Målet med denne protokollen er å oppdage ulike perfringens toxinotypes i lokalt kjøpte matvarer, spesielt Epsilon gift produserer belastningstyper B og D, uten bruk av anaerobe kamre.
Perfringens (C. perfringens) er en produktiv gift produsent og forårsaker et bredt spekter av sykdommer i ulike verter. C. perfringens er kategorisert i fem forskjellige Toxinotypes, A til E, basert på befordring av fire store gift gener. Utbredelsen og fordelingen av disse ulike toxinotypes er lite studert, spesielt deres Gjennomtrengningskraft i amerikansk detaljhandel mat. Av spesiell interesse for oss er typen B og D stammer, som produserer Epsilon gift, en ekstremt dødelige giftstoffer foreslått å være miljømessig utløse multippel sklerose hos mennesker. For å evaluere tilstedeværelsen av forskjellige C. perfringens toxinotypes i ulike matvare prøver, utviklet vi en enkel metode for å selektivt kultur disse bakteriene uten bruk av en anaerob container system bare involverer tre dyrking trinn. Mat kjøpes fra lokale dagligvarebutikker og transporteres til laboratoriet under omgivelsesforhold. Prøvene er hakket og inokulert i modifiserte raske perfringens medier (RPM) og inkubert over natten ved 37 ° c i et forseglet, lufttett konisk rør. Overnatting kulturer er inokulert på et nederste lag av solid Tryptose sulfitt Cycloserine (TSC) agar, og deretter kledde med et øverste laget av smeltet TSC agar, og skaper en “klemt”, anaerob miljø. Agar platene er inkubert over natten på 37 ° c og deretter evaluert for utseende av svarte, sulfitt-reduserende kolonier. C. perfringens-mistenkte kolonier er fjernet fra TSC agar ved hjelp av sterile øye droppers, og INOKULERT inn RPM og sub-kultivert overnatting ved 37 ° c i en lufttett konisk rør. DNA er Hentet fra RPM under kultur, og deretter analysert for tilstedeværelsen av C. perfringens gift gener via polymerase kjedere reaksjon (PCR). Avhengig av type mat samplet, typisk 15-20% av prøvene teste positivt for C. perfringens.
Perfringens (C. perfringens) er et gram positivt, anaerob, spore-forming, stang formet bakterie som er funnet overalt i miljøet. Denne arten av bakterier bærer gener som koder for over 17 giftstoffer og, historisk, har vært karakterisert i fem toxinotypes (A-E) basert på tilstedeværelsen av fire forskjellige gift gener: alpha, beta, Epsilon, og iota gift (tabell 1)1. Nylig har det blitt antydet at dette skrive-ordningen må utvides til å omfatte typer F og G, som havna i C. perfringens ENTEROTOKSIN (CPE) og NetB gift, henholdsvis2. Men mer forskning er nødvendig før dette utspekulerte systemet er formelt akseptert. Mens alfa giften genet er strengt chromosomally plassert, kan CPE genet finnes både på kromosom og plasmider. Til sammenligning er de resterende giftstoffer ‘ gener finnes på ulike forskjellig størrelse plasmider. Vi er spesielt interessert i utbredelsen av C. perfringens typer B og D som disse stammene produsere Epsilon gift, en svært potent, pore-forming gift, som har blitt foreslått å spille en rolle i å utløse multippel SKLEROSE (MS) hos mennesker3 ,4,5,6,7. Hvordan folk blir smittet eller kolonisert av disse stammer er ukjent. En mulig forklaring er gjennom inntak av forurensede matvarer. For å bidra til å besvare dette spørsmålet, forsøkte vi å bestemme utbredelsen av ulike C. perfringens Toxinotypes i amerikansk mat prøver.
Tilstedeværelsen av C. perfringens toxinotypes i amerikanske matvare prøver er lite studert og krever ofte bruk av anaerobe container systemer og mange sub-dyrking trinn8,9,10,11 . Selv om mange dyrking trinn er nødvendig for å oppnå renset isolat, kan denne metoden føre til tap av plasmider over tid12,13,14, muligens påvirker påvisning av plasmider-borne gift gener inkludert Epsilon giften genet. Vi forsøkte å utvikle en enkel metode, med færre sub-dyrking trinn, til selektivt kultur C. perfringens uten bruk av anaerobe kamre, krukker, eller vesker. Kort, matvare prøver er inokulert i Rapid Perfringens Media (RPM) over natten (ON), deretter “klemt” inn TSC agar og inkubert ON. Kolonier mistenkt for å være C. perfringens er deretter sub-KULTIVERT i RPM og INKUBERT igjen på. DNA er ekstrahert og PCR utføres for å bestemme genotype (figur 1). Vi valgte å bruke RPM som det har vist seg å øke utvinningen av C. perfringens stammer fra matvare prøver sammenlignet med andre mer standard Media15. I tillegg ble RPM vellykket brukt til å isolere en Epsilon gift som produserer type B-stamme fra en MS pasient4. Vi bruker en modifisert versjon av RPM i stedet for den opprinnelige versjonen for å tillate enkel DNA-ekstraksjon. Selv om denne metoden gir enkel identifisering av gift gener i prøver, er det mulig at en enkelt prøve vil inneholde mer enn en C. perfringens toxinotype. Fordi vår metode ikke isolere renset stammer ved hjelp av flere runder med rensing, er identifisering av flere toxinotypes fra en prøve ikke mulig. Men, standard rensing teknikker (vanligvis striper på TSC plater eller blod agar plater) kan brukes på slutten av vår protokoll for å oppnå renset kulturer.
