Summary
Целью этого протокола является выявление различных Clostridium perfringens токсинотипов в локально приобретенных продуктов питания, в частности, эпсилон токсин производства штаммов типов B и D, без использования анаэробных камер.
Abstract
Clostridium perfringens (C. perfringens) является плодовитым производителем токсинов и вызывает широкий спектр заболеваний в различных хостах. C. perfringens делится на пять различных токсинотипов, A через Е, на основе перевозки четырех основных генов токсина. Распространенность и распространение этих различных токсинотипов недостаточно изучены, особенно их распространенность в американской розничной продовольственной. Особый интерес для нас представляют штаммы типа В и D, которые производят эпсилонный токсин, чрезвычайно смертоносный токсин, который предлагается срабатывать на экологическом спусковом крючке рассеянного склероза у людей. Для оценки присутствия различных C. perfringens токсинотипов в различных образцах продуктов питания, мы разработали простой метод выборочно культуры этих бактерий без использования анаэробной контейнерной системы только с участием трех шагов культивирования. Продукты питания закупаются в местных продуктовых магазинах и транспортируются в лабораторию в условиях окружающей среды. Образцы измельчаются и прививаются в модифицированные быстрые perfringens media (RPM) и инкубируются на ночь при 37 градусах Цельсия в герметичной, герметичной конической трубке. Ночные культуры прививаются на нижнем слое твердого триптозного сульфита Сулькузеприна (TSC), а затем накладываются верхним слоем расплавленного агара TSC, создавая «сэндвич», анаэробную среду. Агар пластины инкубируются на ночь при 37 градусов по Цельсию, а затем оцениваются на внешний вид черных, сульфит-снижающих колоний. C. perfringens-подозреваемыеколонии извлекаются из агара TSC с помощью стерильных капельниц глаз, и прививаются в RPM и субкультурные ночь при 37 градусов по Цельсию в герметичной конической трубке. ДНК извлекается из субкультуры RPM, а затем анализируется на наличие генов токсина C. perfringens с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). В зависимости от типа пробы пищи, как правило, 15-20% образцов положительный результат теста на C. perfringens.
Introduction
Clostridium perfringens (C. perfringens) является Грам положительный, анаэробный, спорообразующих, стержня формы бактерии, которая находится повсеместно в окружающей среде. Этот вид бактерий несет гены, которые кодируют более 17 токсинов и, исторически, был охарактеризован в пять токсинотипов (A-E) на основе присутствия четырех различных генов токсина: альфа, бета, эпсилон, и йота токсина (Таблица 1)1. Недавно было высказано предположение, что эта схема ввода должна быть расширена, чтобы включить типы F и G, которые гавани C. perfringens энтеротоксин (CPE) и NetB токсин, соответственно2. Тем не менее, необходимы дополнительные исследования, прежде чем эта система интриг будет официально принята. В то время как ген альфа-токсина строго хромосомно расположен, ген CPE можно найти как на хромосоме, так и на плазмидах. Для сравнения, оставшиеся гены токсинов встречаются на различных плазмидах разного размера. Мы особенно заинтересованы в распространенности C. perfringens типов B и D, как эти штаммы производят эпсилон токсин, чрезвычайно мощный, пор-образующий токсин, который был предложен, чтобы играть роль в запуске рассеянного склероза (МС) у людей3 ,4,5,6,7. Как люди заражаются или колонизированы этими штаммами неизвестно. Одним из возможных объяснений является потребление зараженных пищевых продуктов. Чтобы помочь ответить на этот вопрос, мы стремились определить распространенность различных C. perfringens токсинотипов в американских образцах продуктов питания.
