Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Cancer Research

Generering av en Liver Orthotopic Human uveal melanom Xenograft Platform i Immunodeficient mus

doi: 10.3791/59941 Published: November 6, 2019

Summary

Orthotopic Human lever metastatisk uveal melanom xenograft mus modeller ble opprettet ved hjelp av kirurgiske Orthotopic implantation teknikker med pasient-avledet tumor blings og nål injeksjon teknikker med kultivert menneskelig uveal melanom cellelinjer.

Abstract

I de siste ti årene, subkutant implantert pasient-avledet xenograft svulster eller kultivert menneskelige cellelinjer har blitt stadig mer anerkjent som mer representative modeller for å studere menneskelig kreft i immunodeficient mus enn tradisjonelle etablerte menneskelige celle linjer in vitro. Nylig, orthotopically implantert pasient-avledet tumor xenograft (PDX) modeller i mus har blitt utviklet for å bedre gjenskape funksjoner av pasient svulster. En lever orthotopic xenograft musen modell forventes å bli en nyttig kreften forskning plattform, skaffer innblikk i svulst Biology og bedøve terapi. Imidlertid er leveren orthotopic tumor implantation generelt komplisert. Her beskriver vi våre protokoller for orthotopic implantation av pasient-avledet lever-metastatisk uveal melanom svulster. Vi kultivert menneskelig lever metastatisk uveal melanom cellelinjer i immunodeficient mus. Protokollene kan resultere i gjennomgående høy teknisk suksess priser ved hjelp av enten en kirurgisk orthotopic implantation teknikk med biter av pasient-avledet uveal melanom tumor eller en nål injeksjon teknikk med kultivert menneskelig cellelinje. Vi beskriver også protokoller for CT skanning å oppdage interiør leversvulster og for re-implantation teknikker bruker embryo svulster å oppnå re-engraftment. Sammen, disse protokollene gir en bedre plattform for leveren orthotopic tumor mus modeller av leveren metastatisk uveal melanom i translational forskning.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Uveal melanom er den vanligste intraokulært ondartet svulst blant voksne i den vestlige verden. I løpet av de siste 50 årene har forekomsten av uveal melanom (5,1 tilfeller per million) forblitt stabil i USA1,2. Uveal melanom oppstår fra melanocytter i Iris, ciliary kroppen, eller akkord, og det er en ekstremt dødelig sykdom når den utvikler metastasering. Dødeligheten av pasienter med uveal melanom metastasering var 80% ved 1 år og 92% ved 2 år etter første diagnostisering av metastaser. Tiden mellom diagnostisering av metastaser og død er vanligvis kort, mindre enn 6 måneder, uten hensyn til terapi3,4. Kreften sprer seg gjennom blodet og har en tendens til å nesten kun metastase til leveren (89-93%)4,5. En effektiv musemodell er et presserende behov for videre etterforskning av leveren-metastatisk uveal melanom. For translational forskning, det er et klart behov for å generere en lever-lokaliserte metastatisk uveal melanom musemodell.

En pasient-avledet tumor xenograft (PDX) musemodeller forventes å gi individualisert medisin strategier. Disse modellene kan være prediktiv av kliniske utfall, være nyttig for prekliniske narkotika evaluering, og brukes til biologiske studier av svulster6. Representative PDX-modeller er jektopicheski tumor-implantert xenograft mus, som har tumor på subkutan nettsteder. De fleste forskere kan gjøre kirurgi for subkutan implantation uten spesiell praksis7,8. De kan også overvåke subkutan svulster lett. Selv om subkutan PDX-modeller ble populære i forsknings fasen, har de noen hindringer i bevegelse til praktisk bruk. Subkutan implantation styrker pasient-avledede svulster å engraft på en annen mikromiljøet fra tumor opprinnelse, slik at det fører til engraftment svikt og langsom tumor vekst 9,10,11, 12,13,14. Orthotopic engraftment kan være en mer ideell og rasjonell tilnærming for en PDX modell fordi den bruker samme organ som den opprinnelige tumor15,16.

