mL을 85°C에서 15분 동안 가열한 다음 RPM 10 mL을 함유하는 15 mL 원엽 튜브로 옮니다. 뚜껑을 단단히 닫습니다.
- 완전한 혼합을 보장하기 위해 식품-RPM 배양을 소용돌이 및 반전한다.
- 원유관을 단단히 밀봉하고 혐기성 환경을 보장하기 위해 파라핀 필름 또는 플라스틱 랩으로 뚜껑을 감쌉니다.
- 37 °C에서 하룻밤 (ON)을 배양하십시오.
- 다음 날 아침 RPM 튜브의 탁도 또는 발효에 주의하십시오.
3. TSC "샌드위치" 도금
- 아래 설명된 "샌드위치" 기법을 사용하여 TSC 한천에 RPM 배양액을 접종합니다(그림2).
- 제조업체의 지침에 따라 TSC 한천을 준비하십시오.
- 용융 TSC 한천 10 mL를 멸균 페트리 접시에 옮기고 고형화하여 TSC 플레이트의 베이스 레이어를 준비합니다. 이들은 4°C에서 고급 및 저장하여 제조될 수 있다. 사용하기 전에 플레이트를 실온으로 데운지 확인하십시오.
- TSC 플레이트의 상부 층의 경우, 나머지 용융 TSC 한천을 40°C에서 유지한다.
참고: 한천의 융점이 85°C 이상이지만, 용융된 한천은 약 32-45°C를 고화시입니다.
- ON RPM 배스를 신중하게 검색하고 TSC 한천 기지로 100 μL을 전송합니다. 발효 때문에 일부 문화는 압력을 받을 수 있습니다. 모든 적절한 PPE를 착용해야합니다.
- 멸균 된 유리 비드 또는 세포 스프레더를 사용하여 RPM 접종을 확산시다.
- RPM을 실온에서 5-10분 동안 TSC 한천에 "흡수"할 수 있도록 하십시오.
- 조심스럽게 혈청 피펫을 사용하여 플레이트에 용융, 40 °C TSC 한천의 20 mL을 전송합니다.
- 페트리 접시 뚜껑을 교체하고 TSC 한천이 실온에서 완전히 고체화될 수 있도록 하십시오.
- 페트리 접시를 반전시키고 37°C ON에서 배양한다.
- 직렬 희석이 필요한 경우, TSC 한천으로 접종하기 전에 ON RPM 배양물의 희석을 신선하고 미리 데운 RPM으로 수행하십시오.
4. 아황산염 감소 식민지의 하위 배양
- 다음 날 아침, 인큐베이터에서 접시를 제거하고 세균 성장을 검사하십시오. 호기성 박테리아는 한천의 표면에 존재할 수 있다. 혐기성 박테리아는 한천 내에 내장 성장 발견 될 것이다. 아황산염 감소 박테리아는 한천 을 둘러싸는 검은 색으로 바뀝니다. 가능한 C. perfringens 식민지는 검은 색과 한천에 내장될 것입니다.
- C. 의심 식민지 는 아황산염 감소에 대 한 긍정적인 될 것입니다 및 한천 내에 포함 된 검은 색 나타납니다. 멸균, 일회용 점안제, 한천에서 검은 식민지를 "뽑아"15 mL 원엽 튜브에서 신선한 RPM의 10 mL로 전송합니다. 한천을 관통하기 전에 점안제의 공기를 추방하는 것이 중요합니다.
- 플레이트 표면에 호기성 세균 성장이 조밀한 경우 멸균 셀 스크레이퍼를 사용하여 선택한 영역에서 식민지를 제거하십시오. 콜로니가 의심되는 여러 C. perfringens는 동일한 TSC 플레이트에서 별도의 RPM 배양으로 샘플링될 수 있습니다.
- 원두 튜브 뚜껑을 단단히 고정하고 파라핀 필름 또는 플라스틱 랩으로 감싸십시오. 37 °C에서 ON을 배양하십시오.
5. DNA 추출
- ON RPM 배양을 제거하고 탁도 및 발효를 포함한 성장 징후를 검사하십시오.