Присутствие C. perfringens токсинотипов в американских образцах продуктов питания недостаточно изучено и часто требует использования анаэробных контейнерных систем и многочисленных подкультивных шагов8,9,10,11 . Хотя многочисленные подкультивные шаги необходимы для получения очищенных изолятов, этот метод может привести к потере плазмидов с течением времени12,13,14, возможно, влияющих на обнаружение плазмидных генов токсина включая ген эпсилона токсина. Мы стремились разработать простой метод, с меньшим количеством подкультивных шагов, чтобы выборочно культуры C. perfringens без использования анаэробных камер, банки, или мешки. Кратко, образцы еды привиты в быстрое Perfringens медиа (RPM) всю ночь (ON), после этого «зажаты» в агар TSC и инкубированные ON. Колонии, подозреваемые в C. perfringens затем суб-культуры в RPM и инкубации снова ON. ДНК извлекается и ПЦР выполняется для определения генотипа(Рисунок 1). Мы решили использовать RPM, как было продемонстрировано, чтобы увеличить восстановление штаммов C. perfringens из образцов продуктов питания по сравнению с другими более стандартными носителями15. Кроме того, RPM был успешно использован для изоляции эпсилона токсина производства штамма типа В от пациента MS4. Мы используем модифицированную версию RPM вместо оригинальной версии, чтобы легко экстракции ДНК. Хотя этот метод позволяет легко идентифицировать гены токсинов в образцах, вполне возможно, что отдельный образец будет содержать более одного C. perfringens токсинотипа. Поскольку наш метод не изолирует очищенные штаммы с помощью нескольких раундов очистки, идентификация нескольких токсинотипов из одного образца невозможна. Тем не менее, стандартные методы очистки (как правило, полос на TSC пластин ы или крови агар пластин) могут быть применены в конце нашего протокола для достижения очищенных культур.
Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: C. perfringens считается биобезопасности уровень опасности 2 (BSL2) организма. Хотя не все образцы продуктов питания будут содержать C. perfringens,все культурные образцы должны рассматриваться как таковые. Все надлежащие меры предосторожности и защитное оборудование персонала (PPE) следует носить в любое время. Обеззараживание всего материала до утилизации.
1. Подготовка модифицированных RPM4,15
- Смешайте 30 г/л жидкости тиогликолат среднего, 60 г/л желатина, 5 г/л пептона, 5 г/л глюкозы, 5 г/л фосфатного экстракта калия, 3 г/л дрожжевого экстракта, 1,5 г/л хлорида натрия, 0,5 г/л ферросплавной сульфата в дейонизированной воде до равномерного рассеивания. Обычно мы делаем 1 L партий.
- Автоклав при 121 градусов по Цельсию в течение 15 мин.
- Дайте остыть примерно до 40 градусов по Цельсию.
- Как только RPM остынет, добавьте D-циклосерин к конечной концентрации 440 мг/л.
ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрации запасов D-циклоцерина, растворенного в стерильной воде при 50 мг/мл, могут храниться при -20 градусов по Цельсию для использования в будущем. - Асептические передачи 10 мл обрывков в 15 мл конических труб. RPM может быть подготовлен в пакетах и храниться при 4 градусах По Цельсию в течение одного месяца.
- Теплая об /RPM до 37 градусов по Цельсию до использования.
2. Сбор образцов и инкубация RPM
- Транспортировка продуктов питания в лабораторию при температуре окружающей среды в пределах 1 ч. Пища может перевозиться в оригинальной упаковке или стерильных контейнерах. Если не тестировать сразу, пища может храниться при -20 градусах Цельсия до использования. Обратите внимание на тип питания и страну происхождения в соответствии с этикеткой упаковки, если таковые имеются, а также любую другую соответствующую информацию.
- Удалить примерно 1,0-2,0 г пищи и передать стерильные Петри блюдо или эквивалент. Мелко фарш с стерильным лезвием или скальпелем.
- Прививать в 10 мл фосфата буферизированного солья (PBS) в 15 мл конической трубки. Хорошо перемешать.
- Чтобы выбрать для вегетативных клеток, перенесите 5 мл смеси PBS-пищевой в коническую трубку 15 мл, содержащую 10 мл об/мин. Закрепите крышку плотно.
- Чтобы выбрать для спор, нагреть оставшиеся 5 мл PBS-пищевой смеси на 85 градусов по Цельсию в течение 15 минут, а затем передать в 15 мл конической трубки, содержащей 10 мл об/мин. Закрепите крышку плотно.
- Vortex и инвертировать пищевой RPM культур для обеспечения полного смешивания.
- Плотно запечатать конические трубки и обернуть крышки с парафина пленки или полиэтиленовой пленки для обеспечения анаэробной среды.
- Инкубировать ночь (ON) при 37 градусах Цельсия.
- На следующее утро отмечают любую мутность или брожение в трубках RPM.