Nylig utviklet vi protokoller for kirurgiske orthotopic implantation teknikker av pasient-avledet lever-metastatisk uveal melanom svulster og nål injeksjon teknikker med en kultivert menneskelig lever-metastatisk uveal melanom cellelinje i NOD. CG-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (nsg) mus17,18. Protokollene resulterer i gjennomgående høye tekniske suksessrater. Vi har også etablert CT-skanning teknikker som er nyttige for å oppdage interiør leverskader svulster, og vi utviklet ny implantation av embryo svulster i PDX plattform. Vi fant at uveal melanom tumor xenograft modeller opprettholde egenskapene til den opprinnelige pasienten leveren svulst, inkludert deres histopathological og molekylære funksjoner. Sammen, disse teknikkene gir en bedre plattform for leveren orthotopic tumor modeller for uveal melanom i translational forskning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Pasienter som deltar i studien bør gi skriftlig samtykke som tillater bruk av kasserte kirurgiske prøver for forskningsformål og genetiske studier, ifølge en institusjonell gjennomgang Board-godkjent protokoll. Denne protokollen ble utført i nøye samsvar med anbefalingene i guide for omsorg og bruk av laboratorium dyr av National Institutes of Health og godkjent av institusjonelle Animal Care og use Committee (IACUC).

1. innsamling av frisk pasient-avledet tumor vev

  1. Få pasient-avledet tumor vev fra kirurgi eller en nål biopsi i et sykehus operasjonsrom.
  2. Sett tumorvevet i en 100 mL beholder som inneholder Hanks ' balansert saltløsning (HBSS)-løsning på is.
  3. Overfør vevet inn i en steril hette (biosafety nivå 2) i et laboratorium.
  4. Fortsett til trinn 2 så snart som mulig.
    Merk: Av sikkerhetsmessige grunner, utelukke pasienter med kjent HIV eller hepatitt B eller C infeksjoner.

2. behandling av fersk pasient-avledet tumor vev

  1. Sett vevet i et 50 mL rør som inneholder fosfat-bufret saltvann (PBS) på is. For å vaske vevet, Legg PBS i røret og kast PBS fra røret to ganger.
  2. Overfør vevet inn i en Petri rett som inneholder PBS på isen.
  3. Ved hjelp av steril pinsett og saks, fjerne nekrotisk deler av vevet. Hold vevet fuktig og kaldt i trinn 2,3 til 2,5. For nål biopsi prøver, hoppe trinn 2,3 og 2,5, og ikke kutte prøvene.
    Merk: Den nekrotisk vev ofte bryter hverandre lett når rørt.
  4. Skjær vevet i 1 mm3 kuber for kirurgisk lever implantation.
  5. Skjær resten av vevet i 2 mm kuber i Petri parabolen.
  6. Overfør dem til en 1,7 mm microtube med 4% formalin for histologiske analyse og til et annet rør for genomisk og Proteomikk analyse.
  7. Sett mikrorør i et flytende nitrogen krukke med flytende nitrogen. Overfør rørene til en-80 ° c fryser for permanent oppbevaring.
    Merk: Tiden mellom prøve fjerning fra pasienten og vevs behandlingen bør ikke overstige 30 min.

