Summary
El objetivo de este protocolo es detectar diferentes toxinatipos Clostridium perfringens en alimentos comprados localmente, particularmente toxina silon que produce cepas tipos B y D, sin el uso de cámaras anaeróbicas.
Abstract
Clostridium perfringens (C. perfringens) es un productor de toxinas prolífica y causa una amplia gama de enfermedades en varios huéspedes. C. perfringens se clasifica en cinco toxinatipos diferentes, De a E, basados en el transporte de cuatro genes de toxinas principales. La prevalencia y distribución de estos diversos toxinatipos está poco estudiada, especialmente su omnisividad en los alimentos minoristas estadounidenses. De particular interés para nosotros son las cepas tipo B y D, que producen toxina epsilon, una toxina extremadamente letal sugerida como el desencadenante ambiental de la esclerosis múltiple en los seres humanos. Para evaluar la presencia de diferentes toxinatipos de C. perfringens en varias muestras de alimentos, desarrollamos un método fácil para cultivar selectivamente estas bacterias sin el uso de un sistema de contenedores anaeróbicos que sólo implica tres pasos de cultivo. Los alimentos se compran en las tiendas de comestibles locales y se transportan al laboratorio en condiciones ambientales. Las muestras se pican e inoculan en medios de perfringens rápidos modificados (RPM) y se incuban durante la noche a 37 oC en un tubo cónico hermético y sellado. Los cultivos nocturnos se inoculan en una capa inferior de agar sólido de cicloserina de sullito de triptosa (TSC), y luego se superponen con una capa superior de agar TSC fundido, creando un ambiente anaeróbico "sandwiched". Las placas de agar se incuban durante la noche a 37 oC y luego se evalúan para la aparición de colonias negras que reducen el sulfito. C. las colonias sospechosas de perfringensse retiran del agar TSC utilizando cuentagotas estériles para los ojos, y se inoculan en RPM y se subcultivan durante la noche a 37 oC en un tubo cónico hermético. El ADN se extrae del subcultivo RPM y luego se analiza para detectar la presencia de genes de toxina C. perfringens a través de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Dependiendo del tipo de alimento muestreado, normalmente entre el 15 y el 20% de las muestras dan positivo para C. perfringens.
Introduction
Clostridium perfringens (C. perfringens) es una bacteria Gram positiva, anaeróbica, formando esporas, en forma de varilla que se encuentra ubicuamente en el medio ambiente. Esta especie de bacterias lleva genes que codifican más de 17 toxinas e, históricamente, se ha caracterizado en cinco toxinatipos (A-E) basados en la presencia de cuatro genes de toxinas diferentes: alfa, beta, épsilon y toxina iota(Tabla 1)1. Recientemente, se ha sugerido que este esquema de mecanografía debe ampliarse para incluir los tipos F y G, que albergan la enterotoxina C. perfringens (CPE) y la toxina NetB, respectivamente2. Sin embargo, se necesita más investigación antes de que este sistema de intriga sea aceptado formalmente. Mientras que el gen de la toxina alfa está estrictamente ubicado cromosómicamente, el gen CPE se puede encontrar tanto en el cromosoma como en los plásmidos. En comparación, los genes de las toxinas restantes se encuentran en varios plásmidos de diferente tamaño. Estamos particularmente interesados en la prevalencia de C. perfringens tipos B y D, ya que estas cepas producen toxina épsilon, una toxina extremadamente potente que forma los poros, que se ha sugerido que desempeña un papel en la activación de la esclerosis múltiple (SM) en humanos3 ,4,5,6,7. Se desconoce cómo las personas se infectan o colonizan por estas cepas. Una posible explicación es a través del consumo de productos alimenticios contaminados. Para ayudar a responder a esta pregunta, buscamos determinar la prevalencia de diferentes toxinatipos de C. perfringens en las muestras de alimentos estadounidenses.