3. ТСК "сэндвич" покрытие
- Прививать ON RPM культур в TSC агар с помощью "сэндвич" техники (Рисунок 2), описанные ниже.
- Подготовьте TSC agar в рамках инструкций производителя.
- Приготовьте базовый слой пластин TSC, переведя 10 мл расплавленного агара TSC в стерильные блюда Петри и дайте затвердеть. Они могут быть подготовлены в передовых и храниться при 4 градусах Цельсия. Убедитесь, что пластины нагреваются до комнатной температуры перед использованием.
- Для верхнего слоя пластины TSC, поддерживать оставшиеся расплавленные TSC агар на 40 градусов по Цельсию.
ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя точка плавления агара выше 85 градусов по Цельсию, расплавленный агар затвердевает вокруг 32-45 градусов по Цельсию.
- Тщательно извлекайте культуры ON RPM и перенесите 100 л на базу агара TSC. Из-за брожения, некоторые культуры могут быть под давлением. Обязательно носите все соответствующие СИЗ.
- Распространение RPM inoculum с помощью стерилизованных стеклянных бусин или клеточного распределителя.
- Разрешить RPM быть "поглощены" в TSC агар в течение 5-10 минут при комнатной температуре.
- Аккуратно перенесите 20 мл расплавленного, 40 градусов по Цельсию tSC agar на тарелку с помощью серологического пипетки.
- Замените крышку чашки Петри и позвольте TSC agar полностью затвердеть при комнатной температуре.
- Перевернуть чашку Петри и инкубировать при 37-c ON.
- Если пожелается последовательное разбавление, выполните разбавления культур ON RPM в свежие, предварительно разогретые RPM до прививки в агар TSC.
4. Субкультирование колоний, сульфитных, снижающих
- На следующее утро, удалить пластины из инкубатора и изучить для роста бактерий. Аэробные бактерии могут присутствовать на поверхности агара. Анаэробные бактерии будут найдены растущие встроенные в агар. Сульфит-снижающие бактерии превратят окружающий агар черный цвет. Возможные колонии C. perfringens будут черными и встроенными в агар.
- C. perfringens подозреваемых колоний будет положительным для сокращения сульфита и появится черный, встроенный в агар. Используя стерильный одноразовый глазной дескупер, «срывать» черные колонии из агара и передавать до 10 мл свежего обрыва в конической трубке 15 мл. Важно, чтобы воздух из eyedropper быть исключены до пирсинга агара.
- Если есть плотное количество аэробных бактериальных роста на поверхности пластины, используйте стерильный скребок клеток, чтобы удалить колонии из отдельных областей. Несколько C. perfringens подозреваемых колоний могут быть отобраны из той же пластины TSC в отдельных культурах RPM.
- Плотно закрепите конические крышки трубки и заверните в парафина пленку или полиэтиленовую пленку. Инкубировать ON при 37 градусах Цельсия.
5. Извлечение ДНК
- Удалите культуры RPM и исследуете признаки роста, включая мутность и брожение.
- Аккуратно инвертируйте культуру RPM, чтобы разогнать любые оседлые бактерии и тщательно открыть. Передача 1 мл культуры в микроцентрифугую трубку.
- Центрифуга на максимальной скорости (примерно 15000 х г)в течение 10 мин, чтобы гранулы бактерий.
- Вымойте гранулы с 1 мл стерильных PBS.
- В некоторых случаях, непереваренный желатин будет оседать на вершине гранулированных бактерий. Чтобы удалить желатин, "пух" от желатина, мягко агитируя с PBS с помощью микропипетта. Это будет "пух"вверх" желатин, оставляя бактериальные гранулы нетронутыми.
- Удалите смесь PBS-желатина с нежным устремлением. Повторно приостановить оставшиеся бактериальные гранулы с 1 мл свежего PBS.
- Centrifuge повторно бактериальных гранул на максимальной скорости в течение 10 минут и тщательно аспирить супернатант.
- Немедленно выполняйте экстракцию ДНК с помощью комплекта для извлечения ДНК и протокола, специально созданного для извлечения ДНК из грамположительных бактерий (см. Таблицу Материалов).
- Используйте извлеченную ДНК немедленно или хранить на -20 градусов до ПЦР анализа.
6. Обнаружение C. perfringens через генотипирование ПЦР
- Чтобы определить, являются ли культуры положительными для C. perfringens токсинотипов, изучить извлеченные ДНК для различных генов токсина через ПЦР.