3. kirurgisk leveren implantation med pasient-avledet tumor vev

  1. Spray alle gjenstander som kommer inn i panseret for kirurgi med 70% etanol.
    Merk: Dette inkluderer Kirurgiske instrumenter, Varmeputer, og anestesi maskiner.
  2. Målvekten av en bomullspinne og stoff ark.
  3. Bedøve en mus med en 3-5% isoflurane fordamper ved å plassere den i induksjon kammeret.
  4. Når musen er helt anesthetized, Legg den i liggende posisjon på en varmepute. Plasser isoflurane kjegle på musen snute å inhalere 1.5-3% isoflurane for vedlikehold av anestesi.
    Merk: Musen må være på varmeputen under hele prosedyren. Mangel på oppvarming kan føre til nedkjøling.
  5. Bekreft riktig anestesi uten reaksjon når foten av musen er stukket med ultrafine tang.
  6. Injiser buprenorfin (0,6 mg/kg) subkutant på flanken ved hjelp av en 27 G nål på en mikro sprøyte før operasjonen.
  7. Påfør 70% etanol i magen og sprer pelsen oppover og nedover. Etter å spre pelsen, bekrefter lettere visualisering av huden under venstre subcostal området for en enklere kutt. Ikke barbere av pelsen fra magen.
    Merk: Pelsen vil skjule snittområdet etter operasjonen og hindre musen fra å skrape snittet innlegget operasjonen. Du kan imidlertid barbere pelsen for å hindre smitte av innsnitt området i henhold til institusjonelle standarder.
  8. Påfør jod og la det bli absorbert inn i huden.
  9. Plasser en steril kirurgisk gardin med et 2 cm hull på musen.
  10. Løft abdominal hud med buet ultrafine tang og gjøre en 1 cm tverrgående venstre subcostal huden snitt med buet saks.
  11. Sett tuppen av den buede saks under huden av snittet og litt åpne dem for å skille peritoneum fra huden. Trekke saksen fra snittet med lukkede kniver.
    Merk: Åpning og lukking saks inne i musen kan forårsake skade og blødning.
  12. Finn leveren under peritoneum. Bekreft en mørk rødlig farge gjennom peritoneum.
  13. Med buet saks, lage en 1 cm tverrgående snitt i peritoneum. Hvis en bukhulen blør fra cutting edge, umiddelbart stoppe blødningen med cauterization.
  14. Grab fettvev ved hjelp av buede ultrafine tang med en hånd, setter kanten av en bomullsdott under venstre leveren flik og rull pinnen nedover med den andre hånden for å hente ut leveren.
    Merk: Gripe fettvev er viktig å holde fettvev fra stikker til bomullsdott.
  15. Eksteriorisere leveren på bomullspinnen og plasser leveren på en ikke-vevd absorberende stoff ark.
    Merk: Stoffet arket spiller to viktige roller i å stabilisere leveren og absorberende blødning.
  16. Lag et snitt 5 mm i bredde og dybde ved hjelp av en steril no. 11 skalpell blad for å danne en lomme i parenchyma mens sakte trykke innsnitt området med bomullspinnen.
    1. Sett bladet parallelt med overflaten av leveren og kuttet horisontalt.
    2. Trykk på snittstedet med bomullspinnen for å stanse eventuelle blødninger.
      Merk: Ikke Hold bladet vertikalt, ellers vil du bryte gjennom leveren og skade store fartøy i midten av leveren.
  17. Roll bomullspinnen oppover for å åpne snittområdet og implantatet en 1 mm3 kube av tumor vev i lommen med buet ultrafine tang. Trekk ut pinsett mens du ruller bomullspinnen i reversrotasjon og trykke ned.
    Merk: Trykke ned på snittet området med bomullsdott mens trekke tang bidrar til å hindre forskyvning av svulsten inne i lommen.
  18. Ta bomullspinnen forsiktig av snittstedet etter implantation. Fortsett til trinn 3,19 så snart som mulig.
  19. Sett en absorberbare hemostat på snittstedet.
  20. Bekreft hemostase. Hvis blødningen fortsetter, legge til flere hemostat på snittet nettstedet.
  21. Skrell leveren av stoffet ark med tang (fortrinnsvis sløv-avsluttet) og sette leveren tilbake i bukhulen.
  22. Sutur peritoneum med doble ligatur med 5-0 absorberbare Sutur.
  23. Sutur huden med trippel ligatur ved hjelp av 5-0 absorberbare Sutur.
    Merk: Trippel ligatur bidrar til å forhindre kirurgisk snitt dehiscence.
  24. Observer musa til helt våken og putte den rygg inne byrået.
  25. Målvekten av bomullspinnen og stoffet ark med blod for blødning volum under operasjonen. Sammenlign dem med sine opprinnelige vekter før kirurgi. Reduser blødning under operasjonen til mindre enn 10% av sirkulerende blod volum i musen.

4. innsamling og bearbeiding av kultivert Human Liver metastatisk uveal melanom celle line

  1. Forbered kultivert celler.
  2. Samle celler og beregne celle tallet ved hjelp av en celle teller.
  3. Forbered en passende mengde celle suspensjon for 10,0 x 106 celler i et 15 ml rør.
  4. Snurr røret på 300 x g i 5 minutter i en sentrifuge ved romtemperatur.
  5. Fjern supernatanten i 15 mL røret. La cellen pellet på bunnen av røret.
  6. Tilsett 50 μL av RPMI 1640 medium i et 1,7 mL rør.
  7. Klipp tuppen av en 200 μL spiss med saks for å forstørre spiss åpningen.
  8. Tilsett 60 μL av matrise med kjeller membran ved hjelp av en pipette med kutt spissen i 1,7 mL røret som har RPMI.
  9. Bland RPMI og matrise i 1,7 mL røret. En virvel.
  10. Tilsett 110 μL av blandingen i celle pellet i 15 mL rør. Overfør celle fjæringen til en ny 1,7 mL slange.
  11. Hold røret på isen før nålen injeksjon.

5. kirurgisk nål implantation av kultivert Human Liver metastatisk uveal melanom Cellelinje i Liver

  1. Følg protokollen ovenfor fra trinn 3,1 til 3,15.
  2. Samle celle suspensjonen med en microsyringe med en 27 G nål.
  3. Sett nålen langs overflaten av leveren og fremme spissen av nålen 5 mm dypere.
  4. Injiser 20 μL av celle fjæring i leveren.
  5. Cauterize innsettingspunktet for leveren for å hindre at de innsatte cellene lekker ut. Bekreft hemostase.
  6. Følg protokollen ovenfor fra trinn 3,21 til 3,24.