La presencia de toxinas toxotipos De C. perfringens en muestras de alimentos estadounidenses está poco estudiada y a menudo requiere el uso de sistemas de contenedores anaeróbicos y numerosas etapas de subcultivo8,9,10,11 . Aunque se necesitan numerosas medidas de subcultivo para obtener aislados purificados, este método puede conducir a la pérdida de plásmidos a lo largo del tiempo12,13,14, lo que puede afectar a la detección de genes de toxinas transmitidas por plásmidos incluyendo el gen de la toxina épsilon. Buscamos desarrollar un método fácil, con menos pasos de sub-cultivo, para cultivar selectivamente C. perfringens sin el uso de cámaras anaeróbicas, frascos o bolsas. Brevemente, las muestras de alimentos se inoculan en Rapid Perfringens Media (RPM) durante la noche (ON), luego se "emparedado" en el agar TSC e incubados ON. Las colonias sospechosas de ser C. perfringens se subcultivan en RPM y se incuban de nuevo ON. Se extrae el ADN y se realiza la PCR para determinar el genotipo(Figura 1). Elegimos utilizar RPM ya que se ha demostrado para aumentar la recuperación de cepas de C. perfringens de muestras de alimentos en comparación con otros medios más estándar15. Además, RPM se utilizó con éxito para aislar una toxina de épsilon que produce cepa de tipo B de un paciente de MS4. Utilizamos una versión modificada de RPM en lugar de la versión original para permitir una fácil extracción de ADN. Si bien este método permite identificar fácilmente los genes de toxina dentro de las muestras, es posible que una muestra individual contenga más de un toxina C. perfringens. Debido a que nuestro método no aísla las cepas purificadas utilizando múltiples rondas de purificación, la identificación de múltiples xifotipos de una muestra no es posible. Sin embargo, las técnicas de purificación estándar (normalmente rayado en placas TSC o placas de agar de sangre) se pueden aplicar al final de nuestro protocolo para lograr cultivos purificados.
Protocol
NOTA: C. perfringens se considera un organismo de nivel de riesgo de bioseguridad 2 (BSL2). Aunque no todas las muestras de alimentos contendrán C. perfringens, todas las muestras cultivadas deben tratarse como tales. Todas las precauciones adecuadas y el equipo de protección del personal (PPE) deben ser usados en todo momento. Descontaminar todo el material antes de la eliminación.
1. Preparar RPMmodificadas 4,15
- Combinar 30 g/L de tioglicolato líquido medio, gelatina de 60 g/L, peptona de 5 g/L, glucosa de 5 g/L, fosfato de potasio de 5 g/L dibásico, extracto de levadura de 3 g/L, cloruro sódico de 1,5 g/L, sulfato ferroso de 0,5 g/L en agua desionizada hasta que se disperse uniformemente. Normalmente hacemos 1 L lotes.
- Autoclave a 121oC durante 15 min.
- Dejar enfriar a aproximadamente 40 oC.
- Una vez que RPM esté fría, añadir D-cicloserina a una concentración final de 440 mg/L.
NOTA: Las concentraciones de stock de D-cicloserina disuelta en agua estéril a 50 mg/ml pueden almacenarse a -20 oC para su uso futuro. - Transferencia aséptica de 10 ml de RPM a tubos cónicos de 15 ml. Rpm se puede preparar en lotes y almacenar a 4 oC durante un mes.
- RPM cálidas a 37 oC antes de su uso.
2. Recolección de muestras e incubación de RPM
- Transportar los alimentos al laboratorio a temperatura ambiente dentro de 1 h. Los alimentos pueden transportarse en envases originales o en recipientes estériles. Si no se prueba inmediatamente, los alimentos pueden almacenarse a -20 oC hasta su uso. Tome nota del tipo de alimento y del país de origen de acuerdo con la etiqueta del envase, si está disponible, así como cualquier otra información relevante.
- Retire aproximadamente 1.0–2.0 g de alimentos y transfiera a un plato estéril de Petri o equivalente. Picar finamente con una cuchilla de afeitar estéril o bisturí.
- Inocular en 10 ml de solución salina tamponada de fosfato (PBS) en un tubo cónico de 15 ml. Mezcla bien.
- Para seleccionar células vegetativas, transfiera 5 ml de la mezcla PBS-food a un tubo cónico de 15 ml que contenga 10 ml de RPM. Fije bien la tapa.
- Para seleccionar esporas, calentar los 5 ml restantes de la mezcla de ALIMENTOs PBS a 85 oC durante 15 minutos y, a continuación, transferir a un tubo cónico de 15 ml que contenga 10 ml de RPM. Fije bien la tapa.
- Vórtice e invierta los cultivos alimentarios-RPM para asegurar una mezcla completa.
- Selle bien los tubos cónicos y envuelva las tapas con película de parafina o envoltura de plástico para garantizar un ambiente anaeróbico.