ПРИМЕЧАНИЕ: Потому что мы больше всего заинтересованы в эпсилон токсин производства штаммов типа B и D C. perfringens, мы оцениваем наличие альфа, бета, и эпсилон токсинов генов. Праймеры перечислены в таблице 2. Праймеры для 16s рибосомной ДНК используются в качестве контроля экстракции ДНК. Дополнительные праймеры могут быть использованы для тестирования на токсинотипы А через G и могут быть найдены в опубликованной литературе2,12,13. - Используйте ранее извлеченные C. perfringens ДНК в качестве положительного контроля. Этот контроль гарантирует, что все компоненты реакции ПЦР работают. Мы используем ДНК, извлеченную из C. perfringens типа B (ATCC 3626) в качестве нашего положительного контроля. Выращивайте ATCC 3636 ON в rPM при 37 градусах Цельсия и извлекайте ДНК с использованием тех же методов, описанных в шагах 5.1-5.7. Храните извлеченную ДНК при -20 градусах цельсия до использования.
- Установите условия ПЦР следующим образом: 94.0 C в течение 3 мин; 94.0 C на 30 с; 47,9 градуса по Цельсию на 30 с, 72,0 градуса по Цельсию в течение 1 мин (Повторите шаги 2-4 для 35 циклов); 72.0 C в течение 10 мин.
- Для подтверждения продуктов ПЦР запустите ПЦР-реакции на геле агарозы 1,8 г/100 мл с использованием стандартных методов. Ожидаемые размеры продуктов ПЦР перечислены в таблице 2. Типичные результаты ПЦР отображаются на рисунке 3.
Representative Results
Используя этот метод, 15-20% наших пробных продуктов тест положительный для C. perfringens. Хотя большинство штаммов являются положительными для токсинотипа А, мы успешно обнаружили как тип B и D в образцах пищевых продуктов. В ранее опубликованной статье мы протестировали в общей сложности 216 образцов продуктов питания, приобретенных в розничных магазинах Нью-йорка16 (Таблица 3). Эти образцы включали различные образцы мяса (говядина, баранина, свинина и баранина), образцы птицы (курица и индейка), а также образцы морепродуктов (треска, лосось, моллюски, окунь, камбала, кальмары, тилапии, тунец и различные другие рыбы). Были также протестированы образцы продукции и молочных продуктов. Из 216 образцов 34 (16%) были положительными для C. perfringens. Из 34 положительных проб C. perfringens 31 пробы (91,2%) содержал альфа-токсин, один образец (2,9%) содержалальфа альфа, бета и эпсилон токсин, и два образца (5,9%) содержал альфа и эпсилон токсина.
Интересно, что мы также обнаружили, что C. perfringens был более распространенным, как вегетативные клетки по сравнению со спорами. Двадцать пять образцов были сопоставлены для присутствия вегетативных клеток C. perfringens или спор. Споры были выбраны для тепла шокирующие образцы на 85 градусов по Цельсию в течение 15 минут. Из 25 проверенных образцов 16% были положительными для вегетативных штаммов C. perfringens против 4% для спор. Это означает, что это может быть более экономически эффективным для тестирования только для вегетативных клеток, а не оба.
Рисунок 1: Обзор процедуры.
Образцы пищевых продуктов измельчаются и разбавляются в стерильные PBS. Половина образца PBS-продуктов прививается в RPM для выбора вегетативных клеток. Оставшийся образец PBS-продуктов питания нагревается при температуре 85 градусов по Цельсию в течение 15 минут, чтобы выбрать для спор до прививки в RPM. Культуры инкубируются ON при 37 градусах Цельсия, затем покрыв их в агар TSC. TSC агар инкубируется ON при 37 градусах Цельсия и черный, сульфит-снижение культур суб-культуры в свежие RPM. Субкультурные культуры RPM инкубируются on при 37 градусах Цельсия, а ДНК извлекается для выполнения генотипирования через ПЦР. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Схема техники сэндвича TSC agar.
RPM-носители, содержащие бактерии C. perfringens, покрываются между двумя слоями агара TSC для содействия анаэробной среде. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Выбранные результаты ПЦР.