Her beskriver vi en metode for å identifisere C. perfringens prevalens i detaljhandel matvare prøver med begrenset subculturing og uten bruk av et anaerob kammer system. Denne metoden bruker en kombinasjon av teknikker for å øke identifisering av C. perfringens fra matvare prøver. Ved å bruke en modifisert versjon av RPM Media, tillater vi for selektiv vekst av C. perfringens. Ved sandwiching inokulert RPM mellom lag av TSC agar, er vi i stand til å identifisere og isolere anaerob, sulfitt bakterier karakteristisk for C. perfringens. For å bekrefte tilstedeværelsen av C. perfringens, sulfitt-reduserende kolonier er sub-kultivert i frisk RPM. Den modifiserte versjonen eller RPM gjør det mulig for oss å enkelt trekke ut DNA fra kulturer, slik at PCR-bekreftelse av spesifikke gift gener. Bekreftelse av C. perfringens forurenset matvare prøver kan oppnås innen tre dager.
I tidlige eksperimenter, var matvare prøver bare inokulert inn RPM og DNA utvunnet fra ON kulturer. Denne metoden resulterte i påvisning av C. perfringens i et begrenset antall prøver (data ikke vist). Selv om RPM er selektiv for c. perfringens vekst, er det ikke eksklusivt for c. perfringens vekst. Andre, gram-positive, D-cycolserine resistente bakterier kan fortsatt vokse i RPM. Vi hypotetisk gjennomsnitt at forurensning av andre bakterielle arter kan ha redusert vår påvisning av C. perfringens stammer ved å redusere følsomheten til vår PCR-analyse i vår første på RPM kultur. Et kritisk skritt i å øke påvisning av C. perfringens var inkluderingen av TSC agar “sandwich” teknikk. Dette tillot oss å skille og velge for anaerobe, sulfitt-reduserende kolonier, karakteristisk for C. perfringens. Et viktig trinn i denne prosessen er å sikre at det øverste laget av smeltet TSC agar er på 40 ° c. Selv om noen C. perfringens stammer kan vokse ved økte temperaturer (46 – 48 ° c)15,16, tillegg av smeltet agar ved økte temperaturer sterkt reduserer mengden av kulturer utvinnes, mest sannsynlig på grunn av celle død .
Det finnes flere mulige begrensninger på denne metoden. Som nevnt tidligere, verken RPM eller TSC agar velger eller skiller for C. perfringens eksklusivt, slik at for vekst av andre bakterielle arter til stede i matvare prøver. Dette kan redusere følsomheten til analysen å velge for C. perfringens bare. Dette er imidlertid en felles begrensning i nesten alle dyrking teknikker. Genotyperingteknologi bekreftelse av renset isolat er den beste metoden for definitivt å identifisere C. perfringens og andre bakterielle arter. En annen begrensning av denne studien er at vi ikke tester renset isolerer. Vi hensikt gjorde dette for å begrense mengden av subculturing, som gjentas subculturing er fryktet å resultere i plasmider tap. Fordi vi ikke isolere til renhet, er det mulig at flere C. perfringens toxinotypes kan være til stede i samme prøve eller under kultur. Hvis forskerne ønsker å få renset isolerer, standard rensing metoder kan brukes på den siste RPM kulturen beskrevet i denne metoden; Dette krever vanligvis bruk av anaerobe kamre. Selv om den opprinnelig ble brukt til å isolere c. perfringens fra mat, kan denne metoden brukes til å identifisere og isolere C. perfringens fra en rekke kilder. Nærmere bestemt en slik anvendelse av denne metoden er å teste avføringsprøver fra mennesker (eller dyr) som er mistenkt for å være smittet med C. perfringens og toxinotype bakteriene til bedre å forstå kilden til infeksjonen.
The authors have nothing to disclose.
Denne forskningen har ikke mottatt noen konkrete midler fra offentlige, kommersielle eller ikke-for profitt sektorer.
D-Cycloserine | Sigma-Aldrich | C6880 | |
Dextrose | Sigma Life Science | D9434-250G | |
Disposable Transfer Pipets | any brand | Select one with slim tip like Thermo Scientific Disposable Transfer Pipets 137116M/EMD | |
DNeasy Blood & Tissue Kits | Qiagen | 69504 | Note: numerous DNA and plasmid extractions kits were evaluated, this kit gave the most desirable results. |
Dry Incubator | any brand | ||
Fluid thioglycolate medium | Remel | R453452 | |
Gelatin from porcine skin | Sigma Life Science | G1890-500G | |
Individual Primers | Invitrogen | ||
Iron (II) sulfate heptahydrate | Sigma Life Science | F8633-250 G | |
Lysozyme from chicken egg white | Sigma-Aldrich | L6876 | Needed for DNA extraction, not provided in kit |
microcentrifuge tube | any brand | ||
parafilm or plastic wrap | any brand | ||
Peptone from casein and other animal proteins | Sigma-Aldrich | 70173-100G | |
Perfringens Agar Base (TSC + SFP) | Oxoid | CM0587 | Make TSC agar according to instructions |
Potassium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | P2222-100G | |
Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S-7653 | |
Sterile Cell Scraper | any brand | ||
Sterile cell Spreader | any brand | ||
Sterile petri dishes | any brand | ||
Supplies and equipment for gel electrophoresis | any brand | ||
table top centrifuge | any brand | ||
Taq PCR Master Mix Kit | Qiagen | 201443 | |
Thermocycler for PCR reaction | any brand | ||
water bath | any brand | ||
Yeast extract | Sigma-Aldrich | 70161-100G |