- RPM 문화를 부드럽게 반전하여 정착된 박테리아를 분산시키고 조심스럽게 열어 보냅니다. 배양 1 mL을 미세 원심 분리관으로 옮김을 옮김을 옮김으로 옮김을 옮김.
- 최고 속도 (약 15,000 x g)에서10 분 동안 펠렛 박테리아.
- 멸균 PBS 1 mL로 펠릿을 씻으십시오.
- 어떤 상황에서는 소화되지 않은 젤라틴이 펠릿 박테리아 위에 정착합니다. 젤라틴을 제거하려면 마이크로파이펫을 사용하여 PBS로 부드럽게 교반하여 젤라틴을 "보풀"합니다. 이것은 세균성 펠릿을 그대로 두면서 젤라틴을 "보풀"입니다.
- 부드러운 포부로 PBS-젤라틴 혼합물을 제거합니다. 신선한 PBS 1 mL로 나머지 세균 펠릿을 다시 일시 중단합니다.
- 10 분 동안 최고 속도로 재 중단 된 세균 펠릿을 원심 분리하고 조심스럽게 상판을 흡인합니다.
- 그람 양성 균에서 DNA를 추출하기 위해 특별히 생성 된 DNA 추출 키트 및 프로토콜을 사용하여 즉시 DNA 추출을 수행합니다 (재료 표참조).
- 추출된 DNA를 즉시 사용하거나 PCR 분석전까지 -20°C에서 보관하십시오.
6. PCR 지질형 검출을 통한 C. 퍼프린스 검출
- 문화가 C. perfringens 독소형에 대한 양성인지 확인하려면 PCR을 통해 다른 독소 유전자에 대해 추출 된 DNA를 검사하십시오.
참고 : 우리는 균주 B 및 D C. perfringens를생산하는 엡실론 독소에 가장 관심이 있기 때문에, 우리는 알파, 베타, 및 엡실론 독소 유전자의 존재를 평가한다. 프라이머는 표 2에나열되어 있습니다. 16s 리보좀 DNA에 대한 프라이머는 DNA 추출 대조군으로서 사용된다. 추가프라이머는 A부터 G까지 독시타입을 테스트하는데 사용될 수 있으며, 출판된 문헌2,12,13에서찾을 수 있다. - 이전에 추출한 C. perfringens DNA를 양성 대조군으로 사용하십시오. 이 컨트롤은 PCR 반응의 모든 구성 요소가 작동하는지 확인합니다. 우리는 C. perfringens 유형 B (ATCC 3626)에서 추출 한 DNA를 긍정적 인 대조군으로 사용합니다. 37°C에서 RPM에서 ATCC 3636 ON을 성장시키고 단계 5.1-5.7에 기재된 동일한 방법을 사용하여 DNA를 추출한다. 추출한 DNA를 사용할 때까지 -20°C에서 보관하십시오.
- 다음과 같이 PCR 조건을 설정: 3 분 동안 94.0 °C; 30s에 대한 94.0 °C; 30초의 경우 47.9°C, 1분 동안 72.0°C(35사이클에 대해 2-4단계 반복단계); 72.0 °C에서 10 분 동안.
- PCR 제품을 확인하려면 표준 기술을 사용하여 1.8 g/100 mL 아가로즈 젤에서 PCR 반응을 실행하십시오. 예상 PCR 제품 크기는 표 2에나열되어 있습니다. 일반적인 PCR 결과는 그림 3에표시됩니다.