- Incubar durante la noche (ON) a 37oC.
- A la mañana siguiente tenga en cuenta cualquier turbidez o fermentación en tubos RPM.
3. Revestimiento "sándwich" TSC
- Inocular los cultivos de RPM en el agar TSC utilizando una técnica de "sándwich"(Figura 2) que se describe a continuación.
- Prepare el agar TSC según las instrucciones del fabricante.
- Preparar la capa base de las placas TSC transfiriendo 10 ml de agar TSC fundido a platos estériles de Petri y dejar solidificar. Estos pueden ser preparados de forma avanzada y almacenados a 4 oC. Asegúrese de que las placas estén calentadas a temperatura ambiente antes de su uso.
- Para la capa superior de la placa TSC, mantenga el agar TSC fundido restante a 40 oC.
NOTA: Aunque el punto de fusión del agar está por encima de 85 oC, el agar fundido solidifica entre 32 y 45 oC.
- Recupere cuidadosamente los cultivos DE RPM ON y transfiera 100 l a la base de agar TSC. Debido a la fermentación, algunos cultivos pueden estar bajo presión. Asegúrese de usar todos los EPP apropiados.
- Extienda el inóculo de RPM con cuentas de vidrio esterilizadas o esparcidor celular.
- Deje que las RPM se "absorban" en el agar TSC durante 5-10 min a temperatura ambiente.
- Transfiera cuidadosamente 20 ml de agar TSC fundido a 40 oC a placa utilizando una pipeta serológica.
- Sustituya la tapa de la placa Petri y deje que el agar TSC se solidifique completamente a temperatura ambiente.
- Invertir la placa Petri e incubar a 37oC ON.
- Si se desean diluciones en serie, realice diluciones de los cultivos ON RPM en RPM frescas y precalentadas antes de la inoculación en el agar TSC.
4. Subcultivo de colonias reductoras de sulfito
- A la mañana siguiente, retire las placas de la incubadora y examine el crecimiento bacteriano. Las bacterias aeróbicas pueden estar presentes en la superficie del agar. Las bacterias anaeróbicas se encontrarán creciendo incrustadas dentro del agar. Las bacterias que reducen el sulfito se volverán negras para el agar circundante. Las posibles colonias de C. perfringens serán negras e incrustadas en el agar.
- C. perfringens colonias sospechosas serán positivas para la reducción de sulfito y aparecerán negro, incrustado dentro del agar. Usando un cuentagotas estéril de un solo uso, "pluck" las colonias negras del agar y transferir a 10 mL de RPM frescas en un tubo cónico de 15 ml. Es importante que el aire del cuentagotas sea expulsado antes del agar penetrante.
- Si hay una densa cantidad de crecimiento bacteriano aeróbico en la superficie de la placa, utilice un rascador de células estériles para eliminar las colonias de las áreas seleccionadas. Múltiples Colonias sospechosas de C. perfringens se pueden muestrear desde la misma placa TSC en cultivos de RPM separados.
- Fije firmemente las tapas cónicas del tubo y envuélvalas en película de parafina o envoltura de plástico. Incubar ON a 37oC.
5. Extracción de ADN
- Retire los cultivos de RPM y examine los signos de crecimiento, incluida la turbidez y la fermentación.
- Invierta suavemente el cultivo de RPM para dispersar cualquier bacteria asentada y abrir cuidadosamente. Transfiera 1 ml del cultivo a un tubo de microcentrífuga.
- Centrífuga a máxima velocidad (aproximadamente 15.000 x g)durante 10 minutos a las bacterias pellets.
- Lavar el pellet con 1 ml de PBS estéril.
- En algunas circunstancias, la gelatina no digerida se asentará sobre bacterias peletizadas. Para eliminar la gelatina, "fluff" de la gelatina agitando suavemente con PBS usando un micropités. Esto "fluff-up" la gelatina mientras que deja el pellet bacteriano intacto.
- Retire la mezcla DE PBS-gelatina con una aspiración suave. Vuelva a suspender el pellet bacteriano restante con 1 ml de PBS fresco.
- Centrifugar el pellet bacteriano resuspendido a máxima velocidad durante 10 minutos y aspirar cuidadosamente al sobrenadante.
- Realizar inmediatamente la extracción de ADN utilizando un kit de extracción de ADN y un protocolo creado específicamente para la extracción de ADN de bacterias Gram-positivas (ver la Tabla de Materiales).
