O objetivo deste protocolo é detectar diferentes toxinotipos de Clostridium perfringens em alimentos adquiridos localmente, particularmente a toxina Epsilon produzindo tipos de estirpe B e D, sem o uso de câmaras anaeróbias.
Clostridium perfringens (C. perfringens) é um produtor prolífico da toxina e causa uma escala larga das doenças em vários anfitriões. C. perfringens é categorizado em cinco diferentes toxinotipos, a através de E, com base no transporte de quatro genes principais da toxina. A prevalência e distribuição destes vários toxinotipos é subestudada, especialmente a sua difusão em alimentos de retalho americanos. De particular interesse para nós são as estirpes tipo B e D, que produzem toxina épsilon, uma toxina extremamente letal sugerida para ser o gatilho ambiental da esclerose múltipla em seres humanos. Para avaliar a presença de diferentes toxinotipos de C. perfringens em várias amostras de alimentos, desenvolvemos um método fácil para a cultura seletiva dessas bactérias sem o uso de um sistema de Container anaeróbio envolvendo apenas três etapas de cultivo. Os alimentos são comprados em mercearias locais e transportados para o laboratório em condições ambientais. As amostras são picadas e inoculadas em meios de perfringens rápidos modificados (RPM) e incubadas durante a noite em 37 ° c em um tubo cônico selado, hermético. Culturas overnight são inoculadas em uma camada inferior de sólidos Triptse sulfito cicloserina (TSC) Agar, e, em seguida, sobrepostas com uma camada superior de agar TSC derretido, criando um “imprensado”, ambiente anaeróbio. As placas de agar são incubadas durante a noite a 37 ° c e, em seguida, avaliadas para o aparecimento de colônias pretas, com redução de sulfito. C. perfringens-as colônias suspeitadas são removidas do agar de TSC usando os conta-gotas estéreis do olho, e INOCULADOS no RPM e subcultivados durante a noite em 37 ° c em um tubo cônico hermético. O DNA é extraído da subcultura RPM e, em seguida, analisado para a presença de genes de toxina C. perfringens via reação em cadeia da polimerase (PCR). Dependendo do tipo de alimento amostrado, tipicamente 15 – 20% das amostras testam positivo para C. perfringens.
Clostridium perfringens (C. perfringens) é um Gram positivo, anaeróbio, esporo-formando, haste em forma de bactéria que é encontrado onipresente no ambiente. Esta espécie de bactéria transporta genes que codificam por mais de 17 toxinas e, historicamente, tem sido caracterizada em cinco toxinotipos (A-E) com base na presença de quatro genes de toxina diferentes: alfa, beta, Épsilon e toxina Iota (tabela 1)1. Recentemente, tem sido sugerido que este esquema de digitação precisa ser expandido para incluir os tipos F e G, que abrigam a toxina C. perfringens enterotoxina (CPE) e NetB, respectivamente2. Entretanto, mais pesquisa é precisada antes que este sistema planejando seja aceitado formalmente. Quando o gene da toxina alfa for localizado estritamente cromossomicamente, o gene de CPE pode ser encontrado no cromossoma e nos Plasmids. Em comparação, os genes restantes das toxinas são encontrados em vários plasmídos de tamanho diferente. Estamos particularmente interessados na prevalência de C. perfringens tipos B e D como estas cepas produzem toxina épsilon, uma toxina extremamente potente, formando poros, que tem sido sugerido para desempenhar um papel no desencadeamento da esclerose múltipla (MS) em seres humanos3 ,4,5,6,7. Como as pessoas se tornam infectadas ou colonizadas por essas cepas é desconhecido. Uma possível explicação é através do consumo de produtos alimentares contaminados. Para ajudar a responder a esta pergunta, procurou-se determinar a prevalência de diferentes toxinotipos de C. perfringens em amostras de alimentos americanas.
A presença de C. perfringens toxinotypes em amostras de alimentos americanas é subestudada e muitas vezes requer o uso de sistemas de contêineres anaeróbios e inúmeras etapas de subculturação8,9,10,11 . Embora inúmeras etapas de subculturação sejam necessárias para a obtenção de isolados purificados, esse método pode levar à perda de plasmídeo ao longo do tempo12,13,14, possivelmenteafetando a detecção de genes de toxina de origem plasmática incluindo o gene da toxina épsilon. Procurou-se desenvolver um método fácil, com menos etapas de subculturação, para seletivamente cultura C. perfringens sem o uso de câmaras anaeróbias, frascos, ou sacos. Brevemente, as amostras de alimentos são inoculadas em Rapid perfringens Media (RPM) durante a noite (ON), em seguida, “imprensado” em agar TSC e incubadas ON. Colônias suspeitas de ser C. perfringens são então SUBCULTIVADAS em RPM e incubadas novamente em. O DNA é extraído e a PCR é realizada para determinar o genótipo (Figura 1). Optou-se por utilizar a RPM, como foi demonstrado para aumentar a recuperação de cepas de C. perfringens de amostras de alimentos em comparação com outros meios mais padrão15. Além, o RPM foi usado com sucesso para isolar uma toxina do Epsilon que produz a tensão do tipo B de um paciente de MS4. Nós usamos uma versão modificada do RPM em vez da versão original para permitir a extração fácil do ADN. Enquanto este método permite a fácil identificação de genes de toxinas dentro de amostras, é possível que uma amostra individual conterá mais de um C. perfringens toxinotype. Como nosso método não isola cepas purificadas usando várias rodadas de purificação, a identificação de vários toxinotipos de uma amostra não é possível. No entanto, técnicas de purificação padrão (tipicamente estrias em placas de TSC ou placas de agar sangue) podem ser aplicados no final do nosso protocolo para alcançar culturas purificadas.