Примеры изображений генотипирования результатов C. perfringens из семи различных видов пищи, а также положительный контроль C. perfringens типа B. Молекулярная длинная лестница (первая полоса каждого геля) была использована для приблизительного размера результатов ПЦР в базовых парах (bp). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
| Токсинотип | Альфа | Бета-версия | Эпсилон | Iota | Cpe | NetB | |
| Установлено | A | + | - | - | - | - | - |
| B | + | + | + | - | - | - | |
| C | + | + | - | - | + | - | |
| D | + | - | + | - | + | - | |
| E | + | - | - | + | + | - | |
| Предлагаемые | F | + | - | - | - | + | - |
| Г | + | - | - | - | - | + | |
| - настоящее время - нет Вопрос/- может или не может присутствовать |
|||||||
Таблица 1: Обзор генотипов C. perfringens. Диаграмма комбинаций токсинов, производимых каждым C. perfringens токсинотипа.
| Целевой | Праймер пары | Ожидаемый продукт ПЦР (bp) |
| Альфа | F: GCT AAT GTT ACT GCC GTT GA R: CCT CTG ATA CAT CGT GTA AG |
325 |
| Бета-версия | F: GCG AAT ATG CTG AAT CAT CTA R: GCA GGA ACA TTa GTA TAT CTT C |
196 |
| Эпсилон | F: GCG GTG ATA TCC ATC TAT TC R: CCA CTT ACT TGT CCT ACT AAC |
655 |
| 16s РНК | F: AGA GTT TGA TCC TGG CTC A R: GGT TAC CTT GTT ACG ACT T |
1300 евро |
Таблица 2: Праймеры и ожидаемые продукты ПЦР для отдельных генов токсинов. Праймеры, используемые в шаге генотипирования ПЦР.
| Тип питания | Тип A | Тип B | Тип C | Тип D | C. perf | |||||||
| альфа-токсин положительный | альфа, бета, и эпсилон токсин положительный | альфа и бета-токсин положительный | альфа и эпсилон токсин положительный | |||||||||
| N | N | % | N | % | N | % | N | % | N | % | ||
| Мясо | Говядины | 38 | 8 | 21% | 1 | 3% | 0 | 0% | 0 | 0% | 9 | 24% |
| Баранина | 10 | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | |
| Свинины | 15 | 2 | 13% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 2 | 13% | |
| Смешанные | 1 | 1 | 100% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 1 | 100% | |
| Промежуточный итог | 64 | 11 | 17% | 1 | 2% | 0 | 0% | 0 | 0% | 12 | 19% | |
| Птицы | Курица | 19 | 5 | 26% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 5 | 26% |
| Турция | 7 | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | |
| Промежуточный итог | 26 | 5 | 19% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 5 | 19% | |
| Морепродукты | Трески | 4 | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% |
| Смешанные | 1 | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | |
| Лосось | 11 | 2 | 18% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 2 | 18% | |
| шельф | 32 | 1 | 3% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 1 | 3% | |
| Snapper | 4 | 3 | 75% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 3 | 75% | |
| Камбала | 12 | 4 | 33% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 4 | 33% | |
| Кальмар | 4 | 1 | 25% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 1 | 25% | |
| Тилапия | 21 | 2 | 10% | 0 | 0% | 0 | 0% | 2 | 10% | 4 | 19% | |
| Тунца | 3 | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | |
| Других | 8 | 1 | 13% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 1 | 13% | |
| Промежуточный итог | 100 | 14 | 14% | 0 | 0% | 0 | 0% | 2 | 2% | 16 | 16% | |
| Молочных | Корова | 3 | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% |
| Коза | 4 | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | |
| Молоко | 3 | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | |
| Промежуточный итог | 10 | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | |
| Производить | Овощей | 12 | 1 | 8% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 1 | 8% |
| Фрукты | 1 | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | |
| Травы | 3 | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | |
| Промежуточный итог | 16 | 1 | 6% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 1 | 6% | |
| Общая | 216 | 31 | 14% | 1 | 0.50% | 0 | 0% | 2 | 0.90% | 34 | 16% | |
Таблица 3: Распространенность различных C. perfringens токсинотипов в 216 образцах пищи. Пример результатов, полученных при использовании этого метода для тестирования розничных продуктов питания для C. perfringens. Эта таблица была изменена из ранее опубликованной рукописи Regan et al.16.