- Utilice el ADN extraído inmediatamente o guárdelo a -20 oC hasta el análisis de PCR.
6. Detección de C. perfringens a través del genotipado de PCR
- Para determinar si los cultivos son positivos para los toxinas c. perfringens, examine el ADN extraído para diferentes genes de toxinas a través de PCR.
NOTA: Debido a que estamos más interesados en la toxina de épsilon que produce cepas tipo B y D C. perfringens, evaluamos la presencia de los genes de toxina alfa, beta y épsilon. Los primers se enumeran en la Tabla 2. Los imprimadores para ADN ribosomal de 16s se utilizan como control de extracción de ADN. Se pueden utilizar imprimaciones adicionales para probar los toxinatipos A a G y se pueden encontrar en la literatura publicada2,12,13. - Utilice el ADN de C. perfringens extraído previamente como un control positivo. Este control garantiza que todos los componentes de las reacciones PCR estén funcionando. Utilizamos ADN extraído de C. perfringens tipo B (ATCC 3626) como nuestro control positivo. Crecer ATCC 3636 ON en RPM a 37 oC y extraer ADN utilizando los mismos métodos descritos en los pasos 5.1–5.7. Almacenar el ADN extraído a -20 oC hasta su uso.
- Establecer las condiciones de PCR de la siguiente manera: 94,0 oC durante 3 min; 94,0 oC para 30 s; 47,9 oC para 30 s, 72,0 oC durante 1 min (repetir los pasos 2–4 para 35 ciclos); 72,0 oC durante 10 min.
- Para confirmar los productos de PCR, ejecute reacciones de PCR en un gel de agarosa de 1,8 g/100 ml utilizando técnicas estándar. Los tamaños de producto de PCR esperados se enumeran en la Tabla 2. Los resultados típicos de LA PCR se muestran en la Figura 3.
Representative Results
Usando este método, 15–20% de nuestros alimentos muestreados dan positivo para C. perfringens. Si bien la mayoría de las cepas son positivas para el toxinatipo A, hemos detectado con éxito tanto el tipo B como el D en las muestras de alimentos. En un artículo publicado anteriormente probamos un total de 216 muestras de alimentos comprados en tiendas minoristas de Nueva York16 (Tabla 3). Estas muestras incluían varias muestras de carne (carne de res, cordero, cerdo y cordero), muestras de aves de corral (pollo y pavo) y muestras de mariscos (bacalao, salmón, mariscos, pargos, flounder, calamar, tilapia, atún y varios otros peces). También se analizaron muestras de productos y lácteos. De 216 muestras, 34 (16%) fueron positivos para C. perfringens. De las 34 muestras positivas de C. perfringens, 31 muestras (91,2%) contiene la toxina alfa, una muestra (2,9%) contenía la toxina alfa, beta y epsilon, y dos muestras (5,9%) contenía la toxina alfa y épsilon.
Curiosamente, también descubrimos que C. perfringens era más frecuente como células vegetativas en comparación con las esporas. Se compararon veinticinco muestras por la presencia de células o esporas vegetativas de C. perfringens. Las esporas fueron seleccionadas por muestras de choque térmico a 85 oC durante 15 min. De las 25 muestras analizadas, el 16% fueron positivas para cepas vegetativas de C. perfringens frente al 4% para las esporas. Esto indica que puede ser más rentable probar sólo las células vegetativas en lugar de ambas.
Figura 1: Visión general del procedimiento.
Las muestras de alimentos se pican y se diluyen en PBS estéril. La mitad de la muestra de ALIMENTOs PBS se inocula en RPM para seleccionar células vegetativas. La muestra de ALIMENTOs PBS restante se toma calor a 85 oC durante 15 minutos para seleccionar las esporas antes de la inoculación en RPM. Los cultivos se incuban a 37oC y luego se enchapan en agar TSC. El agar TSC se incuba a 37 oC y los cultivos negros que reducen el sulfito se subcultivan en RPM frescas. Los cultivos de RPM subcultivados se incuban a 37 oC y se extrae ADN para realizar genotipado a través de PCR. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Esquema de la técnica de sándwich de agar TSC.
Los medios RPM que contienen las bacterias C. perfringens se celenan entre dos capas de agar TSC para promover un ambiente anaeróbico. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Resultados de PCR seleccionados.