Representative Results
이 방법을 사용하여, 우리의 샘플링 된 식품의 15-20 %는 C. perfringens에대한 양성 반응을 테스트합니다. 대부분의 균주는 독시형 A에 대해 긍정적이지만, 우리는 식품 샘플에서 B형과 D를 모두 성공적으로 검출했습니다. 이전에 발표된 논문에서 우리는 뉴욕 소매점16(표 3)에서구입한 총 216개의 식품 샘플을 테스트했습니다. 이 샘플에는 다양한 육류 샘플 (쇠고기, 양고기, 돼지 고기 및 양고기), 가금류 샘플 (닭고기및 칠면조), 해산물 샘플 (대구, 연어, 조개, 도미, 가자미, 오징어, 틸라피아, 참치 및 기타 다양한 물고기)이 포함되었습니다. 생산 및 유제품 샘플도 테스트했습니다. 216개의 샘플 중 34개(16%) C. perfringens에대 한 긍정적인 했다. 34C. perfringens 양성 샘플 중 31 개 샘플 (91.2%) 알파 독소, 1개의 샘플(2.9%)을 함유하고 있습니다. 알파, 베타 및 엡실론 독소, 및 2개의 샘플(5.9%)을 함유하고 있습니다. 알파 와 엡실론 독소가 포함되어 있습니다.
흥미롭게도, 우리는 또한 C. perfringens포자에 비해 식물 세포로 더 널리 퍼진 것을 발견했습니다. 25개의 샘플을 식물성 C. perfringens 세포 또는 포자의 존재에 대해 비교하였다. 포자는 85°C에서 15분 동안 열 충격 샘플에 의해 선택되었다. 시험된 25개의 견본의, 16%는 포자에 대한 4%대 식물성 C. perfringens 긴장에 대해 양성이었습니다. 이것은 둘 다 대신에 단지 식물성 세포를 위해 시험하는 것이 더 비용 효과적일 지도 모르다는 것을 표시합니다.
그림 1: 절차 개요.
식품 샘플은 다진 멸균 PBS로 희석됩니다. PBS 식품 샘플의 절반은 식물성 세포를 선택하기 위해 RPM으로 접종됩니다. 나머지 PBS-식품 샘플은 RPM에서 접종하기 전에 포자를 선택하기 위해 15 분 동안 85 °C에서 충격을 받은 열입니다. 배양액은 37°C에서 ON으로 배양한 다음 TSC 한천으로 도금됩니다. TSC 한천은 37°C에서 ON및 블랙, 아황산염 환원 배양액을 신선한 RPM으로 서브 배양한다. 하위 배양 RPM 배양은 37°C에서 ON으로 배양되고 DNA는 PCR을 통해 헤노티핑을 수행하기 위해 추출된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: TSC 한천 샌드위치 기술의 회로도.
C. perfringens 박테리아를 포함하는 RPM 매체는 혐기성 환경을 승진시키기 위하여 TSC 한천의 2층 사이에서 도금된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 선택한 PCR 결과.
7가지 상이한 식품으로부터의 C. perfringens의 유전형질 결과, 및 C. perfringens 유형 B의 양성 대조군의 예시 이미지. 분자량 사다리(각 겔의 제1 레인)를 사용하여 PCR의 크기를 근사화하여 염기 쌍(bp)을 생성하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 독시형 | 알파 | Beta | 엡실론 | 이오타 | Cpe | 넷B (주) | |
| 설립 | A. | + | - | - | - | - | - |
| B | + | + | + | - | - | - | |
| C | + | + | - | - | + | - | |
| D | + | - | + | - | + | - | |
| 전자 | + | - | - | + | + | - | |
| 제안 | F | + | - | - | - | + | - |
| G | + | - | - | - | - | + | |
| + 현재 - 존재하지 않음 +/- 존재할 수도 또는 없을 수도 있습니다. |
|||||||
표 1: C. perfringens 유전형의 개요. 각 C. perfringens 독소형에 의해 생성 된 독소의 조합의 차트.
| 대상 | 프라이머 쌍 | 예상 PCR 제품(bp) |
| 알파 | F: GCT AAT GTT ACT GCC GTT GA R: CCT CTG ATA CAT CGT GTA AG |
325 |
| Beta | F: GCG AtAT ATG CTG AAT CAT CTA R: GCA GGA ACA TTA GTA TAT CTT C |
196 |
| 엡실론 | F: GCG GTG ATA TCC ATC TAT TC R: CCA CTT ACT TGT CCT ACT AAC |
655 |
| 16s RNA | F: AGA GTT TGA TCC TGG CTC A R: GGT TAC CTT GTT ACG ACT T |
~1300 |
표 2: 선택된 독소 유전자에 대한 프라이머 및 예상 PCR 제품. PCR 지질형 질약 에 사용되는 프라이머.