Discussion
Здесь мы описываем метод выявления распространенности C. perfringens в розничных образцах продуктов питания с ограниченным субкультивированием и без использования анаэробной камерной системы. Этот метод использует комбинацию методов для увеличения идентификации C. perfringens из образцов пищевых продуктов. Используя модифицированную версию носителей RPM, мы допускаем селективный рост C. perfringens. Путем зажав привитых RPM между слоями Агар TSC, мы можем определить и изолировать анаэробные, сульфит-снижающие бактерии, характерные для C. perfringens. Для подтверждения наличия C. perfringens,сульфит-снижающие колонии суб-культурны в свежие RPM. Модифицированная версия или RPM позволяет нам легко извлечь ДНК из культур, что позволяет ПЦР подтверждение конкретных генов токсина. Подтверждение C. perfringens загрязненных образцов пищевых продуктов может быть достигнуто в течение трех дней.
В ранних экспериментах образцы пищи были просто привиты в RPM и ДНК, извлеченные из ON культур. Этот метод привел к обнаружению C. perfringens в ограниченном числе образцов (данные не показаны). Хотя RPM является избирательным для роста C. perfringens, он не является эксклюзивным для роста C. perfringens. Другие, грамположительные, D-циклсерин устойчивые бактерии все еще могут расти в RPM. Мы предположили, что загрязнение другими бактериальными видами, возможно, уменьшило наше обнаружение штаммов C. perfringens за счет снижения чувствительности нашего анализа ПЦР в нашей первой культуре ON RPM. Важным шагом в увеличении обнаружения C. perfringens было включение tSC агар "сэндвич" техники. Это позволило нам дифференцировать и выбрать для анаэробных, сульфит-снижающих колоний, характерных для C. perfringens. Ключевым шагом в этом процессе является обеспечение того, чтобы верхний слой расплавленного агара TSC находится на уровне 40 градусов по Цельсию. Хотя некоторые штаммы C. perfringens могут расти при повышенной температуре (46-48 градусов по Цельсию)15,16, добавление расплавленного агара при повышенной температуре значительно снижает количество восстановленных культур, в основном, вероятно, из-за смерти клеток .
Существует несколько потенциальных ограничений для этого метода. Как упоминалось ранее, ни RPM, ни TSC агар выбирает или дифференцирует для C. perfringens исключительно, что позволяет для роста других видов бактерий, присутствующих в образцах продуктов питания. Это может снизить чувствительность ассса, чтобы выбрать только для C. perfringens. Тем не менее, это общее ограничение почти во всех методах культивирования. Генотипирование подтверждение очищенных изолятов является лучшим методом для окончательной идентификации C. perfringens и других видов бактерий. Еще одним ограничением этого исследования является то, что мы не тестируем очищенные изоляты. Мы специально сделали это, чтобы ограничить количество субкультивации, так как повторное субкультирование, как опасаются, приведет к потере плазмида. Поскольку мы не изолируем чистоту, вполне возможно, что несколько C. perfringens токсинотипов могут присутствовать в том же образце или субкультуры. Если исследователи хотят получить очищенные изоляты, стандартные методы очистки могут быть использованы на последней культуре RPM, описанной в этом методе; это обычно требует использования анаэробных камер. Хотя первоначально используется для изоляции C. perfringens от пищи, этот метод может быть использован для выявления и изоляции C. perfringens из множества источников. В частности, одним из таких применений этого метода является тестирование фекальных образцов от людей (или животных), которые, как предполагается, инфицированы C. perfringens и токсинотипа бактерий, чтобы лучше понять источник инфекции.
Disclosures
Никаких разоблачений.