Ejemplos de imágenes de los resultados de genotipado de C. perfringens de siete tipos diferentes de alimentos, y un control positivo de C. perfringens tipo B. Se utilizó una escalera de peso molecular (primer carril de cada gel) para aproximar el tamaño de los resultados de PCR en pares de bases (bp). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Toxinatipo | Alfa | Beta | Epsilon | Iota | Cpe | NetB | |
| Establecido | Un | + | - | - | - | - | - |
| B | + | + | + | - | - | - | |
| C | + | + | - | - | + | - | |
| D | + | - | + | - | + | - | |
| E | + | - | - | + | + | - | |
| Propuesto | F | + | - | - | - | + | - |
| G | + | - | - | - | - | + | |
| + presente - no presente +/- puede o no estar presente |
|||||||
Tabla 1: Visión general de los genotipos de C. perfringens. Un gráfico de las combinaciones de toxinas producidas por cada C. perfringens toxinotipo.
| Objetivo | Pares de primer | Producto PCR esperado (bp) |
| Alfa | F: GCT AAT GTT ACT GCC GTT GA R: CCT CTG ATA CAT CGT GTA AG |
325 |
| Beta | F: GCG AAT ATG CTG AAT CAT CTA R: GCA GGA ACA TTA GTA TAT CTT C |
196 |
| Epsilon | F: GCG GTG ATA TCC ATC TAT TC R: CCA CTT ACT TGT CCT ACT AAC |
655 |
| ARN 16s | F: AGA GTT TGA TCC TGG CTC A R: GGT TAC CTT GTT ACG ACT T |
1300 ? |
Tabla 2: Primers y productos de PCR previstos para genes de toxinaseleccionados seleccionados. Primers utilizados en el paso de genotipado de PCR.
| Tipo de alimento | Tipo A | Tipo B | Tipo C | Tipo D | C. perf + | |||||||
| toxina alfa positiva | alfa, beta y toxina epsilon positiva | toxina alfa y beta positiva | toxina alfa y epsilon positiva | |||||||||
| N | N | % | N | % | N | % | N | % | N | % | ||
| Carne | Carne | 38 | 8 | 21% | 1 | 3% | 0 | 0% | 0 | 0% | 9 | 24% |
| Cordero | 10 | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | |
| Cerdo | 15 | 2 | 13% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 2 | 13% | |
| Mezclado | 1 | 1 | 100% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 1 | 100% | |
| Subtotal | 64 | 11 | 17% | 1 | 2% | 0 | 0% | 0 | 0% | 12 | 19% | |
| Aves | Pollo | 19 | 5 | 26% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 5 | 26% |
| Turquía | 7 | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | |
| Subtotal | 26 | 5 | 19% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 5 | 19% | |
| Mariscos | Bacalao | 4 | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% |
| Mezclado | 1 | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | |
| Salmón | 11 | 2 | 18% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 2 | 18% | |
| shelfish | 32 | 1 | 3% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 1 | 3% | |
| Pargo | 4 | 3 | 75% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 3 | 75% | |
| Platija | 12 | 4 | 33% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 4 | 33% | |
| Calamar | 4 | 1 | 25% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 1 | 25% | |
| Tilapia | 21 | 2 | 10% | 0 | 0% | 0 | 0% | 2 | 10% | 4 | 19% | |
| Atún | 3 | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | |
| Otro | 8 | 1 | 13% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 1 | 13% | |
| Subtotal | 100 | 14 | 14% | 0 | 0% | 0 | 0% | 2 | 2% | 16 | 16% | |
| Lácteos | Vaca | 3 | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% |
| Cabra | 4 | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | |
| Leche | 3 | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | |
| Subtotal | 10 | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | |
| Producir | Vegetal | 12 | 1 | 8% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 1 | 8% |
| Fruta | 1 | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | |
| Hierba | 3 | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | |
| Subtotal | 16 | 1 | 6% | 0 | 0% | 0 | 0% | 0 | 0% | 1 | 6% | |
| Total | 216 | 31 | 14% | 1 | 0.50% | 0 | 0% | 2 | 0.90% | 34 | 16% | |
Tabla 3: Prevalencia de diferentes toxinatipos C. perfringens en 216 muestras de alimentos. Un ejemplo de los resultados obtenidos al utilizar este método para probar alimentos al por menor para C. perfringens. Esta tabla ha sido modificada del manuscrito publicado anteriormente Regan et al.16.