6. CT Skann

  1. Plasser musen i en restrainer i våken tilstand.
  2. Tørk halen med en steril alkohol pute for desinfeksjon og vasodilatasjon.
  3. Injiser 100 μL av CT kontrastmiddel gjennom hale vene med en 27 G nål på en 1 mL sprøyte.
  4. Vent 4 timer etter injeksjonen før du tar CT-skanningen.
    Merk: Det tar 4 t til agenten er tatt opp av leveren Kupffer celler.
  5. Fire timer etter injeksjonen bedøve den svulst bær ende musen med 3 – 5% fordampet isoflurane ved å plassere den i induksjon kammeret.
  6. Når musen er helt anesthetized, plasser den i liggende posisjon på en CT. Plasser isoflurane kjegle på musen snute å inhalere 1.5-3% isoflurane for vedlikehold av anestesi.
  7. Bekreft riktig anestesi uten reaksjon når foten av musen er stukket med ultrafine tang.
  8. Ta en CT-skanning i 15 minutter.
  9. Sikre det det musen til det er en fullt ut våkne etter det CT avsøke og putte den rygg inn i bur.
  10. Evaluere for eksistensen av tumor og måle tumor størrelse på CT bilder.
    Merk: Kontrasten agent forbedrer normal leveren parenchyma slik at det er lett å anerkjenne Ikkeforbedrede svulst. Ikke feiltolke galleblæren og magen som svulst.

7. høsting og bearbeiding tissue

  1. Euthanize mus bruker CO2 etterfulgt av cervical forvridning ved å plassere pekefingeren og tommelen bak skallen og trekke kroppen ved foten av halen. Fortsett til trinn 7,2 så snart som mulig.
  2. Plasser musen i en liggende posisjon og spray magen med 70% etanol.
  3. Bruk steril tang og steril saks for å gjøre en 3-cm tverrgående snitt under xiphoid prosessen for å avdekke abdominal organer.
  4. Avgiftsdirektoratet den tumor vev og utføre trinn 2,1 til 2,2.
  5. Skjær resten av svulsten i 2 mm terninger i Petri parabolen.
  6. Overfør dem til et kryogene rør med cryomedium for re-implantat etter kryonisk bevaring.
  7. Sett rørene i en kryogene fryseboks fylt med isopropanol.
  8. Overfør beholderen til en-80 ° c fryser for midlertidig lagring. Ikke sett cryotubes med cryomedium direkte inn i en væske nitrogen tank. Frys dem langsomt med en kjøle hastighet på-1 ° c/min for å bevare tumorvevet.
  9. På neste dag, overføre rørene til en flytende nitrogen tank for permanent lagring.

8. re-implantat

  1. Hold rørene frosset i en flytende nitrogen krukke med flytende nitrogen til klar til implantat vev. Minimer eksponeringen av vevet til romtemperatur for å opprettholde levedyktigheten og øke sjansene for engraftment.
  2. Tin embryo tube i et vannbad på 37 ° c.
  3. Utfør trinn 2.2 – 2.4.
  4. Implantat den tint svulst i mus som beskrevet i trinn 3.1-3.24.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Kirurgisk orthotopic implantation bruker leveren Pocket metoden kan transplantasjon menneskelig leveren metastatisk uveal melanom svulst i musen leveren med en høy suksess rate på 80% innen seks måneder. Den xenograft tumor engrafts i leveren som en ensom svulst uten datter knuter (figur 1 og figur 3a). Den kirurgiske orthotopic injeksjon teknikk i leveren bruker microneedles vellykket engrafted kultivert menneskelig lever-metastatisk uveal melanom celler i leveren i alle tilfeller (figur 2 og figur 3b). Men noen tilfeller hadde formidling rundt hoved svulsten. Kontrast agenten oppdager svulster i leveren på CT, inkludert små svulster i 1 mm størrelse (figur 3b). Re-implantation av embryo svulster vellykket etablerte dem i musen leveren med høy suksess priser. Re-implantert xenograft svulster etter kryonisk bevaring beholde karakteristikkene av den opprinnelige pasienten svulster og pre-embryo svulster.