Acknowledgments
Это исследование не получило какого-либо конкретного финансирования со стороны государственного, коммерческого или некоммерческого секторов.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| D-Cycloserine | Sigma-Aldrich | C6880 | |
| Dextrose | Sigma Life Science | D9434-250G | |
| Disposable Transfer Pipets | any brand | Select one with slim tip like Thermo Scientific Disposable Transfer Pipets 137116M/EMD | |
| DNeasy Blood & Tissue Kits | Qiagen | 69504 | Note: numerous DNA and plasmid extractions kits were evaluated, this kit gave the most desirable results. |
| Dry Incubator | any brand | ||
| Fluid thioglycolate medium | Remel | R453452 | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma Life Science | G1890-500G | |
| Individual Primers | Invitrogen | ||
| Iron (II) sulfate heptahydrate | Sigma Life Science | F8633-250 G | |
| Lysozyme from chicken egg white | Sigma-Aldrich | L6876 | Needed for DNA extraction, not provided in kit |
| microcentrifuge tube | any brand | ||
| parafilm or plastic wrap | any brand | ||
| Peptone from casein and other animal proteins | Sigma-Aldrich | 70173-100G | |
| Perfringens Agar Base (TSC + SFP) | Oxoid | CM0587 | Make TSC agar according to instructions |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | P2222-100G | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S-7653 | |
| Sterile Cell Scraper | any brand | ||
| Sterile cell Spreader | any brand | ||
| Sterile petri dishes | any brand | ||
| Supplies and equipment for gel electrophoresis | any brand | ||
| table top centrifuge | any brand | ||
| Taq PCR Master Mix Kit | Qiagen | 201443 | |
| Thermocycler for PCR reaction | any brand | ||
| water bath | any brand | ||
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | 70161-100G |
References
- Petit, L., Gibert, M., Popoff, M. R. Clostridium perfringens: toxinotype and genotype. Trends in Microbiology. 7, 104-110 (1999).
- Rood, J. I., et al. Expansion of the Clostridium perfringens toxin-based typing scheme. Anaerobe. , (2018).
- Murrell, T. G., O'Donoghue, P. J., Ellis, T. A review of the sheep-multiple sclerosis connection. Medical Hypotheses. 19, 27-39 (1986).
- Rumah, K. R., Linden, J., Fischetti, V. A., Vartanian, T. Isolation of Clostridium perfringens type B in an individual at first clinical presentation of multiple sclerosis provides clues for environmental triggers of the disease. PLoS One. 8, 76359 (2013).
- Wagley, S., et al. Evidence of Clostridium perfringens epsilon toxin associated with multiple sclerosis. Multiple Sclerosis. , 1352458518767327 (2018).
- Linden, J. R., et al. Clostridium perfringens Epsilon Toxin Causes Selective Death of Mature Oligodendrocytes and Central Nervous System Demyelination. MBio. 6, 02513 (2015).
- Popoff, M. R. Epsilon toxin: a fascinating pore-forming toxin. FEBS Journal. 278, 4602-4615 (2011).
- Lee, C. A., Labbe, R. Distribution of Enterotoxin- and Epsilon-Positive Clostridium perfringens Spores in U.S. Retail Spices. Journal of Food Protection. 81, 394-399 (2018).
- Wen, Q., McClane, B. A. Detection of enterotoxigenic Clostridium perfringens type A isolates in American retail foods. Applied and Environmental Microbiology. 70, 2685-2691 (2004).
- Cooper, K. K., Bueschel, D. M., Songer, J. G. Presence of Clostridium perfringens in retail chicken livers. Anaerobe. 21, 67-68 (2013).
- Strong, D. H., Canada, J. C., Griffiths, B. B. Incidence of Clostridium perfringens in American foods. Applied and Environmental Microbiology. 11, 42-44 (1963).
- Buogo, C., Capaul, S., Hani, H., Frey, J., Nicolet, J. Diagnosis of Clostridium perfringens type C enteritis in pigs using a DNA amplification technique (PCR). Journal of Veterinary Medicine, Series B. 42, 51-58 (1995).
- Yamagishi, T., Sugitani, K., Tanishima, K., Nakamura, S. Polymerase chain reaction test for differentiation of five toxin types of Clostridium perfringens. Microbiology and Immunology. 41, 295-299 (1997).
- Johansson, A., Engstrom, B. E., Frey, J., Johansson, K. E., Baverud, V. Survival of clostridium perfringens during simulated transport and stability of some plasmid-borne toxin genes under aerobic conditions. Acta Veterinaria Scandinavica. 46, 241-247 (2005).
- Erickson, J. E., Deibel, R. H. New medium for rapid screening and enumeration of Clostridium perfringens in foods. Applied and Environmental Microbiology. 36, 567-571 (1978).
- Regan, S. B., et al. Identification of epsilon toxin-producing Clostridium perfringens strains in American retail food. Anaerobe. 54, 124-127 (2018).