Discussion
Aquí describimos un método para identificar la prevalencia de C. perfringens en muestras de alimentos al por menor con subcultura limitada y sin el uso de un sistema de cámara anaeróbica. Este método utiliza una combinación de técnicas para aumentar la identificación de C. perfringens a partir de muestras de alimentos. Mediante el uso de una versión modificada de medios RPM, permitimos el crecimiento selectivo de C. perfringens. Al intercalar las RPM inoculadas entre capas de agar TSC, somos capaces de identificar y aislar bacterias anaeróbicas que reducen el sulfito características características de C. perfringens. Para confirmar la presencia de C. perfringens,las colonias reductoras de sulfito se subcultivan en RPM frescas. La versión modificada o RPM nos permite extraer fácilmente ADN de cultivos, permitiendo la confirmación por PCR de genes de toxinas específicos. La confirmación de C. perfringens muestras de alimentos contaminados se puede lograr en un plazo de tres días.
En los primeros experimentos, las muestras de alimentos simplemente se inocularon en RPM y el ADN se extrajo de cultivos ON. Este método dio lugar a la detección de C. perfringens en un número limitado de muestras (datos no mostrados). Aunque RPM es selectivo para el crecimiento de C. perfringens, no es exclusivo para el crecimiento de C. perfringens. Otras bacterias, gram-positivas, resistentes a la D-cicolserina todavía pueden crecer en RPM. Hemos planteado la hipótesis de que la contaminación por otras especies bacterianas puede haber disminuido nuestra detección de cepas de C. perfringens al disminuir la sensibilidad de nuestro análisis de PCR en nuestro primer cultivo EN RPM. Un paso crítico para aumentar la detección de C. perfringens fue la inclusión de la técnica de "sándwich" de agar TSC. Esto nos permitió diferenciar nos y seleccionar colonias anaeróbicas que reducen el sulfito, características de C. perfringens. Un paso clave en este proceso es asegurar que la capa superior del agar TSC fundido esté a 40 oC. Aunque algunas cepas de C. perfringens pueden crecer a temperaturas crecientes (46-48 oC)15,16, la adición de agar fundido a temperaturas crecientes reduce en gran medida la cantidad de cultivos recuperados, principalmente probablemente debido a la muerte celular .
Hay varias limitaciones potenciales a este método. Como se mencionó anteriormente, ni el agar RPM ni TSC selecciona o diferencia exclusivamente para C. perfringens, permitiendo el crecimiento de otras especies bacterianas presentes en las muestras de alimentos. Esto puede reducir la sensibilidad del ensayo para seleccionar solo para C. perfringens. Sin embargo, esta es una limitación común en casi todas las técnicas de cultivo. La confirmación de genotipado de aislados purificados es el mejor método para identificar definitivamente C. perfringens y otras especies bacterianas. Otra limitación de este estudio es que no probamos los aislados purificados. Lo hicimos a propósito para limitar la cantidad de subcultura, ya que se teme que la subcultura repetida resulte en pérdida de plásmido. Debido a que no aislamos a la pureza, es posible que múltiples toxinas c. perfringens puedan estar presentes en la misma muestra o subcultivo. Si los investigadores desean obtener aislados purificados, se pueden utilizar métodos de purificación estándar en el último cultivo de RPM descrito en este método; esto normalmente requiere el uso de cámaras anaeróbicas. Aunque originalmente se utiliza para aislar C. perfringens de los alimentos, este método se puede utilizar para identificar y aislar C. perfringens de una multitud de fuentes. Específicamente, una de estas aplicaciones de este método es probar muestras fecales de seres humanos (o animales) que se sospecha que están infectados con C. perfringens y toxinotipo de la bacteria para entender mejor la fuente de infección.
Disclosures
Sin revelaciones.