Figure 1
Figur 1: pasient-avledet tumor xenograft musemodell ved kirurgisk orthotopic leveren implantation. Mouse ble euthanized etter 6 måneder etter tumor implantation. Pigmentert svart svulst (svart pil) er uveal melanom. Svulsten er engrafted i venstre flik av leveren. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: Liver orthotopic menneskelige cellelinje-avledet tumor xenograft musemodell ved hjelp av nål injeksjon metode. Mouse ble euthanized 8 uker etter tumor injeksjon. Pigmentert svart svulst (svart pil) er uveal melanom. Svulsten er engrafted i venstre flik av leveren. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: CT bilder av leverskader svulster i venstre flik av leveren. Leverskader svulster oppdages på forbedret CT. normal leveren vev forsterkes av kontrastmiddel. Hvite piler indikerer magen ved siden av leveren. (A) svulsten (svart pil) som tidligere ble vist i figur 1. Kirurgisk orthotopic implantation danner en ensom svulst. (B) svulster (svart pil) vist tidligere i figur 2. Nål injeksjon metoden danner en klynge av mange små svulster. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: tekniske tips for leveren Pocket metoden. (A-C) Venstre flik (hvite piler) av leveren kan utsettes ut av magen ved hjelp av en bomullspinne (svart pil) via en 1 cm snitt. En retractor er ikke nødvendig å utvide snittet. (D) bomullsdott presser på snittet sakte. Det oppnår hemostase etter å gjøre et snitt av skalpell (grønn pil). (E) bomullspinne ruller oppover (buet rød pil). Dette heiser leveren parenchyma å åpne snittet. Svulsten gul pil) er satt inn i leveren lommen gjennom snittet av ultrafine tang (blå pil). (F) bomullsdott ruller nedover (buet rød pil) for å hindre en innsatt svulst i lommen fra backing ut. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

De nåværende orthotopic xenograft modellene er arbeidskrevende, tidkrevende og kostbart å skape. Orthotopic tumor xenograft mus modeller for leverkreft ble etablert mer enn to ti år siden19,20,21. Imidlertid er denne teknikken komplisert og krever bruk av spesialutstyr, for eksempel en mikro-nål holderen og 6-0 til 8-0 fine sting under et mikroskop. Tumor og normalt lever vev må sys opp nøye slik at Sutur ikke skader den skjøre leveren vev. De konvensjonelle teknikkene fører til komplikasjoner, slik som hematom og nekrose22. Nylig ble en modifisert teknikk utviklet for å løse disse problemene23. Denne modifiserte teknikken bruker absorberbare hemostatic materialer i stedet for Sutur å dekke svulsten på leveren overflaten. Men, denne endrede metoden ikke helt dekker svulsten i leveren parenchyma. En del av svulsten er eksponert for utsiden. Vi utviklet en kirurgisk orthotopic implantation teknikk-leveren Pocket metode-for å huse svulsten helt inne i parenchyma18. Vår metode gjør en lomme i leveren for å gi et naturlig miljø for svulster. Leveren Pocket metoden er enklere enn den konvensjonelle teknikken, slik at vi kan fullføre implantation inn i leveren i løpet av få minutter fra begynnelsen av operasjonen. Denne metoden resulterer i dannelse av en ensom svulst i leveren og utløser ikke metastaser, iallfall så lenge vi observert musene, mens nålen injeksjon av en enkelt celle suspensjon tendens til å spre som intra-hepatic metastaser17. En ensom svulst er mer hensiktsmessig å evaluere tumor vekst og ville være nyttig å vurdere effekten i et medikament prøveversjon.

Sammenlignet med den opprinnelige leveren Pocket metode18, har vi endret våre metoder for å forbedre teknikker for implantation. Først ble en retractor ikke brukt under operasjonen for å minimere størrelsen på snittet. Når snittet er mindre, kan vi forkorte sy tid i kirurgi. Med en 1 cm snitt i magen, kan vi enkelt bringe venstre flik utenfor med en bomullsdott (figur 4a-C). For det andre spiller en bomullsdott tre viktige roller ved å stoppe hemostase etter at leveren lommen, åpne leveren lommen for å kunne sette inn en svulst blings og beholde tumor blings i lommen uten å skyve svulsten tilbake (figur 4d- F). Gjennomsnittlig blødnings volum var omtrent mindre enn 10% av sirkulerende blod volum hos mus. Mindre blødning gitt stor tillit til kirurgi. For det tredje er et stoff ark nyttig for å feste leveren flik utenfor magen. Leveren flik pinner til arket og dermed hindrer at fliken glir tilbake i magen (figur 4c). Man kan enkelt skjære leveren overflaten med en skalpell og injisere en nål til leveren overflaten. Som et resultat, er skjøre leveren vev ikke skadet.