| 식품 유형 | 유형 A | 유형 B | 유형 C | 유형 D | C. 퍼프 + | |||||||
| 알파 독소 양성 | 알파, 베타 및 엡실론 독소 양성 | 알파 및 베타 독소 양성 | 알파 및 엡실론 독소 양성 | |||||||||
| N | N | % | N | % | N | % | N | % | N | % | ||
| 고기 | 쇠고기 | 38 | 8 | 21% | 1 | 3% | 0 | 0% | 0 | 0% | 9 | 24% |
| 양고기 | 10 | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | |
| 돼지고기 | 15 | 2 | 13% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 2 | 13% | |
| 혼합 | 1 | 1 | 100% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 1 | 100% | |
| 부분합 | 64 | 11 | 17% | 1 | 2% | 0 | 0% | 0 | 0% | 12 | 19% | |
| 가금류 | 치킨 | 19 | 5 | 26% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 5 | 26% |
| 터키 | 7 | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | |
| 부분합 | 26 | 5 | 19% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 5 | 19% | |
| 해산물 | 사인 | 4 | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% |
| 혼합 | 1 | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | |
| 연어 | 11 | 2 | 18% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 2 | 18% | |
| 선반 | 32 | 1 | 3% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 1 | 3% | |
| 도미 | 4 | 3 | 75% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 3 | 75% | |
| 넙치 | 12 | 4 | 33% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 4 | 33% | |
| 오징어 | 4 | 1 | 25% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 1 | 25% | |
| Tilapia | 21 | 2 | 10% | 0 | 0% | 0 | 0% | 2 | 10% | 4 | 19% | |
| 참치 | 3 | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | |
| 다른 | 8 | 1 | 13% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 1 | 13% | |
| 부분합 | 100 | 14 | 14% | 0 | 0% | 0 | 0% | 2 | 2% | 16 | 16% | |
| 유제품 | 암소 | 3 | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% |
| 염소 | 4 | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | |
| 우유 | 3 | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | |
| 부분합 | 10 | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | |
| 생산 | 야채 | 12 | 1 | 8% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 1 | 8% |
| 과일 | 1 | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | |
| 허브 | 3 | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | |
| 부분합 | 16 | 1 | 6% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 1 | 6% | |
| 총 | 216 | 31 | 14% | 1 | 0.50% | 0 | 0% | 2 | 0.90% | 34 | 16% | |
표 3: 216개의 식품 샘플에서 상이한 C. perfringens 독시형의 보급. 이 방법을 사용하여 C. perfringens에대한 소매 식품을 테스트할 때 얻은 결과의 예. 이 표는 이전에 출판된 원고 Regan 외16에서수정되었습니다.
Discussion
여기서 우리는 혐기성 챔버 시스템을 사용하지 않고 제한된 서브라베직화와 소매 식품 샘플에서 C. perfringens 보급을 식별하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 식품 샘플에서 C. perfringens의 식별을 높이기 위해 기술의 조합을 사용합니다. RPM 미디어의 수정 된 버전을 사용 하 여, 우리는 C. perfringens의선택적 성장을 허용 합니다. TSC 한천의 층 사이에 접종 된 RPM을 끼워서 C. perfringens의특징인 혐기성, 아황산염 감소 박테리아를 식별하고 분리 할 수 있습니다. C. perfringens의존재를 확인하기 위하여는, 아황산염 환원 식민지는 신선한 RPM으로 하위 배양됩니다. 수정된 버전 또는 RPM을 통해 배양물에서 DNA를 쉽게 추출할 수 있으므로 특정 독소 유전자의 PCR 확인이 가능합니다. 오염된 식품 시료의 C. perfringens의 확인은 3 일 이내에 달성 될 수있다.