Aqui nós descrevemos um método para identificar a predominância de C. perfringens em amostras do alimento de varejo com repicagem limitado e sem uso de um sistema anaeróbio da câmara. Este método utiliza uma combinação de técnicas para aumentar a identificação de C. perfringens a partir de amostras de alimentos. Usando uma versão modificada da mídia RPM, permitimos o crescimento seletivo de C. perfringens. Ao imprensar o RPM inoculado entre as camadas de agar TSC, somos capazes de identificar e isolar bactérias anaeróbicas, redutoras de sulfito, características de C. perfringens. Para confirmar a presença de C. perfringens, as colônias de redução de sulfito são subcultivadas em RPM fresco. A versão modificada ou RPM permite-nos extrair facilmente o DNA das culturas, permitindo a confirmação do PCR de genes específicos da toxina. A confirmação de C. perfringens contaminou amostras de alimento pode ser conseguida dentro de três dias.
Em experimentos precoces, amostras de alimentos foram simplesmente inoculadas em RPM e DNA extraído de culturas ON. Este método resultou na detecção de C. perfringens em um número limitado de amostras (dados não mostrados). Embora o RPM seja seletivo para o crescimento de c. perfringens , não é exclusivo para o crescimento de c. perfringens . Outros, gram-positivos, D-cycolserine bactérias resistentes ainda pode crescer em RPM. Nós supor que a contaminação por outras espécies bacterianas pode ter diminuído nossa deteção de tensões de C. perfringens diminuindo a sensibilidade de nossa análise do PCR em nossa primeira cultura do RPM. Um passo crítico no aumento da detecção de C. perfringens foi a inclusão da técnica de “sanduíche” de agar TSC. Isso nos permitiu diferenciar e selecionar para colônias anaeróbicas, de redução de sulfito, características de C. perfringens. Uma etapa chave neste processo é assegurar-se de que a camada superior de agar derretido de TSC esteja em 40 ° c. Embora algumas cepas de C. perfringens possam crescer a temperaturas elevadas (46 – 48 ° c)15,16, aadição de agar derretido a temperaturas elevadas reduz consideravelmente a quantidade de culturas recuperadas, provavelmente devido à morte celular .
Existem várias limitações potenciais para este método. Como mencionado anteriormente, nem a RPM nem o agar TSC selecionam ou diferenciam para C. perfringens exclusivamente, permitindo o crescimento de outras espécies bacterianas presentes em amostras de alimentos. Isto pode reduzir a sensibilidade do ensaio para seleccionar apenas C. perfringens . No entanto, esta é uma limitação comum em quase todas as técnicas de cultivo. A confirmação de genotipagem de isolados purificados é o melhor método para identificar definitivamente C. perfringens e outras espécies bacterianas. Outra limitação deste estudo é que não testamos os isolados purificados. Nós propositadamente fizemos isso para limitar a quantidade de subculturação, como a subculturação repetida é temida a resultar em perda de plasmídeo. Porque nós não isolamos à pureza, é possível que os toxinotypes múltiplos de C. perfringens possam estar atuais na mesma amostra ou Subculture. Se os pesquisadores desejam obter isolados purificados, métodos de purificação padrão podem ser usados na última cultura de RPM descrita neste método; Isso normalmente requer o uso de câmaras anaeróbias. Embora originalmente usado para isolar c. perfringens de alimentos, este método pode ser usado para identificar e isolar c. perfringens de uma infinidade de fontes. Especificamente, uma tal aplicação deste método é testar amostras fecais dos seres humanos (ou dos animais) que são suspeitados para ser contaminados com C. perfringens e toxinotype as bactérias para compreender melhor a fonte de infecção.
The authors have nothing to disclose.
Esta pesquisa não recebeu nenhum financiamento específico dos setores público, comercial, ou não-para fins lucrativos.
D-Cycloserine | Sigma-Aldrich | C6880 | |
Dextrose | Sigma Life Science | D9434-250G | |
Disposable Transfer Pipets | any brand | Select one with slim tip like Thermo Scientific Disposable Transfer Pipets 137116M/EMD | |
DNeasy Blood & Tissue Kits | Qiagen | 69504 | Note: numerous DNA and plasmid extractions kits were evaluated, this kit gave the most desirable results. |
Dry Incubator | any brand | ||
Fluid thioglycolate medium | Remel | R453452 | |
Gelatin from porcine skin | Sigma Life Science | G1890-500G | |
Individual Primers | Invitrogen | ||
Iron (II) sulfate heptahydrate | Sigma Life Science | F8633-250 G | |
Lysozyme from chicken egg white | Sigma-Aldrich | L6876 | Needed for DNA extraction, not provided in kit |
microcentrifuge tube | any brand | ||
parafilm or plastic wrap | any brand | ||
Peptone from casein and other animal proteins | Sigma-Aldrich | 70173-100G | |
Perfringens Agar Base (TSC + SFP) | Oxoid | CM0587 | Make TSC agar according to instructions |
Potassium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | P2222-100G | |
Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S-7653 | |
Sterile Cell Scraper | any brand | ||
Sterile cell Spreader | any brand | ||
Sterile petri dishes | any brand | ||
Supplies and equipment for gel electrophoresis | any brand | ||
table top centrifuge | any brand | ||
Taq PCR Master Mix Kit | Qiagen | 201443 | |
Thermocycler for PCR reaction | any brand | ||
water bath | any brand | ||
Yeast extract | Sigma-Aldrich | 70161-100G |