Vi presenterer to feilsøkingstips for denne metoden. Først når et lite snittområdet brukes, noen ganger en venstre flik er ikke synlig. I denne situasjonen er den venstre flik sannsynligvis stikker til membranen. Sett inn avstumpet tang mellom venstre flik og membranen for å skrelle av fliken. For det andre, når en svulst blings er plassert i leveren lommen med tang, kan svulsten holde seg til pinsett og trekke tilbake med den. Trykk på snittet med en bomullsdott mens trekker tilbake den tang. Dette fungerer godt for å hindre forvridning av svulsten ut av lommen.

Xenograft svulster er omgitt av mus vev, selv om de er orthotopically implantert. Human stromal celler i pasient-avledede svulster er uunngåelig erstattet av mus stromal celler. Ideal, musa modell fikk bedre skaffe Human stromal tissue i nærheten svulst. Chimeric humanisert lever mus eller humanisert uimottakelig mus modeller ville være nyttig å studere engraftment av uveal melanom og å vurdere om stoffet metabolisme er det samme som en menneske-lever eller menneske-immun miljø24,25.

Orthotopic lever svulst xenograft mus modeller krever verifisering av tumor etablering med bildebehandling studier. Den kommersielt tilgjengelige CT kontrastmiddel, utviklet for mus leveren CT bilder, tillater påvisning av interiør leversvulster i live-tilstand på CT. Kontrast agenten forbedrer spesielt normal lever på CT. Det er lett å skille Ikkeforbedrede stedet av tumor26. Agenten oppdager små svulster mindre enn 1 mm (datter knuter) rundt viktigste svulster på CT. Agenten kan tolereres av musen, og gjør det mulig å overvåke leverskader svulster med jevne mellomrom. Agenten vil bli brukt til å evaluere effekten av anti-kreft narkotika mot leveren lokaliserte xenograft svulster.

Generelt er det anbefalt å opprettholde PDX modeller på et relativt lavt passasje tall (mindre enn 10) for å bevare genetisk og histologiske integritet av den opprinnelige pasient-avledet tumor27,28,29. De fleste forskere avstår fra å lage flere passasjer av PDX-modellene for å redusere antall passasjer og dyr. Når pasient-avledede svulster er midlertidig bevart i en fryser, er vi i stand til å kontrollere PDX modeller på et lavere passasje nummer uten å sløse med mus. Dette kalles biobanking strategi. En kreft biobank er en rasjonell tilnærming for å opprettholde tumor egenskaper og for å redusere antall mus28,30. Etablering av en skikkelig biobanking metode kan justere tilførselen av PDX modeller for å møte pasientens behandlingsplan eller en mus narkotika effekt prøve i fremtiden. Vi oppnådde re-implantation av embryo svulster for kreft biobanking. Vi håper at denne suksessen forenkler PDX plattform bruk i nær fremtid.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Vi er takknemlige for M. Ohara, K. Saito, og M. Terai, for å ha gjennomgått manuskriptet. Forfatterne erkjenner kritisk vurdering for redaksjonelle og engelsk bistand av dette manuskriptet av Dr. R. Sato på Fox Chase Cancer Center. Arbeidet beskrevet her ble støttet av Bonnie Kroll Research Fund, The Merk Weinzierl Research Fund, Eye melanom Research Fund ved Thomas Jefferson University, The Osaka Community Foundation, og JSP KAKENHI Grant Number JP 18K15596 i Osaka City University. Studier i Dr. A. Aplin laboratorium ble støttet av NIH Grant R01 GM067893. Dette prosjektet ble også finansiert av en Dean ' s bearbeidet Science Award, en Thomas Jefferson University programmatisk Initiative Award.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Materials, tissues and animals
Buprenorphine
CO2 tank
Cryomedium
Exitron nano 12000 (Alkaline earth metal-based nanoparticle contrast agent) Miltenyl Biotec 130-095-700
HBSS 1x, with calcium & magnesium Corning 21-020-CM
Human liver metastatic uveal melanoma cell line
Human uveal melanoma tissue in the liver All tissue handling should be done in a Biosafety Level 2 hood. Be careful when working with human tissue; always use gloves and avoid direct skin contact. Assume patients may have been infected with HIV or other highly transmissible organisms. Do not process samples known to carry infections.
Iodine
Isoflurane Purdue Products 67618-150-17
Isopropanol Fisher scientific A416-1 Avoid direct contact to skin and eye and inhalation of anesthetic agent.
Liquid nitrogen
Matrigel HC BD 354248
NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) mice Jackson Lab 5557 4 to 8 weeks old
PBS 1x, without calcium and magnesium Corning 21-031-CM
RPMI 1640 Corning 10-013-CV
Sterile alcohol prep pad (70% isopropyl alcohol) Nice-Pak products B603
4% paraformaldehyde phosphate buffer solution Wako 163-20145
70% Ethyl alcohol solution Fisher Scientific 04-355-122
Name Company Catalog Number Comments
Equipments
Absorbable hemostat Johnson and Johnson 63713-0019-61
Autoclave
Body weight measure
Cautery Bovie Medical MC-23009
Cell counter
Centrifuzer
Cotton swab
Cryo freezing container NALGENE 5100-0001
Cryotube SARSTEDT 72.379
Curved scissors World Precision Instruments 503247
Curved ultrafine forceps World Precision Instruments 501302
Fabric sheet
Freezer
F/AIR Filter Canister Harvard Apparatus 600979
Heating pad
Isoflurane vaporizer Artisan Scientific 66317-1
Liquid nitrogen
Liquid nitrogen jar Thermo Fisher Scientific 2123
Micro-CT scan Siemens
Needle holder World Precision Instruments 501246
Petri dishes Fisher Scientific FB0875713
Pipette
Spray bottle
Sterile hood Biosafety level 2 cabinet
Sterile No.11 scalpel AD Surgical A300-11-0
Straight forceps World Precision Instruments 14226
Surgical drape
Tail vein restrainer Braintree Scientific TV-150-STD
Water bath
1 mL TB syringe with 27 G needle BD 309623
1.7 mL tube Bioexpress C-3260-1
5-0 PDO Suture AD Surgical S-D518R13
15 mL conical tubes AZER SCIENTIFIC ES-9152N
27 G needle BD 780301
27 G needle Hamilton 7803-01
50 mL conical tubes AZER SCIENTIFIC ES-9502N
50 µL micro syringe BD 80630
50 µL micro syringe Hamilton 7655-01
100 mL container Fisher Scientific 12594997
200μL tip