초기 실험에서, 식품 샘플은 단순히 RPM으로 접종하고 ON 배양물에서 추출한 DNA를 접종하였다. 이 방법은 제한된 수의 샘플(표시되지 않은 데이터)에서 C. perfringens를 검출하는 결과를 낳았습니다. RPM은 C. perfringens 성장에 대 한 선택적, 그것은 C. perfringens 성장에 대 한 배타적인. 다른, 그람 양성, D-시콜세린 저항하는 박테리아는 여전히 RPM에서 성장할 수 있습니다. 우리는 다른 세균성 종에 의한 오염이 우리의 첫 번째 ON RPM 배양에서 우리의 PCR 분석의 민감도를 감소시킴으로써 C. perfringens 균주의 우리의 검출을 감소시킬 수 있다는 가설을 세웠다. C. perfringens의 검출을 증가시다 TSC 한천 "샌드위치" 기술의 포함했다. 이를 통해 C. perfringens의 특징인 혐기성, 아황산염 감소 식민지를 차별화하고 선택할 수 있었습니다. 이 공정의 핵심 단계는 용융 TSC 한천의 상층이 40°C에 있는지 확인하는 것입니다. 일부 C. perfringens 균주는 증가 된 온도에서 성장할 수 있지만 (46-48 ° C)15,16,증가 된 온도에서 용융 한 천을 추가하면 회복 된 배양물의 양이 크게 감소하며 대부분 세포 사멸로 인해 발생할 가능성이 큽니다. .
이 방법에는 몇 가지 잠재적인 제한 사항이 있습니다. 앞서 언급했듯이, RPM이나 TSC 한천은 C. perfringens를 독점적으로 선택하거나 차별화하지 않으므로 식품 샘플에 존재하는 다른 박테리아 종의 성장을 허용합니다. 이는 C. perfringens에 대해서만 선택하는 분석법의 민감도를 감소시킬 수 있다. 그러나 이것은 거의 모든 배양 기술의 일반적인 한계입니다. 정제된 분리물의 지질공형 확인은 C. perfringens 및 기타 세균 종을 확실하게 식별하는 가장 좋은 방법입니다. 이 연구의 또 다른 한계는 우리가 정제 된 분리물을 테스트하지 않는다는 것입니다. 우리는 의도적으로 반복된 출하가 플라스미드 손실을 초래할 까봐 두려워하기 때문에, 서브배양의 양을 제한하기 위해 이 것을 했습니다. 우리는 순도를 분리하지 않기 때문에, 다중 C. perfringens 독소형이 동일한 샘플 또는 하위 배양에 존재할 수 있다는 것을 가능하다. 연구원이 정제된 분리물을 얻고자 하는 경우, 표준 정제 방법은 이 방법에 설명된 마지막 RPM 배양에 사용될 수 있다; 이것은 전형적으로 혐기성 약실의 사용을 요구합니다. 원래 는 음식에서 C. perfringens를 분리 하는 데 사용 하지만, 이 방법은 식별 하 고 소스의 다수에서 C. perfringens를 격리 하는 데 사용할 수 있습니다. 구체적으로, 이 방법의 한 가지 그러한 적용은 C. perfringens및 독시형박테리아에 감염된 것으로 의심되는 인간(또는 동물)으로부터 배설물 샘플을 테스트하여 감염의 원인을 더 잘 이해하는 것이다.
Disclosures
공개가 없습니다.