Acknowledgments
Esta investigación no recibió ninguna financiación específica de los sectores público, comercial o sin fines de lucro.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| D-Cycloserine | Sigma-Aldrich | C6880 | |
| Dextrose | Sigma Life Science | D9434-250G | |
| Disposable Transfer Pipets | any brand | Select one with slim tip like Thermo Scientific Disposable Transfer Pipets 137116M/EMD | |
| DNeasy Blood & Tissue Kits | Qiagen | 69504 | Note: numerous DNA and plasmid extractions kits were evaluated, this kit gave the most desirable results. |
| Dry Incubator | any brand | ||
| Fluid thioglycolate medium | Remel | R453452 | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma Life Science | G1890-500G | |
| Individual Primers | Invitrogen | ||
| Iron (II) sulfate heptahydrate | Sigma Life Science | F8633-250 G | |
| Lysozyme from chicken egg white | Sigma-Aldrich | L6876 | Needed for DNA extraction, not provided in kit |
| microcentrifuge tube | any brand | ||
| parafilm or plastic wrap | any brand | ||
| Peptone from casein and other animal proteins | Sigma-Aldrich | 70173-100G | |
| Perfringens Agar Base (TSC + SFP) | Oxoid | CM0587 | Make TSC agar according to instructions |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | P2222-100G | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S-7653 | |
| Sterile Cell Scraper | any brand | ||
| Sterile cell Spreader | any brand | ||
| Sterile petri dishes | any brand | ||
| Supplies and equipment for gel electrophoresis | any brand | ||
| table top centrifuge | any brand | ||
| Taq PCR Master Mix Kit | Qiagen | 201443 | |
| Thermocycler for PCR reaction | any brand | ||
| water bath | any brand | ||
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | 70161-100G |
References
- Petit, L., Gibert, M., Popoff, M. R. Clostridium perfringens: toxinotype and genotype. Trends in Microbiology. 7, 104-110 (1999).
- Rood, J. I., et al. Expansion of the Clostridium perfringens toxin-based typing scheme. Anaerobe. , (2018).
- Murrell, T. G., O'Donoghue, P. J., Ellis, T. A review of the sheep-multiple sclerosis connection. Medical Hypotheses. 19, 27-39 (1986).
- Rumah, K. R., Linden, J., Fischetti, V. A., Vartanian, T. Isolation of Clostridium perfringens type B in an individual at first clinical presentation of multiple sclerosis provides clues for environmental triggers of the disease. PLoS One. 8, 76359 (2013).
- Wagley, S., et al. Evidence of Clostridium perfringens epsilon toxin associated with multiple sclerosis. Multiple Sclerosis. , 1352458518767327 (2018).
- Linden, J. R., et al. Clostridium perfringens Epsilon Toxin Causes Selective Death of Mature Oligodendrocytes and Central Nervous System Demyelination. MBio. 6, 02513 (2015).
- Popoff, M. R. Epsilon toxin: a fascinating pore-forming toxin. FEBS Journal. 278, 4602-4615 (2011).
- Lee, C. A., Labbe, R. Distribution of Enterotoxin- and Epsilon-Positive Clostridium perfringens Spores in U.S. Retail Spices. Journal of Food Protection. 81, 394-399 (2018).
- Wen, Q., McClane, B. A. Detection of enterotoxigenic Clostridium perfringens type A isolates in American retail foods. Applied and Environmental Microbiology. 70, 2685-2691 (2004).
- Cooper, K. K., Bueschel, D. M., Songer, J. G. Presence of Clostridium perfringens in retail chicken livers. Anaerobe. 21, 67-68 (2013).
- Strong, D. H., Canada, J. C., Griffiths, B. B. Incidence of Clostridium perfringens in American foods. Applied and Environmental Microbiology. 11, 42-44 (1963).
- Buogo, C., Capaul, S., Hani, H., Frey, J., Nicolet, J. Diagnosis of Clostridium perfringens type C enteritis in pigs using a DNA amplification technique (PCR). Journal of Veterinary Medicine, Series B. 42, 51-58 (1995).
- Yamagishi, T., Sugitani, K., Tanishima, K., Nakamura, S. Polymerase chain reaction test for differentiation of five toxin types of Clostridium perfringens. Microbiology and Immunology. 41, 295-299 (1997).
- Johansson, A., Engstrom, B. E., Frey, J., Johansson, K. E., Baverud, V. Survival of clostridium perfringens during simulated transport and stability of some plasmid-borne toxin genes under aerobic conditions. Acta Veterinaria Scandinavica. 46, 241-247 (2005).
- Erickson, J. E., Deibel, R. H. New medium for rapid screening and enumeration of Clostridium perfringens in foods. Applied and Environmental Microbiology. 36, 567-571 (1978).
- Regan, S. B., et al. Identification of epsilon toxin-producing Clostridium perfringens strains in American retail food. Anaerobe. 54, 124-127 (2018).