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Aronow, M. E., Topham, A. K., Singh, A. D. Uveal Melanoma: 5-Year Update on Incidence, Treatment, and Survival (SEER 1973-2013). Ocular Oncology and Pathology. 4, (3), 145-151 (2018).
  2. Krantz, B. A., Dave, N., Komatsubara, K. M., Marr, B. P., Carvajal, R. D. Uveal melanoma: epidemiology, etiology, and treatment of primary disease. Clinical Ophthalmology. 11, 279-289 (2017).
  3. Gragoudas, E. S., et al. Survival of patients with metastases from uveal melanoma. Ophthalmology. 98, (3), 383-389 (1991).
  4. Diener-West, M., et al. Development of metastatic disease after enrollment in the COMS trials for treatment of choroidal melanoma: Collaborative Ocular Melanoma Study Group Report No. 26. Archives of Ophthalmology. 123, (12), 1639-1643 (2005).
  5. Collaborative Ocular Melanoma Study Group. Assessment of metastatic disease status at death in 435 patients with large choroidal melanoma in the Collaborative Ocular Melanoma Study (COMS): COMS report no. 15. Archives of Ophthalmology. 119, (5), 670-676 (2001).
  6. Hidalgo, M., et al. Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research. Cancer Discovery. 4, (9), 998-1013 (2014).
  7. Kim, M. P., et al. Generation of orthotopic and heterotopic human pancreatic cancer xenografts in immunodeficient mice. Nature Protocols. 4, (11), 1670-1680 (2009).
  8. Némati, F., et al. Establishment and characterization of a panel of human uveal melanoma xenografts derived from primary and/or metastatic tumors. Clinical Cancer Research. 16, (8), 2352-2362 (2010).
  9. Wilmanns, C., et al. Modulation of Doxorubicin sensitivity and level of p-glycoprotein expression in human colon-carcinoma cells by ectopic and orthotopic environments in nude-mice. International Journal of Oncology. 3, (3), 413-422 (1993).
  10. Kang, Y., et al. Proliferation of human lung cancer in an orthotopic transplantation mouse model. Experimental and Therapeutic. 1, (3), 471-475 (2010).
  11. Fichtner, I., et al. Establishment of patient-derived non-small cell lung cancer xenografts as models for the identification of predictive biomarkers. Clinical Cancer Research. 14, (20), 6456-6468 (2008).
  12. Marangoni, E., et al. A new model of patient tumor-derived breast cancer xenografts for preclinical assays. Clinical Cancer Research. 13, (13), 3989-3998 (2007).
  13. Bergamaschi, A., et al. Molecular profiling and characterization of luminal-like and basal-like in vivo breast cancer xenograft models. Molecular Oncology. 3, (5-6), 469-482 (2009).
  14. Ho, K. S., Poon, P. C., Owen, S. C., Shoichet, M. S. Blood vessel hyperpermeability and pathophysiology in human tumour xenograft models of breast cancer: a comparison of ectopic and orthotopic tumours. BMC Cancer. 12, 579 (2012).
  15. Hoffman, R. M. Patient-derived orthotopic xenografts: better mimic of metastasis than subcutaneous xenografts. Nature Reviews Cancer. 15, (8), 451-452 (2015).
  16. Rubio-Viqueira, B., Hidalgo, M. Direct in vivo xenograft tumor model for predicting chemotherapeutic drug response in cancer patients. Clinical Pharmacology & Therapeutics. 85, (2), 217-221 (2009).