Acknowledgments
이 연구는 공공, 상업, 또는 비영리 부문에서 특정 자금을받지 못했습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| D-Cycloserine | Sigma-Aldrich | C6880 | |
| Dextrose | Sigma Life Science | D9434-250G | |
| Disposable Transfer Pipets | any brand | Select one with slim tip like Thermo Scientific Disposable Transfer Pipets 137116M/EMD | |
| DNeasy Blood & Tissue Kits | Qiagen | 69504 | Note: numerous DNA and plasmid extractions kits were evaluated, this kit gave the most desirable results. |
| Dry Incubator | any brand | ||
| Fluid thioglycolate medium | Remel | R453452 | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma Life Science | G1890-500G | |
| Individual Primers | Invitrogen | ||
| Iron (II) sulfate heptahydrate | Sigma Life Science | F8633-250 G | |
| Lysozyme from chicken egg white | Sigma-Aldrich | L6876 | Needed for DNA extraction, not provided in kit |
| microcentrifuge tube | any brand | ||
| parafilm or plastic wrap | any brand | ||
| Peptone from casein and other animal proteins | Sigma-Aldrich | 70173-100G | |
| Perfringens Agar Base (TSC + SFP) | Oxoid | CM0587 | Make TSC agar according to instructions |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | P2222-100G | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S-7653 | |
| Sterile Cell Scraper | any brand | ||
| Sterile cell Spreader | any brand | ||
| Sterile petri dishes | any brand | ||
| Supplies and equipment for gel electrophoresis | any brand | ||
| table top centrifuge | any brand | ||
| Taq PCR Master Mix Kit | Qiagen | 201443 | |
| Thermocycler for PCR reaction | any brand | ||
| water bath | any brand | ||
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | 70161-100G |
References
- Petit, L., Gibert, M., Popoff, M. R. Clostridium perfringens: toxinotype and genotype. Trends in Microbiology. 7, 104-110 (1999).
- Rood, J. I., et al. Expansion of the Clostridium perfringens toxin-based typing scheme. Anaerobe. , (2018).
- Murrell, T. G., O'Donoghue, P. J., Ellis, T. A review of the sheep-multiple sclerosis connection. Medical Hypotheses. 19, 27-39 (1986).
- Rumah, K. R., Linden, J., Fischetti, V. A., Vartanian, T. Isolation of Clostridium perfringens type B in an individual at first clinical presentation of multiple sclerosis provides clues for environmental triggers of the disease. PLoS One. 8, 76359 (2013).
- Wagley, S., et al. Evidence of Clostridium perfringens epsilon toxin associated with multiple sclerosis. Multiple Sclerosis. , 1352458518767327 (2018).
- Linden, J. R., et al. Clostridium perfringens Epsilon Toxin Causes Selective Death of Mature Oligodendrocytes and Central Nervous System Demyelination. MBio. 6, 02513 (2015).
- Popoff, M. R. Epsilon toxin: a fascinating pore-forming toxin. FEBS Journal. 278, 4602-4615 (2011).
- Lee, C. A., Labbe, R. Distribution of Enterotoxin- and Epsilon-Positive Clostridium perfringens Spores in U.S. Retail Spices. Journal of Food Protection. 81, 394-399 (2018).
- Wen, Q., McClane, B. A. Detection of enterotoxigenic Clostridium perfringens type A isolates in American retail foods. Applied and Environmental Microbiology. 70, 2685-2691 (2004).
- Cooper, K. K., Bueschel, D. M., Songer, J. G. Presence of Clostridium perfringens in retail chicken livers. Anaerobe. 21, 67-68 (2013).
- Strong, D. H., Canada, J. C., Griffiths, B. B. Incidence of Clostridium perfringens in American foods. Applied and Environmental Microbiology. 11, 42-44 (1963).
- Buogo, C., Capaul, S., Hani, H., Frey, J., Nicolet, J. Diagnosis of Clostridium perfringens type C enteritis in pigs using a DNA amplification technique (PCR). Journal of Veterinary Medicine, Series B. 42, 51-58 (1995).
- Yamagishi, T., Sugitani, K., Tanishima, K., Nakamura, S. Polymerase chain reaction test for differentiation of five toxin types of Clostridium perfringens. Microbiology and Immunology. 41, 295-299 (1997).
- Johansson, A., Engstrom, B. E., Frey, J., Johansson, K. E., Baverud, V. Survival of clostridium perfringens during simulated transport and stability of some plasmid-borne toxin genes under aerobic conditions. Acta Veterinaria Scandinavica. 46, 241-247 (2005).
- Erickson, J. E., Deibel, R. H. New medium for rapid screening and enumeration of Clostridium perfringens in foods. Applied and Environmental Microbiology. 36, 567-571 (1978).
- Regan, S. B., et al. Identification of epsilon toxin-producing Clostridium perfringens strains in American retail food. Anaerobe. 54, 124-127 (2018).