  17. Ozaki, S., et al. Establishment and Characterization of Orthotopic Mouse Models for Human Uveal MelanomaHepatic Colonization. American Journal of Pathology. 186, (1), 43-56 (2016).
  18. Kageyama, K., et al. Establishment of an orthotopic patient-derived xenograft mouse model using uveal melanomahepatic metastasis. Journal of Translational Medicine. 15, (1), 145 (2017).
  19. Fu, X. Y., Besterman, J. M., Monosov, A., Hoffman, R. M. Models of human metastatic colon cancer in nude mice orthotopically constructed by using histologically intact patient specimens. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88, (20), 9345-9349 (1991).
  20. Rashidi, B., et al. An orthotopic mouse model of remetastasis of human colon cancer liver metastasis. Clinical Cancer Research. 6, (6), 2556-2561 (2000).
  21. Fan, Z. C., et al. Real-time monitoring of rare circulating hepatocellular carcinoma cells in an orthotopic model by in vivo flow cytometry assesses resection on metastasis. Cancer Research. 72, (10), 2683-2691 (2012).
  22. Jacob, D., Davis, J., Fang, B. Xenograftictumor modelsinmiceforcancer research, atechnical review. Gene Therapy and Molecular Biology. 8, 213-219 (2004).
  23. Ahmed, S. U., et al. Generation of subcutaneous and intrahepatic human hepatocellular carcinoma xenografts in immunodeficient mice. Journal of Visualized Experiments. 25, (79), e50544 (2013).
  24. Kim, M., et al. Generation of humanized liver mouse model by transplant of patient-derived fresh human hepatocytes. Transplantation Proceedings. 46, (4), 1186-1190 (2014).
  25. Lavender, K. J., Messer, R. J., Race, B., Hasenkrug, K. J. Production of bone marrow, liver, thymus (BLT) humanized mice on the C57BL/6 Rag2(-/-)γc(-/-)CD47(-/-) background. Journal of Immunological Methods. 407, 127-134 (2014).
  26. Boll, H., et al. Micro-CT based experimental liver imaging using a nanoparticulate contrast agent: a longitudinal study in mice. PLoS One. 6, (9), e25692 (2011).
  27. Zhao, X., et al. Global gene expression profiling confirms the molecular fidelity of primary tumor-based orthotopic xenograft mouse models of medulloblastoma. Neuro-Oncology. 14, (5), 574-583 (2012).
  28. Rubio-Viqueira, B., et al. An in vivo platform for translational drug development in pancreatic cancer.Clinical. Cancer Research. 12, (15), 4652-4661 (2006).
  29. Siolas, D., Hannon, G. J. Patient-derived tumor xenografts: transforming clinical samples into mouse models. Cancer Research. 73, (17), 5315-5319 (2013).
  30. Alkema, N. G., et al. Biobanking of patient and patient-derived xenograft ovarian tumour tissue: efficient preservation with low and high fetal calf serum based methods. Scientific Reports. 6, (5), 14495 (2015).
Generering av en Liver Orthotopic Human uveal melanom Xenograft Platform i Immunodeficient mus
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kageyama, K., Ozaki, S., Sato, T. Generation of a Liver Orthotopic Human Uveal Melanoma Xenograft Platform in Immunodeficient Mice. J. Vis. Exp. (153), e59941, doi:10.3791/59941 (2019).More

Kageyama, K., Ozaki, S., Sato, T. Generation of a Liver Orthotopic Human Uveal Melanoma Xenograft Platform in Immunodeficient Mice. J. Vis. Exp. (153), e59941, doi:10.3791/59941 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter